实验模型研究酸性后处理对脑缺血的神经保护作用

摘要

酸性后处理可防止脑缺血。在这里我们提出两个模型来执行APC。分别通过体外氧葡萄糖剥夺后将皮质硬膜下切片转移到酸性缓冲液中，并在体内大脑中动脉闭塞后吸入20％CO ₂ 。

摘要

中风是全球死亡和残疾的主要原因之一，治疗方法有限。作为神经保护的内源性策略，后处理已被证明是有希望的针对脑缺血的治疗方法。然而，复杂的程序和潜在的安全问题限制了其临床应用。为了克服这些缺点，我们开发了酸性后处理（APC）作为实验性局灶性脑缺血的治疗方法。 APC是指温和酸中毒治疗由局部缺血再灌注期间吸入的CO _2。在这里，我们分别提出了两种模型来在体外和体内执行APC。使用小鼠的氧 - 葡萄糖剥夺（OGD）治疗和小鼠的皮质静脉闭塞和中脑动脉闭塞（MCAO）来模拟脑缺血。 APC可以通过将脑切片转移到用20％CO ₂鼓泡的酸性缓冲液中来实现r通过吸入20％CO ₂的小鼠。 APC显示出对脑缺血的显着保护作用，如组织存活力和脑梗死体积所反映的。

引言

中风是全球死亡和残疾的主要原因之一。在过去几十年中，为了找到有效的卒中治疗，已经做出了巨大的努力，但是成绩还不尽如人意。后处理是在缺血发作后由亚毒性应激操纵的过程。后处理，包括缺血性，缺氧，低血糖和远程缺血后处理，触发内源性适应机制，并已被证明是有前途的治疗对脑缺血^{1，2，3，4。}然而，缺血后处理可能引起额外的损伤。肢体远程缺血后处理通常需要5的几个周期-在同侧或双侧后肢^5，6，7 20分钟闭塞和再灌注。钍因此，这些后处理操作在临床实践中是危险的或不切实际的。为了克服这些缺点，我们开发了APC为小鼠⁸局灶性脑缺血的疗法。通过吸入20％CO ₂诱导，APC以更可行和更安全的方式显着减少缺血性脑损伤。最近我们已经证明，APC延长了再灌注窗口，突出了APC对卒中治疗的重要性⁹ 。

在这里我们提出两个实验模型来研究APC对脑缺血的神经保护作用。第一个是小鼠皮质纹状体切片中的氧 - 葡萄糖剥夺（OGD）模型。通过人造脑脊液（ASCF）将脑切片快速制备和转移到人造环境中，可以维持细胞活力和神经元电路，这样可以在体外研究脑功能¹⁰sup>， ¹¹ 。在ASCF模仿脑缺血缺氧缺糖，诱导缺血性损伤^{12，13，14。}在OGD之后，将脑切片用常规ASCF（r-ASCF）刷新以提供再灌注，然后使用用20％CO ₂鼓泡的酸性ASCF处理APC。与原代培养细胞相比，皮质硬膜下切片维持完整的组织学表征。

为了研究体内脑功能，采用小鼠中脑动脉闭塞（MCAO）模型。通过颈总动脉插入火焰钝的单丝阻止大脑中动脉。作为最广泛使用的中风模型之一，MCAO模型显示临床相关性，单丝的应用使得更容易实现再灌注。简单地通过reperfusio发病后吸入含有20％CO ₂含氧量正常的混合气体n，APC对脑梗死体积减少所表明的脑缺血有显着的保护作用。

