Eine neuartige Mamma-Fat-Pad-Transplantationstechnik zur Visualisierung der Gefäßerzeugung von vaskulären endothelialen Stammzellen

Zusammenfassung

Diese Arbeit zeigt einen neuartigen Ansatz zur Bewertung der Proliferations-, Differenzierungs- und Gefäßbildungspotenziale vaskulärer endothelialer Stammzellen (VESCs) durch Mamma-Fett-Pad-Transplantation, gefolgt von einer ganzheitlichen Gewebepräparation für die mikroskopische Beobachtung. Eine Abstammungsstrategie zur Untersuchung des Verhaltens von VESCs in vivo wird ebenfalls vorgestellt.

Zusammenfassung

Endothelzellen (ECs) sind die grundlegenden Bausteine ​​der Gefäßarchitektur und vermitteln das vaskuläre Wachstum und die Umgestaltung, um eine ordnungsgemäße Gefäßentwicklung und Homöostase zu gewährleisten. Allerdings bleiben Studien über die endotheliale Linienhierarchie aufgrund des Mangels an Instrumenten, um Zugang zu erhalten, sowie um ihr Verhalten in vivo direkt zu bewerten. Um dieses Manko anzusprechen, wurde ein neues Gewebemodell entwickelt, um die Angiogenese mit dem Brustfettkissen zu untersuchen. Die Milchdrüse entwickelt sich vor allem in den postnatalen Stadien, einschließlich der Pubertät und der Schwangerschaft, bei denen eine robuste Epithelproliferation von einer umfangreichen vaskulären Remodellierung begleitet wird. Mamma-Fett-Pads bieten Raum, Matrix und reiche angiogene Reize aus dem wachsenden Mamma-Epithel. Darüber hinaus befinden sich Mamma-Fett-Pads außerhalb der Peritonealhöhle, so dass sie eine leicht zugängliche Pfropfstelle für die Beurteilung des angiogenen Potentials exogener Zellen sind. Diese Arbeit beschreibt auch eine EffizienzNt-Tracing-Ansatz mit fluoreszierenden Reporter-Mäusen, um die Zielpopulation von vaskulären endothelialen Stammzellen (VESCs) in vivo spezifisch zu markieren. Diese Linienverfolgungsmethode, gepaart mit der nachfolgenden Gewebe-Vollmontage-Mikroskopie, ermöglicht die direkte Visualisierung von zielgerichteten Zellen und deren Nachkommen, durch die die Proliferationsfähigkeit quantifiziert werden kann und die Differenzierungsverpflichtung schicksaliert werden kann. Unter Verwendung dieser Verfahren wurde eine Population von Bipotenten-Protein-C-Rezeptor (Procr), die VESCs exprimieren, kürzlich in multiplen Gefßsystemen identifiziert worden. Procr ⁺ VESCs, die sowohl neue ECs als auch Perizyten verursachen, tragen aktiv zur Angiogenese bei der Entwicklung, Homöostase und Verletzungsreparatur bei. Insgesamt beschreibt dieses Manuskript eine neue Mamma-Fett-Pad-Transplantation und In-vivo- Lineage-Tracing-Techniken, die verwendet werden können, um die Stammzellen-Eigenschaften von VESCs zu bewerten.

Einleitung

Während der Entwicklung und Homöostase findet das Gefäßwachstum und die Umgestaltung nach Organwachstum und -reparatur statt. Die Angiogenese beschreibt die Erzeugung neuer Gefäße aus bereits vorhandenen Blutgefäßen und wird als eine wichtige Kraft angesehen, die diese dynamischen vaskulären Veränderungen vermittelt. Jedes Blutgefäß ist mit einer Schicht von Endothelzellen (ECs) innerlich ausgekleidet, und sie scheinen die Grundlage der Gefäßarchitektur zu sein. Der Mechanismus, durch den der EC-Pool während der Homöostase aufgefüllt wird, blieb lange Zeit unklar, und es wurden Argumente erhoben, ob der Gefäßumsatz das Ergebnis einer reifen EG-Proliferation ist oder der Beitrag der vaskulären Stamm- / Vorläuferzellaktivitäten ist. Aufgrund des Mangels an direkten physiologischen Beweisen blieb die Existenz und die zelluläre Identität der vaskulären endothelialen Stammzellen (VESCs) ebenfalls umstritten.

