新型乳腺脂肪移植技术可视化血管内皮干细胞的血管生成

摘要

这项工作展示了一种新的方法来评估通过乳腺脂肪移植移植血管内皮细胞（VESCs）的增殖，分化和血管形成潜力，然后进行全面的组织制备用于显微镜观察。还提出了研究VESCs 体内行为的谱系追踪策略。

摘要

内皮细胞（ECs）是血管结构的基本组成部分，并介导血管生长和重建，以确保适当的血管发育和体内平衡。然而，由于缺乏获取途径的工具以及直接评价其在体内的行为，对内皮谱系等级的研究仍然难以捉摸。为了解决这个缺点，已经开发了一种使用乳腺脂肪垫研究血管生成的新组织模型。乳腺主要发生在产后阶段，包括青春期和怀孕，在此期间，强壮的上皮细胞增殖伴随着广泛的血管重塑。乳腺脂肪垫从生长的乳腺上皮提供空间，基质和丰富的血管生成刺激。此外，乳腺脂肪垫位于腹腔外部，使得它们是用于评估外源性细胞的血管生成潜力的易于接近的移植部位。这项工作也描述了一种效率使用荧光报告小鼠在体内特异性标记血管内皮干细胞（VESCs）的目标群体的nt追踪方法。这种谱系追踪方法与随后的组织全固定显微镜相结合，能够直接观察目标细胞及其后代，从而可以量化扩增能力，分化承诺可以命运映射。使用这些方法，最近在多个血管系统中鉴定了表达VESCs的双能蛋白C受体（Procr）群体。 Procr ⁺ VESCs，引起新的EC和周细胞，积极促进血管生成发育，体内平衡和损伤修复。总的来说，这份手稿描述了一种新的乳腺脂肪移植和体内谱系追踪技术，可用于评估VESCs的干细胞特性。

引言

在发育和体内平衡过程中，根据器官生长和修复，血管生长和重塑真实地发生。血管生成描述了从先前存在的血管产生新血管，并被认为是介导这些动态血管变化的主要力量。每个血管内衬一层内皮细胞​​（ECs），它们似乎是血管结构的基础。长期以来，在稳态期间补充EC池的机制尚不清楚，并且提出血管周转是否是成熟的EC增殖的结果，还是血管干/祖细胞活性的贡献。由于缺乏直接的生理学证据，血管内皮细胞（VESCs）的存在和细胞同一性也是有争议的。

用于验证干细胞行为的最常用方法之一是通过transplan将推定的干细胞置于受体小鼠中。该方法测量候选干细胞在体内的干细胞潜能。移植首先应用于骨髓干细胞研究¹ ，有助于建立造血系统的分层特征² 。在内皮区域，皮下插入侧腹皮下的基底膜基质（ 例如，基质胶）栓塞已经是用于解决移植的ECs的血管形成能力的标准体内血管生成测定法。多种实验方法，包括在3D培养系统和移植的集落形成，都建议潜在EC祖细胞/ VESC群^{3，4，5，6。}然而，由于嵌入基底膜基质中的ECs相对分开周围组织，这不能提供充分探索移植细胞的血管生成潜力所需的最佳利基环境。结果，在矩阵塞内形成的血管主要是毛细血管样的，并且在功能上是不可测量的。

乳腺发育成熟，其中最强劲的生长发生在青春期和怀孕期间。在青春期阶段，乳腺上皮经历快速扩张，占据整个乳腺脂肪垫，伴随着周围血管结构的有效重塑。因此，乳腺为血管生成研究提供了极好的模型。它从生长的乳腺上皮提供空间，基质和丰富的血管生成刺激因素，因此是评估外源细胞血管生成潜力的理想的嫁接部位。此外，乳腺脂肪垫允许形成的外源血管与宿主循环系统整合，进一步促进f手术评估，代表皮下移植的优势。

虽然体外培养和移植测定作为研究细胞群的再生特性的有效方法，但是已知当细胞从其天然栖息地中取出时，这种测定可以刺激可塑性，并且当细胞从他们的生理环境⁷ 。因此，获得细胞命运的直接体内证据是推进目前对内皮细胞群体行为的理解的关键方法。

遗传命运映射（ 即，体内谱系追踪）对于鉴定VESCs和调查其在体系中的性质是至关重要的，因为它可以在其生理环境中揭示体内干细胞行为，并且实际的干性可以是评估。沿袭traci提供了候选VESCs的长期持续性（ 即自我更新）及其产生组织的细胞类型（ 即分化能力）的能力的直接证据。

该方案描述了一种新型乳腺脂肪移植技术和谱系追踪方法来观察VESCs的血管生成能力。这些技术克服了当前可用测定的缺点，并提供了一种新的方法来最佳评估VESCs的干细胞特性。这些方法是可用于评估内皮群体的行为和血管形成性质以及确定病理环境中的血管细胞效力改变的有效工具。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

实验程序由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所动物保护与使用委员会批准，经批准协议SIBCB-NAF-15-002-S335-003批准。

从小鼠乳腺中分离VESCs

1. 乳腺收获和组织消化。
   1. 使用8周龄的Actin-GFP成熟的原始记录小鼠，重量范围在20至25g之间，作为组织供体。
      注意:源自供体的细胞可以通过GFP表达轻易追踪。
   2. 在RPMI1640中制备由5％胎牛血清（FBS），1％pen / strep和25mM HEPES组成的组织消化基培养基。通过0.22μm过滤器过滤混合物，在水浴中灭菌并预热至37°C。
   3. 在CO ₂室中牺牲小鼠。通过首先制作垂直皮肤解剖第四对腹股沟乳腺使用手术刀（或手术剪刀）在下腹部中线切割。将皮肤轻轻剥去一侧，用镊子露出腹股沟乳腺。从两侧获得第四个腹股沟乳腺，并使用剪刀将其切成6厘米培养皿中的细小块。
      1. 测量切碎的组织的总重量并将其置于50mL管中。
         注意:确保每件产生的组织碎片尺寸小于1 mm ³ 。典型的产量是每只动物约5,000个VESCs。
   4. 以每1g组织切片以10 mL的体积在50 mL加盖的离心管中制备消化底物培养基。以每10毫升消化基培养基300个单位的浓度添加3型胶原酶，构成消化缓冲液。均匀混合，并将其加入组织切片。
   5. 将50 mL离心管水平放置在摇摆平台上，将速度设置为100 rpm，温度为37°C。激荡乳腺组织2 h。每20分钟检查并手动摇动管子，以确保正确消化。
      注意:FACS之前组织消化的目的是从固体组织制备单细胞溶液。因此，消化结束时，内容物应该是没有可见组织块的厚溶液。
2. 单细胞溶液制备。
   1. 消化后，用预先加热的无菌PBS将50mL离心管加满，并将试管均匀混合。以200×g离心管5分钟，得到细胞沉淀。
   2. 取出上清液，轻轻摇动管底部，松开细胞沉淀。加入3 mL红细胞裂解缓冲液（见材料表），并在组织培养箱中室温（RT）孵育5 min，以消除红细胞。
   3. 加入10mL无菌PBS，并将管反向混合均匀。将组织内容物以200 xg离心5分钟，然后离心上清。加入3mL预热的0.05％胰蛋白酶并将管储存在37℃5分钟以进一步消化剩余的组织。
   4. 加入3mL预热的IMDM，然后加入100μLDNA酶I溶液（0.25mg在1mL PBS中稀释的DNA酶I）。将管储存在37℃以分解DNA细丝。将组织混合物通过70μm的细胞过滤器以获得细胞溶液。用2 mL PBS + 5％FBS冲洗过滤器两次，以中和酶消化。
   5. 以200×g离心细胞混合物5分钟以沉淀细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL PBS + 5％FBS中进行抗体染色。
3. 基于FACS的Procr ⁺ VESC隔离。
   1. 将从供体乳腺组织获得的细胞混合物按公开的常规方案进行抗体染色⁸ 。
      注意:使用以下抗体:抗小鼠血清谱系FITC，抗小鼠CD31（PECAM1）-PECY7，抗小鼠CD105-APC（均以1μg/ mL浓度使用），抗小鼠CD201（Procr） - 生物素（浓度为2.5 μg/ mL）和链霉抗生物素-v450（以0.5μg/ mL的浓度使用）。
      1. 抗体染色后，用PBS + 5％FBS补充细胞，然后以200g离心5分钟。弃去上清液，并用1 mL PBS + 5％FBS重悬细胞。通过40μm的过滤器过滤。放在冰上直到FACS分选。
   2. 继续进行基于FACS的排序以分离Procr ⁺ VESCs。
      1. 分析未染色样品和每个单色控件以确定每种颜色的电压。计算补偿参数以避免自动荧光或背景染色。设置模板以进行适当的门控和排序，以获得所需的细胞群体。
      2. 建立FACS分类的层次结构，首先消除碎片所有事件，然后通过触发宽度丢弃双峰或粘合细胞簇。门出血谱系细胞，然后使用CD31 +和CD105 +来定义内皮细胞群。
         注意:与FMO对照相比，从CD31 + CD105 + ECs分离出Procr +细胞。代表性的FACS分析图如图1所示。 FACS分离的VESC群体应暂停在IMDM + 50％FBS中并储存在冰上直到进一步处理。