Eine der häufigsten Ansätze zur Verifizierung des Stammzellverhaltens ist durch den TransplanTaten von putativen Stammzellen in Empfängermäusen. Diese Methode misst das Stemnesspotential der Kandidatenstammzellen in vivo. Die Transplantation wurde zuerst auf die Untersuchung von Knochenmarkstammzellen ¹ angewendet, die zur Etablierung der hierarchischen Eigenschaften des hämatopoetischen Systems ² beigetragen haben. Im endothelialen Feld wurde ein unterhalb der Flankenhaut subkutan eingelegter Basalmembranmatrix ( z. B. Matrigel) -Stift ein Standard- In-vivo- Angiogenese-Assay, der verwendet wurde, um die Gefäßbildungsfähigkeiten von transplantierten ECs zu adressieren. Mehrere experimentelle Methoden, einschließlich Koloniebildung in 3D-Kultursystemen und Transplantation, haben potenzielle EC-Progenitor- / VESC-Populationen ^{3 , 4 , 5 , 6 vorgeschlagen} . Da jedoch ECs, die in die Basalmembranmatrix eingebettet sind, relativ getrennt sindDas umliegende Gewebe, bietet dies nicht die optimale Nischenumgebung, die erforderlich ist, um das angiogenetische Potential von transplantierten Zellen vollständig zu erforschen. Infolgedessen sind die im Matrixstecker gebildeten Gefäße überwiegend kapillarartig und funktionell unermesslich.

Die Brustdrüse entwickelt sich postnatal, wobei das robusteste Wachstum während der Pubertät und Schwangerschaft auftritt. Im Pubertalstadium erleidet das Mammaepithel eine rasche Expansion, um das ganze Brustfettkissen zu besetzen, begleitet von der effizienten Umgestaltung der umgebenden Gefäßstrukturen. So bietet die Brustdrüse ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Angiogenese. Es bietet Raum, Matrix und reiche angiogene Reize aus dem wachsenden Mammaepithel und ist daher eine ideale Pfropfstelle für die Beurteilung des angiogenen Potentials exogener Zellen. Darüber hinaus ermöglicht das Brustfett-Pad die geformten exogenen Gefäße mit dem Wirtszirkulationssystem zu integrieren, so dass weitere fUnreduzierte Bewertung und einen Vorteil gegenüber der subkutanen Transplantation darstellen.

Obwohl in vitro Kultivierungs- und Transplantationsassays als wirksame Methode zur Untersuchung der Regenerationseigenschaften einer Zellpopulation sind, ist es bekannt, dass solche Assays die Plastizität stimulieren können, wenn die Zellen von ihren nativen Lebensräumen entfernt werden, und Veränderungen können induziert werden, wenn Zellen von der Verbindung getrennt werden Ihre physiologische Umgebung ⁷ . Daher ist die Erlangung eines direkten In-vivo- Nachweises des Zellschicksals der Schlüsselansatz, um das gegenwärtige Verständnis des Verhaltens der endothelialen Populationen voranzutreiben.

Die genetische Schicksalskartierung ( dh in vivo- Linienverfolgung) ist für die Identifizierung von VESCs und für die Untersuchung ihrer Eigenschaften im Körpersystem zwingend erforderlich, da sie in ihrem physiologischen Kontext in vivo Stammzellenverhalten offenbaren kann und die eigentliche Stämme sein können Beurteilt Lineage traciNg liefert einen direkten Beweis für die langfristige Persistenz ( dh die Selbsterneuerung) der Kandidaten-VESCs und ihre Fähigkeit, Zelltypen für das Ursprungsgewebe ( dh Differenzierungspotenz) zu erzeugen.

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Mamma-Fett-Pad-Transplantationstechnik und eine Lineage-Tracing-Methode, um die Gefäßerzeugungsfähigkeit von VESCs zu beobachten. Diese Techniken überwinden Mängel der derzeit verfügbaren Assays und bieten einen neuen Weg, um die Stammzelleneigenschaften von VESCs optimal zu bewerten. Diese Ansätze sind effiziente Werkzeuge, die verwendet werden können, um das Verhalten und die Gefäßformung von endothelialen Populationen zu beurteilen sowie die vaskuläre Zellpotenzveränderung innerhalb einer pathologischen Umgebung zu bestimmen.