2.使用乳腺脂肪垫进行体内 VESC血管形成测定

1. 准备移植的主要ECs。
   1. 用10mL PBS + 5％FBS补充FACS分选的细胞，然后以200xg离心5分钟以将细胞沉降到底部。
   2. 仔细吸取液体，使用血细胞计数器计数细胞数，并用基底膜基质混合物重悬细胞沉淀50％基底膜基质和含有20％FBS的PBS，补充有100ng / mL rmVEGF和60U / mL肝素）达到15,000个细胞/15μL的工作浓度。
      注意:基底膜基质混合物应始终存放在冰上。
   3. 连续稀释分选和计数的细胞，以达到1.5 mL微量管中所需的输入浓度，确保最终注射体积总计不超过15μL。在每个管中加入0.1％台盼蓝，以便在移植过程中更好地显示内容。彻底移液以混合。将管存放在冰上直到使用。
      注意:可以使用至少100个VESCs来实现成功的血管生成。
2. 移植原发性ECs到乳腺脂肪垫。
   1. 消毒手术器械和台面。如果在多只动物上使用相同的仪器，则可以使用珠灭菌器进行消毒。
   2. 麻醉3周龄的BALB / c裸麦克风e通过使用您机构的兽医和IACUC推荐的麻醉方案。将每只老鼠放在仰卧位，将其放回手术台上。用胶带固定肢体。
   3. 将棉签浸入碘基杀菌溶液中。彻底擦拭鼠标的整个腹部区域，对手术前的皮肤表面进行消毒。
   4. 用镊子握住并抬起鼠标的腹部皮肤。使用外科手术刀做一个小的，1厘米的垂直切口。做两个大约0.5 - 1厘米长的切口，每个朝向后腿，以实现倒置的Y形切口。
      1. 使用镊子和棉签轻轻地将皮肤从腹部分开，并将皮肤侧向穿过以暴露腹股沟乳腺。将鼠标放在立体镜下，并将放大倍数设置为2.0倍。确保调整焦点，使乳腺脂肪垫可以清晰地看到并操作。
   5. 放置一个27G 1/2"需要在冰上预冷。预先用基底膜基质混合物注入1-mL注射器以除去捕获在针附着区域中的可能的气泡。将15μL混合溶液吸出到微量离心管的盖上，然后将整个体积吸入注射针头的注射器中。
   6. 握住乳腺脂肪垫在腹股沟淋巴结前面，使用细镊子，轻轻抬起以方便注射。将大约1/4的注射针插入脂肪垫。
      1. 从垫子上释放镊子，抓住并稳定注射针。缓慢注入溶液以防止液体渗漏。保持几秒钟，以确保细胞混合物固化，以尽量减少拔出针头时的渗漏。
   7. 用可吸收的缝合线关闭皮瓣。使用5-0非反应性单丝缝合缝合皮瓣，并用外科医生式结结封闭伤口，每个结近似相距0.3厘米。或者，用伤口缝合物关闭皮肤。
   8. 将操作的小鼠放在单独的笼子中以进行恢复。将加热灯放在笼子上，以防止麻醉老鼠遭受低体温。将软纸和棉布放在笼子的底部，以保持老鼠在手术后温暖。
      1. 仔细观察小鼠，直到所有受试者完全清醒。在接下来的几天里，先将手术后止痛药应用于所有动物或按照设施兽医的指示。如果发生伤口感染，按照批准的动物方案应用抗生素。如果手术伤口用伤口钉关闭，则在手术后10天，当伤口完全关闭时，取下伤口夹。