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Protokoll

Experimentelle Verfahren wurden vom Tierpflege- und -nutzungsausschuss des Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, unter dem genehmigten Protokoll SIBCB-NAF-15-002-S335-003 genehmigt.

1. Isolierung von VESCs aus der Maus Mammadrüse

1. Mammadrüse Ernte und Gewebe Verdauung.
   1. Verwenden Sie 8 Wochen alten Actin-GFP reifen Jungfrau Reporter Mäuse, mit Gewichten Bereich zwischen 20 und 25 g, als Gewebe Spender.
      Hinweis: Zellen, die aus dem Spender stammen, können durch GFP-Expression leicht verfolgt werden.
   2. Vorbereitung des Gewebeverdauungsbasismediums, bestehend aus 5% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Pen / Strep und 25 mM HEPES in RPMI1640. Filtriere die Mischung durch einen 0,22 μm Filter zum Sterilisieren und Vorwärmen auf 37 ° C in einem Wasserbad.
   3. Opfer die Mäuse in einer CO ₂ -Kammer. Zerlegen Sie das vierte Paar von Leisten-Brustdrüsen, indem Sie zuerst eine vertikale Haut machenNcision an der unteren abdominalen Mittellinie mit einem Skalpell (oder chirurgische Schere). Die Haut vorsichtig auf eine Seite schälen, um die Leisten-Brustdrüse mit einer Pinzette freizulegen. Erhalten Sie die vierten Leistendrüsendrüsen von beiden Seiten und schneiden Sie sie in feine Stücke in einer 6 cm Petrischale mit Schere.
      1. Messen Sie das Gesamtgewicht des gehackten Gewebes und legen Sie es in ein 50 ml Röhrchen.
         Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die resultierende Gewebe-Hackfleisch kleiner als 1 mm ³ in der Größe für jedes Stück ist. Eine typische Ausbeute beträgt etwa 5.000 VESCs pro Tier.
   4. Bereiten Sie das Verdauungsbasismedium in einem 50-ml-Capped-Zentrifugenröhrchen mit einem Volumen von 10 ml pro 1 g Gewebehackfleisch vor. Füge Kollagenase Typ 3 bei einer Konzentration von 300 Einheiten pro 10 ml Verdauungsgrundmedium hinzu, um den Verdauungspuffer zu bilden. Mischen Sie gleichmäßig und fügen Sie es dem Gewebe Hackfleisch hinzu.
   5. Stellen Sie das 50-ml-Zentrifugenröhrchen waagerecht auf eine Schaukelplattform und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 100 U / min und die Temperatur auf 37 ° C ein. RührenDas Milchgewebe für 2 h. Überprüfen und manuell schütteln Sie die Tube alle 20 min, um eine ordnungsgemäße Verdauung zu gewährleisten.
      Anmerkung: Der Zweck der Gewebeverdauung vor FACS besteht darin, eine Einzelzelllösung aus festem Gewebe herzustellen. Daher sollte der Inhalt bis zum Ende der Verdauung eine dicke Lösung ohne sichtbare Gewebestücke sein.
2. Einzellige Lösungsvorbereitung.
   1. Nach der Verdauung das 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit vorgewärmtem, sterilem PBS auffüllen und das Röhrchen zur gleichmäßigen Vermischung umkehren. Das Röhrchen wird bei 200 xg für 5 min zentrifugiert, um ein Zellpellet zu erhalten.