3.全套组织准备用于显微镜观察

1. 组织收获
   1. 在植入后2-4周麻醉接受者BALB / c腹膜内注射2.5％麻醉剂的裸鼠，其剂量为每20g体重0.12mL，如步骤2.2.2所示。
      注意:细胞移植后2〜4周可检测到阳性血管生长。
   2. 用50μL/ 25g体重的尾静脉注射isolectin-647染料标记受体全身循环，重悬于50μL无菌PBS中。允许5 - 10分钟的休息时间。用CO ₂牺牲小鼠。
   3. 在步骤2.2.4之后解剖最初注射细胞的乳腺组织区域;使用手术剪刀。使用手术刀片，将组织切成6厘米培养皿中的大约3至4毫米³立方体。
2. 组织消化和抗体染色制备。
   1. 在装有10mL预先加热的消化基础培养基（步骤1.1.2）的15mL离心管中摘取组织片，补充有胶原酶III（300U / 10mL）。
   2. 将15 mL离心管水平放置在摆动平台上，速度设置为100 rpm，温度设置为37°C约1 h，松开组织结构并除去过多的脂肪细胞组织。
      注意:脂肪细胞倾向于产生自发荧光，这可能导致嘈杂的荧光背景。消化结束时，组织块应具有柔软，多云的外观。最佳消化时间取决于切碎的组织块的大小，因此应相应调整以获得最佳结果。由于组织脉管系统已经用荧光标记的Isolectin标记，因此所有以下程序都应进行防护。
   3. 在室温下用PBS洗涤组织片10分钟。通过小心地将片放置在6厘米培养皿中，用4％PFA（pH 7.2 - 7.4）将其全部固定，以保持荧光。放置培养皿在摇摆平台上轻轻搅拌组织30分钟。
      注意:PFA是致癌物质，应谨慎处理。
   4. 取出剩余的PFA并用全固定洗涤缓冲液（PBS中0.1％吐温）洗涤固定组织三次，每次洗涤间隔10分钟。
3. 全身组织抗体染色。
   1. 在2 mL离心管中稀释抗体染色缓冲液中的一抗。在4℃下将组织与初级抗体孵育过夜。
      注意:使用大鼠抗CD31（浓度:10μg/ mL）或大鼠抗VE-钙粘蛋白（CD144 / Cdh5;浓度:2.5μg/ mL）作为一抗。 CD31和VE-Cadherin都是用于识别内皮的细胞表面标记物。用500mM马来酸pH7.5制备5x抗体染色缓冲液; 750mM NaCl;和0.5％（v / v）吐温溶于PBS。在制备新鲜的1x工作溶液时，只加入适当的血清体积（5％）⁹ 。
   2. 取出抗体染色缓冲液，用洗涤缓冲液以10分钟的间隔洗涤整体组织三次。使用二级抗体（参见材料表 ）加上DAPI在摇床平台上培养4小时或在4℃过夜孵育组织。
      注意:使用最终浓度为5μg/ mL的DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）来显现核。
   3. 用洗涤缓冲液洗涤整个安装的组织3次，每次10分钟。将组织块在80％甘油或80％蔗糖中孵育过夜，使组织脱水以更好地保存。
   4. 将各个组织片放在玻璃载玻片上，并除去过量的脱水缓冲液。用安装介质覆盖组织，放置盖玻片，轻轻挤压组织进行设置。
   5. 进行共聚焦显微镜图像采集。对于整体乳腺，采用40％的NA = 1.3石油对象获取图像五个。以1,024×1,024的光学分辨率和1.0-1.2μm的层间距获取Z-叠层的平铺扫描。
      注意:为了捕获正确的荧光信号，滤波器分束器应设置为三分频（TD）488/553/638，增益设置为PMT增益600-800。应使用以下激发/发射源:mGFP，激发/发射最大值为488/509 nm;激发/发射最大值为532/588 nm的mTomato; Alexa-647，激发/发射最大值为594/665;和DAPI，激发/发射最大值为350/470。

使用遗传修饰的鼠标模型进行谱系追踪

1. 使用鼠标模型检测Procr ⁺ VESCs。
   1. 使用Procr ^{CreERT2-IRES-tdTomato / +} （简称Procr ^CreERT2 ）敲入小鼠毒株。
      注意:在这个鼠标模型中，一个CreERT2-IRES-tdTomato磁带Procr ¹¹的第一个ATG密码子之后插入up class ="xref"> 10。
      1. 交叉Procr ^CreERT2小鼠与Rosa26 ^mTtomatomGFP （简称R26 ^mTmG ）报道菌株，以追踪体内内源性Procr + ECs的命运¹¹ 。使用GFP表达鉴定所有标记的内源性Procr ⁺ ECs及其后代。
   2. 在青春期阶段（5周）以4mg / 25g体重的剂量腹膜内给予他莫昔芬溶液¹¹ （10mg溶于1mL花生油+ 10％乙醇中的10mg乙醇以制备10mg / mL的储备溶液）旧）跟踪Procr + ECs的发展命运。
   3. 通过在步骤3中概述的制备步骤后，通过全套免疫染色分析标记细胞的克隆形成效率。在短期后从处理的小鼠获得乳腺脂肪垫（2天）和延长的时间段（最多10个月）。参见图3 。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