   2. Entfernen Sie den Überstand und schlagen Sie den Boden des Tubus, um das Zellpellet zu lösen. Fügen Sie in 3 ml roter Blutzell lysieren Puffer (siehe die Tabelle der Materialien) und inkubieren in einer Gewebekultur Haube bei Raumtemperatur (RT) für 5 min, um die roten Blutkörperchen zu beseitigen.
   3. 10 ml steriles PBS zugeben und das Röhrchen gleichmäßig mischen. Zentrifugieren Sie den Gewebegehalt bei 200 xg für 5 min und ScheibeDer Überstand. In 3 ml vorgewärmtes 0,05% Trypsin geben und das Röhrchen bei 37 ° C für 5 min aufbewahren, um das verbleibende Gewebe weiter zu verdauen.
   4. In 3 ml vorgewärmtes IMDM geben und dann 100 μl DNase I-Lösung (0,25 mg DNase I, verdünnt in 1 ml PBS) zugeben. Das Röhrchen bei 37 ° C aufbewahren, um die DNA-Filamente aufzubrechen. Führen Sie die Gewegemischung durch einen 70 μm Zellsieb, um die Zelllösung zu erhalten. Spülen Sie das Sieb zweimal mit 2 ml PBS + 5% FBS, um die enzymatische Verdauung zu neutralisieren.
   5. Die Zellmischung bei 200 xg für 5 min zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet in 1 ml PBS + 5% FBS zur Antikörperfärbung resuspendieren.
3. FACS-basierte Procr ⁺ VESC-Isolation.
   1. Betrachten Sie die Zellmischung, die aus Spender-Mamma-Gewebe erhalten wurde, zur Antikörper-Färbung nach veröffentlichten Routine-Protokollen ⁸ .
      Anmerkung: Die folgenden Antikörper wurden verwendet: anti-MausBlut-Linie-FITC, anti-Maus CD31 (PECAM1) -PECY7, anti-Maus CD105-APC (alle verwendet bei einer Konzentration von 1 μg / ml), anti-Maus CD201 (Procr) -biotin (bei einer Konzentration von 2,5 verwendet Μg / ml) und Streptavidin-v450 (bei einer Konzentration von 0,5 μg / ml) verwendet.
      1. Nach der Antikörperfärbung die Zellen mit PBS + 5% FBS auffüllen und dann bei 200 g für 5 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit 1 ml PBS + 5% FBS. Filter durch einen 40 μm Zellsieb. Platz auf Eis bis FACS Sortierung.
   2. Führen Sie die FACS-basierte Sortierung aus, um Procr ⁺ VESCs zu isolieren.
      1. Analysieren Sie die ungefärbte Probe und jede einfarbige Kontrolle, um die Spannung für jede Farbe zu bestimmen. Berechnen Sie die Kompensationsparameter, um Auto-Fluoreszenz- oder Hintergrundfärbung zu vermeiden. Richten Sie die Vorlage für die richtige Gating und Sortierung für die gewünschten Zellpopulationen ein.
      2. Um die Hierarchie der FACS-Sortierung zu etablieren, beseitigen Sie zuerst Schutt vonAlle Ereignisse und verwerfen dann Dubletts oder Klebstoffcluster durch Auslösung mit Breite. Gate-out Blutlinie-Zellen und dann verwenden CD31 + und CD105 +, um die endothelial Populationen zu definieren.
         Anmerkung: Procr + Zellen wurden aus CD31 + CD105 + ECs im Vergleich zu einer FMO-Kontrolle isoliert. Eine repräsentative FACS-Analysekurve ist in 1 gezeigt . Eine FACS-isolierte VESC-Population sollte in IMDM + 50% FBS suspendiert und bis zur Weiterverarbeitung auf Eis gelagert werden.

2. In vivo VESC-Schiffsbildungs-Assay mit dem Mamma-Fett-Pad

1. Primäre ECs für die Transplantation vorbereiten.
   1. Die FACS-sortierten Zellen mit 10 ml PBS + 5% FBS auffüllen und dann bei 200 xg für 5 min zentrifugieren, um die Zellen bis zum Boden zu säubern.
   2. Die Flüssigkeit sorgfältig einatmen, die Zellzahl mit einem Hämocytometer zerlegen und das Zellpellet mit der Basalmembranmatrixmischung resuspendieren (consiStachel von 50% Basalmembranmatrix und PBS mit 20% FBS, ergänzt mit 100 ng / mL rmVEGF und 60 U / ml Heparin), um eine Arbeitskonzentration von 15.000 Zellen / 15 μl zu erreichen.
      Hinweis: Die Basismembranmatrixmischung sollte immer auf Eis gelagert werden.
   3. Seriell verdünnen die sortierten und gezählten Zellen, um die erforderlichen Eingangskonzentrationen in einem 1,5-ml-Mikroröhrchen zu erreichen, wobei sichergestellt wird, dass die endgültigen Einspritzvolumina insgesamt 15 μl nicht überschreiten. Füge 0,1% Trypanblau zu jeder Röhre für eine bessere Inhaltsvisualisierung während der Transplantation hinzu. Pipette gründlich mischen. Die Röhrchen bis zum Gebrauch auf Eis aufbewahren.
      Hinweis: Eine erfolgreiche Schiffsgenerierung konnte mit mindestens 100 VESC erreicht werden.
2. Transplantation primäre ECs auf die Brust-Fett-Pad.
   1. Desinfizieren Sie die chirurgischen Instrumente und Tisch. Bei Verwendung der gleichen Instrumente bei mehreren Tieren kann ein Wulststerilzer zur Desinfektion verwendet werden.
   2. Anästhesieren Sie das 3-wöchige BALB / c-Nude-MikrofonE unter Verwendung des Anästhesieprotokolls, das von Ihrem Tierarzt und IACUC empfohlen wird. Lege jede Maus in Rückenlage, mit dem Rücken auf der Operationstabelle. Immobilisieren Sie die Gliedmaßen mit Klebeband.
   3. Dip ein Wattestäbchen in Iod-basierte antiseptische Lösung. Wischen Sie den gesamten Bauchbereich der Maus gründlich ab, um die Hautoberfläche vor der Operation zu sterilisieren.
   4. Halten Sie und heben Sie die Bauchhaut der Maus mit Pinzette an. Verwenden Sie ein chirurgisches Skalpell, um einen kleinen, 1 cm vertikalen Schnitt zu machen. Machen Sie zwei Schnitte von etwa 0,5 - 1 cm Länge, jeweils in Richtung Hinterbein, um einen umgedrehten, Y-förmigen Schnitt zu erzielen.
      1. Verwenden Sie Pinzette und ein Wattestäbchen, um die Haut vorsichtig vom Bauch zu trennen und die Haut seitlich zu stecken, um die Leisten-Mamidrüsen zu entlarven. Legen Sie die Maus unter ein Stereoskop und stellen Sie die Vergrößerung auf 2.0X. Achten Sie darauf, den Fokus so einzustellen, dass das Mamma-Fett-Pad deutlich sichtbar und betrieben werden kann.
   5. Legen Sie eine 27G 1/2 "needlE auf Eis vorkühlen. Prime eine 1-ml-Spritze mit Basalmembran-Matrix-Mischung im Voraus, um mögliche Luftblasen zu entfernen, die in der Nadel-Befestigungsregion gefangen sind. 15 μl gemischte Lösung auf die Kappe des Mikrozentrifugenröhrchens pipettieren und dann das gesamte Volumen in die grundierte Spritze absaugen.
   6. Halten Sie das Mamma-Fett-Pad vor dem Leisten-Lymphknoten, mit feinen Pinzetten, und heben Sie es leicht für eine einfache Injektion. Setzen Sie etwa 1/4 der Spritze Nadel sanft in die Fett-Pad.
      1. Lösen Sie die Pinzette aus dem Fad-Pad, um die Spritzen-Nadel zu greifen und zu stabilisieren. Die Lösung langsam einspritzen, um Flüssigkeitsleck zu vermeiden. Halten Sie für ein paar Sekunden, um sicherzustellen, dass die Zellmischung verfestigt wird, um die Leckage beim Herausziehen der Nadel zu minimieren.
   7. Schließen Sie die Hautklappe mit resorbierbaren Nähten. Naht die Hautklappe mit der Größe 5-0 nicht reaktive Monofilament Naht und schließen Sie die Wunden mit einem Chirurgen-Stil Knoten, jeder Knoten approximCa. 0,3 cm auseinander. Alternativ schließen Sie die Haut mit Wundheftklammern.
   8. Legen Sie betriebene Mäuse in einen separaten Käfig zur Verwertung. Legen Sie eine Heizlampe über den Käfig, um zu verhindern, dass die anästhesierten Mäuse an einer Hypothermie leiden. Legen Sie weiches Papier und Baumwolle an der Unterseite des Käfigs, um die Mäuse warm nach der Operation zu halten.
      1. Beobachten Sie die Mäuse sorgfältig, bis alle Empfänger ganz wach sind. Für die nächsten Tage gelten postoperative Analgetika präventiv für alle Tiere oder wie vom Tierarzt geleitet. Anwenden von Antibiotika nach dem zugelassenen Tierprotokoll, wenn eine Wundinfektion auftritt. Wenn die chirurgische Wunde mit Wundheftklammern verschlossen wurde, entfernen Sie die Wundclips 10 Tage nach der Operation, wenn die Wunde vollständig geschlossen ist.