乳腺VESCs分离:

为了分离内皮细胞以进行随后的移植测定，收获成熟（8周龄）的原始小鼠乳腺作为供体材料。使用基于抗体的细胞分选技术分离内皮细胞。在8周龄的C57BL / 6乳腺EC中，VESC群体的FACS分析的代表性图示于图1 （图中已经允许从Yu 等 ⁸获得）。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

血管生成测定法是研究血管动力学的一个很好的实验方法。已经被证明是研究血管生成的有吸引力的模型¹² ，鼠后视网膜脉管系统。尽管它相对易于使用，但在视网膜血管床内的实际操作是相当困难的。到目前为止，最佳描述的体内移植是插塞测定法，其将细胞包围在基底膜基质块内，并在接受者小鼠的侧翼皮下手术植入/注射。这种血管生成测定在测试嵌入细胞的再生潜...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1x)	Gibco (Life Technologies)	25300-062	0.05% Trypsin
0.22 µm Filter Unit	Merck Millipore Ltd.	SLGP033RB	0.22 µm Filter
2-Methylbutanol-2, ReagentPlus	Sigma-Aldrich	24, 048-6	Tert Amyl Alcohol
222, Tribromethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25g	222, Tribromethanol
4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)	Invitrogen	D1306	DAPI
70 µm Cell Strainer	BD FAL	352350	70 µm Cell Strainer
Adhesion Microscope Slides	CITOGLAS	188105	Glass slides
Anti-mouse CD105 APC	eBioscience	17-1051-82, clone MJ7/18	for FACS analusis use at 1 µg/mL
Anti-mouse CD201 Biotin	eBioscience	13-2012-82	for FACS analusis use at 2.5 µg/mL
Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7	eBioscience	25-0311-82, clone 390	for FACS analusis use at 1 µg/mL
BD FACSJazz Cell Sorter	BD Biosciences	655489	FACS
Bovine Serum Albumin	Sigma	100190332	BSA
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Centrifuge
Collagenase type 3	Worthington-Biochem	#LS004183	Collagenase III
Confocal microscopy	Leica	sp8	Confocal
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma	D2463-5VL	Dnase I
Donkey anti-Rat Cy3	Jackson ImmunResearch	712-165-150	Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL
Dumont Forceps	WPI	500342	Froceps
Dumont Forceps - Micro-Blunted Tips	FST	11253-20	Forceps
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	FBS
FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119	BioLegend	78022	Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µL per test
Glycerol	Sigma	G6279	Glycerol
Iscov's Modified Dulbecco's Medium	Gibco (Life Technologies)	12440-053	IMDM
Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora  647	Invitrogen	Z32450	Isolectin-647
Matrigel  Matrix (growth factor reduced)	BD	356231	Matrigel
Mouse strain (Actin-GFP)	Jax Laboratories	3773	Actin-GFP
Mouse strain (C57BL/6)	SLAC	C57BL/6	C57BL/6
Mouse strain  (BALB/c nude)	SLAC	BALB/c nude	Nude mice
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	PFA
Penicilin Streptomycin	Gibco (Life Technologies)	5140-122	Pen/Strep
Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x	Gibco (Life Technologies)	c20012500BT	PBS
PRIM1640	Gibco (Life Technologies)	c11875500CP	PRIM1640
ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36934	Mounting Medium
Rat anti CD144	BD Biosciences	550548	for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL
Rat anti CD31-biotin	BD Biosciences	553371	for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 µg/mL
Red Cell Lysis Buffer	Sigma	R7767-100ML	Red blood cell lysing buffer
Straight/Sharp-Blunt/10cm	FST	14028-10	Fine Scissors
Streptavidin eFluor 450	eBioscience	48-4317-82	for FACS analysis use at 0.5 µg/mL
Tamoxifen	Sigma	101551374	TAM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-250ML	TritonX
Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle)	COVIDIEN	S1173	Suture
Sterile Disposable Scaplels	Swann Morton	#10	Scalpel
Betadine	Yifeng Medical	20160101	Antiseptic solution