3. Vollständige Gewebevorbereitung für die mikroskopische Beobachtung

1. Gewebeernte
   1. Bei 2 - 4 Wochen nach der Implantation den Empfänger BALB / c anästhesierenNacktmäusen mit einer intraperitonealen Injektion von 2,5% Anästhesierungsmittel in einer Dosierung von 0,12 ml pro 20 g Körpergewicht, wie in Schritt 2.2.2.
      Anmerkung: Das positive Gefäßwachstum kann 2 - 4 Wochen nach der Zelltransplantation nachgewiesen werden.
   2. Markieren Sie die systemische Zirkulation des Empfängers mit einer Schwanzveneninjektion von Isolectin-647-Farbstoff bei einer Dosierung von 50 μg / 25 g Körpergewicht, resuspendiert in 50 μl sterilem PBS. Erlaube eine Ruhezeit von 5 - 10 min. Opfer die Mäuse mit CO ₂ .
   3. Den Bereich des Brustgewebes herausziehen, wo die Zellen zunächst nach Schritt 2.2.4 injiziert wurden; Chirurgische Schere benutzen. Mit einer chirurgischen Klinge das Gewebe in etwa 3 bis 4 mm ³ Würfel in einer 6-cm-Petrischale schneiden.
2. Gewebeverdauung und Vorbereitung auf Antikörperfärbung.
   1. Die Gewebestücke in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen, verdünnt mit 10 ml vorgewärmtem Verdauungsgrundmedium (Schritt 1.1.2), ergänzt mit Kollagenase III, verdauen(300 U pro 10 ml).
   2. Legen Sie das 15-ml-Zentrifugenröhrchen waagerecht auf eine Kippplattform, wobei die Geschwindigkeit auf 100 U / min eingestellt ist und die Temperatur für ca. 1 h auf 37 ° C eingestellt ist, um die Gewebestruktur zu lösen und übermäßiges Adipozytengewebe zu entfernen.
      Anmerkung: Adipozyten neigen dazu, Auto-Fluoreszenz zu produzieren, die zu einem lärmenden fluoreszierenden Hintergrund führen könnte. Am Ende der Verdauung sollten die Gewebeteile ein weiches, bewölktes Aussehen haben. Die optimale Verdauungsperiode hängt von der Größe der gehackten Gewebestücke ab und sollte daher entsprechend angepasst werden, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Da die Gewebevaskulatur bereits mit fluoreszenzmarkiertem Isolectin markiert wurde, sollten alle nachfolgenden Verfahren vor Licht geschützt werden.
   3. Die Gewebestücke mit PBS bei RT für 10 min waschen. Fixieren Sie das Ganzband-Gewebe sorgfältig, indem Sie die Stücke sorgfältig in eine 6-cm-Petrischale halb voll mit 4% PFA (pH 7,2 - 7,4) platzieren, um die Fluoreszenz zu erhalten. Legen Sie die PetrischaleAuf einer Schaukelplattform und sanft das Gewebe für 30 min bei RT rühren.
      Hinweis: PFA ist krebserzeugend und sollte mit Vorsicht behandelt werden.
   4. Entfernen Sie die verbleibende PFA und waschen Sie das feste Gewebe dreimal mit Ganzputz-Waschpuffer (0,1% Tween in PBS), mit einem 10-minütigen Intervall zwischen jeder Wäsche.
3. Vollständige Gewebe-Antikörper-Färbung.
   1. Verdünnen Sie den primären Antikörper in Antikörper-Färbepuffer in einem 2-ml-Zentrifugenröhrchen. Das Gewebe mit primärem Antikörper über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
      Anmerkung: Als primäre Antikörper wurden Ratten-anti-CD31 (Konzentration: 10 μg / ml) oder Ratten-Anti-VE-Cadherin (CD144 / Cdh5; Konzentration: 2,5 μg / ml) verwendet. Sowohl CD31 als auch VE-Cadherin sind Zelloberflächenmarker, die verwendet werden, um Endothel zu erkennen. 5x Antikörper-Färbepuffer wird mit 500 mM Maleinsäure, pH 7,5, hergestellt; 750 mM NaCl; Und 0,5% (v / v) Tween in PBS auflösen. Bei der Vorbereitung der frischen 1x Arbeitslösung nur ein geeignetes Serumvolumen (5%) einfüllen⁹
   2. Entfernen Sie den Antikörper-Färbepuffer und waschen Sie das Ganzband-Gewebe dreimal mit Waschpuffer, mit einem 10-minütigen Intervall. Inkubieren Sie das Gewebe mit sekundärem Antikörper (siehe Tabelle der Materialien ) plus DAPI bei RT für 4 h auf einer Schaukelplattform oder über Nacht bei 4 ° C.
      Hinweis: Verwenden Sie DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) mit einer Endkonzentration von 5 μg / ml, um die Kerne zu visualisieren.
   3. Waschen Sie das Ganzband-Gewebe mit Waschpuffer 3 mal für jeweils 10 min. Inkubieren Sie die Gewebestücke in 80% Glycerin oder 80% Saccharose über Nacht, um das Gewebe zur besseren Konservierung zu dehydratisieren.
   4. Legen Sie die einzelnen Gewebestücke auf einen Glasschieber und entfernen Sie den übermäßigen Dehydratationspuffer. Bedecken Sie das Gewebe mit dem Montagemedium, legen Sie ein Deckglas und drücken Sie das Gewebe vorsichtig, um es zu setzen.
   5. Führen Sie konfokale mikroskopische Bilderfassung durch. Für Vollmauerdrüsen, erwerben Bilder mit einem 40X mit NA = 1,3 Öl objectiVe Erfassen Sie Fliesen-Scans von Z-Stacks bei einer optischen Schnittauflösung von 1.024 x 1.024 und einer Schichttrennung von 1,0 - 1,2 μm.
      Hinweis: Um das korrekte Fluoreszenz-Lichtsignal zu erfassen, sollte der Filterstrahl-Splitter auf Triple Dichroic (TD) 488/553/638 eingestellt werden, wobei die Verstärkungseinstellung bei PMT Gain 600-800 liegt. Es sollten folgende Anreiz- / Emissionsquellen verwendet werden: mGFP, mit Anregungs- / Emissionsmaxima von 488/509 nm; MTomato mit Anregungs- / Emissionsmaxima von 532/588 nm; Alexa-647, mit Erregungs- / Emissionsmaxima von 594/665; Und DAPI mit Erregungs- / Emissionsmaxima von 350/470.

4. Abstufung mit einem genetisch modifizierten Mausmodell

1. Erkennung von Procr ⁺ VESCs mit dem Mausmodell.
   1. Verwenden Sie die Procr ^{CreERT2-IRES-tdTomato / +} (bezeichnet als Procr ^CreERT2 ) Knock-in Maus-Stamm.
      Hinweis: In diesem Mausmodell eine CreERT2-IRES-tdTomato- Kassette 10 wird nach dem ersten ATG-Codon von Procr ¹¹ eingefügt.
      1. Cross Procr ^CreERT2 Mäuse mit dem Rosa26 ^mTtomatomGFP (bezeichnet als R26 ^mTmG ) Reporterstamm, um das Schicksal von endogenen Procr + ECs in vivo ¹¹ zu verfolgen. Identifizieren Sie alle markierten endogenen Procr ⁺ ECs und ihre Abkömmlinge mit GFP-Expression.
   2. Manipulieren Sie Tamoxifen-Lösung ¹¹ (10 mg Tamoxifen, gelöst in 1 ml Erdnußöl + 10% Ethanol, um eine Stammlösung von 10 mg / ml zu bilden) intraperitoneal in einer Dosis von 4 mg / 25 g Körpergewicht während der Pubertätsstufe (5 Wochen Alt), um das Entwicklungsschicksal von Procr + ECs zu verfolgen.
   3. Analysieren Sie die Klon-bildende Effizienz von markierten Zellen durch Vollmontage-Immunfärbung nach den in Schritt 3 beschriebenen Herstellungsschritten. Erhalten Sie Mamma-Fett-Pads von behandelten Mäusen sowohl nach kurzzeitiger (2 Tage) und verlängerte Zeiträume (bis zu 10 Monate). Siehe Abbildung 3 .

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Ergebnisse

Mamma VESCs Isolierung:

Um die endotheliale Population für den konsequenten Transplantationstest zu isolieren, wurden reife (8 Wochen alte) Jungfrauen-Mamma-Drüsen als Spendermaterial geerntet. Endothelzellen wurden unter Verwendung einer Antikörper-basierten Zellsortierungstechnik isoliert. Repräsentative Pläne der FACS-Analyse der VESC-Population in 8 Wochen alten C57BL / 6-Milchdrüsen-ECs sind in Abb...

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Diskussion

Angiogenese-Assays stellen einen guten experimentellen Ansatz dar, um die Gefäßdynamik zu untersuchen. Maus retinalen Gefäß, die postnatal entwickelt, hat sich als ein attraktives Modell sein Angiogenese ¹² zu studieren. Obwohl es relativ zugänglich ist, ist die tatsächliche Manipulation innerhalb des Retina-Gefäßbettes ziemlich schwierig. Bisher war die am besten beschriebene in vivo- Transplantation der Plug-Assay, der Zellen in einer Basalmembran-Matrixmasse umgibt und chirurg...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1x)	Gibco (Life Technologies)	25300-062	0.05% Trypsin
0.22 µm Filter Unit	Merck Millipore Ltd.	SLGP033RB	0.22 µm Filter
2-Methylbutanol-2, ReagentPlus	Sigma-Aldrich	24, 048-6	Tert Amyl Alcohol
222, Tribromethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25g	222, Tribromethanol
4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)	Invitrogen	D1306	DAPI
70 µm Cell Strainer	BD FAL	352350	70 µm Cell Strainer
Adhesion Microscope Slides	CITOGLAS	188105	Glass slides
Anti-mouse CD105 APC	eBioscience	17-1051-82, clone MJ7/18	for FACS analusis use at 1 µg/mL
Anti-mouse CD201 Biotin	eBioscience	13-2012-82	for FACS analusis use at 2.5 µg/mL
Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7	eBioscience	25-0311-82, clone 390	for FACS analusis use at 1 µg/mL
BD FACSJazz Cell Sorter	BD Biosciences	655489	FACS
Bovine Serum Albumin	Sigma	100190332	BSA
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Centrifuge
Collagenase type 3	Worthington-Biochem	#LS004183	Collagenase III
Confocal microscopy	Leica	sp8	Confocal
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma	D2463-5VL	Dnase I
Donkey anti-Rat Cy3	Jackson ImmunResearch	712-165-150	Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL
Dumont Forceps	WPI	500342	Froceps
Dumont Forceps - Micro-Blunted Tips	FST	11253-20	Forceps
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	FBS
FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119	BioLegend	78022	Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µL per test
Glycerol	Sigma	G6279	Glycerol
Iscov's Modified Dulbecco's Medium	Gibco (Life Technologies)	12440-053	IMDM
Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora  647	Invitrogen	Z32450	Isolectin-647
Matrigel  Matrix (growth factor reduced)	BD	356231	Matrigel
Mouse strain (Actin-GFP)	Jax Laboratories	3773	Actin-GFP
Mouse strain (C57BL/6)	SLAC	C57BL/6	C57BL/6
Mouse strain  (BALB/c nude)	SLAC	BALB/c nude	Nude mice
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	PFA
Penicilin Streptomycin	Gibco (Life Technologies)	5140-122	Pen/Strep
Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x	Gibco (Life Technologies)	c20012500BT	PBS
PRIM1640	Gibco (Life Technologies)	c11875500CP	PRIM1640
ProLong Gold antifade reagent	Life Technologies	P36934	Mounting Medium
Rat anti CD144	BD Biosciences	550548	for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL
Rat anti CD31-biotin	BD Biosciences	553371	for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 µg/mL
Red Cell Lysis Buffer	Sigma	R7767-100ML	Red blood cell lysing buffer
Straight/Sharp-Blunt/10cm	FST	14028-10	Fine Scissors
Streptavidin eFluor 450	eBioscience	48-4317-82	for FACS analysis use at 0.5 µg/mL
Tamoxifen	Sigma	101551374	TAM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-250ML	TritonX
Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle)	COVIDIEN	S1173	Suture
Sterile Disposable Scaplels	Swann Morton	#10	Scalpel
Betadine	Yifeng Medical	20160101	Antiseptic solution