研究方案

所有实验均经浙江大学动物实验委员会道德准则批准实施，完全符合国家卫生研究院"实验动物护理与使用指南"。努力减少任何疼痛或不适，并使用最少数量的动物。

皮质硬膜下切片的OGD

1. 解决方法:
   1. 制备1000毫升的r-ACSF（124毫摩尔/ L，氯化钠，5毫摩尔/ L的KCl，1.25毫摩尔/ L KH ₂ PO _4，2毫摩尔/升MgSO _4，26毫摩尔/ L的NaHCO _3，2毫摩尔/ L的CaCl _2， 10 mmol / L葡萄糖，最终pH 7.4）。在整个实验中，具有5％CO ₂和95％O _2的气泡。
   2. 如上所述制备200mL无葡萄糖的ACSF（gf-ACSF），但不包括葡萄糖，以5％CO ₂和95％N ₂鼓泡。气泡气体30分钟，然后应用于brain切片以减少溶液中的氧含量。继续冒泡直到OGD程序完成。
   3. 通过用20％CO ₂和80％O ₂平衡200mL r-ACSF来制备酸性ACSF（a-ACSF）。气泡气体30分钟，然后应用于脑切片，将溶液的pH值降至pH6.8，继续鼓泡，直到APC程序完成。
   4. 将三个组织架分别放入r-ACSF，gf-ACSF，a-ACSF中。
2. 脑切片准备:
   注意:本研究使用8周龄的雄性C57B1 / 6J小鼠。将动物饲养在受控温度（22±2℃）下，12小时光暗循环周期，并进入沉淀的食物和水。
   1. 在感应室中用异氟醚过量的小鼠牺牲。放弃鼠标。用小剪刀和镊子解剖大脑。用薄的铲子取出大脑，小心地放入玻璃烧杯中用5％CO ₂和95％O ₂平衡的冰冷r-ACSF。
      注意:这些步骤应尽可能快速但精细地进行。
   2. 将大脑置于冰冷的r-ACSF中5分钟。调整气压以避免大脑的运动。
   3. 将低温沉淀胶放在vibratome板上两条。将一块3％的琼脂糖放在离开刀片的胶条上，以支撑大脑。
   4. 将10厘米培养皿倒入冰中，然后将滤纸放在盘子上。用冰冷的r-ACSF滴加湿滤纸。
   5. 用镊子将大脑转移到滤纸上。用刀片和镊子切断额极和小脑。
      注意:横截面应尽可能平滑，垂直于矢状面。
   6. 将剩余的脑组织垂直放置在另一条胶水上，并保持大脑靠在琼脂糖上。将冰冷的r-ACSF加入切割槽淹没大脑，并向冰块区域加冰。将r-ACSF置于用5％CO ₂和95％O ₂鼓泡的容器中。
   7. 提高水库并调整剃须刀的位置，使剃须刀尽可能靠近大脑，并在大脑之上。
   8. 选择"CONT"模式，连续切片脑部。将切割厚度设置为400μm，振动频率为6 - 8，速度为3 - 4.按"启动/停止"按钮开始自动切割。
   9. 切掉3 mL巴斯德吸管的尖端，使其与大脑切片的大小相匹配。
      注意:开口应足够大，以避免对脑切片造成额外的损害。
   10. 用tip-cut巴斯德移液器逐个抽出五个脑切片，并将其放入冰冷的r-ACSF中的组织保持器中，用5％CO ₂和95％O ₂鼓泡。不要收集生产的第一片。调整气压到avoi脑部切片的运动。
       注意:脑切片不应相互覆盖。
   11. 将脑切片与r-ACSF在室温下放置30分钟，然后在37℃下在水浴中放置另外10分钟以恢复突触功能。
3. OGD和APC:
   1. 将gf-ACSF和a-ACSF放入37°C水浴中，并用上述1.1.2和1.1.3中所述的相应气体将缓冲液鼓泡30分钟。
   2. 在r-ACSF中留下一片作为对照。将其他四个脑片转移到具有预热的gf-ACSF的组织保持器中并孵育15分钟。将切片转移回r-ACSF中的组织支架以实现再灌注。
   3. 研究APC的时间窗口，将一片直接从gf-ACSF传输到a-ACSF。首先将其他三个切片转移到r-ACSF，然后分别在再灌注后5和15分钟内将其中两个转移到a-ACSF中的组织支架。
   4. Incubate-ACSF中的两个切片3分钟，然后将其转移回r-ACSF。将r-ACSF中的三个切片孵育另外1小时。将r-ACSF中的剩余切片设置为OGD组。
   5. 对于剂量反应研究，首先在OGD后将所有四个切片转移到r-ACSF中的组织保持器，并孵育5分钟。然后在r-ACSF中留下一片作为OGD组，并将其他三个切片转移到-ACFF。将a-ACSF中的切片分别孵育1,3和5分钟，然后将其转移回r-ACSF。将r-ACSF中的三个切片孵育另外1小时。
4. 切片生存力测定:
   1. 制备0.25％2,3,5-三苯基四唑盐酸盐（TTC）生理盐水溶液。加入1.25 g TTC粉末至500 mL生理盐水溶液。
      注意:粉末完全溶解后，将溶液转移到覆盖在箔中的24孔板（500μL/孔）中并将其储存在4℃。用TTC染色的TTC和组织轻sitive。
   2. 将切片转移到含有TTC溶液的24孔板（每孔一片）中，并在溶液中拉伸切片。将TTC溶液中的切片在37℃下在浅水浴中孵育30分钟。
   3. 将切片转移到覆盖在箔中的干净的1.5 mL离心管中，并测量切片的干重。
   4. 将乙醇/二甲基亚砜（1:1）加入到离心管中（v = 10:1），以提取甲。。在室温下将切片在乙醇/二甲基亚砜中孵育24小时。
   5. 将管中的所有乙醇/二甲基亚砜加入到96孔板中，并通过读板器测量490nm处的吸光度。
   6. 将吸光度归一化到切片的干重，并将生存力表示为对照切片的百分比。

MCAO

1. 制备:
   1. 消毒工作台，激光多普勒流量计的表面y（LDF）仪器及其配件，含70％乙醇。
   2. 准备高压灭菌仪器:两把剪刀，10厘米;两镊子，10厘米;一个眼科钳，11厘米;一只微型眼科剪刀，9厘米;一个微血管夹，1.8厘米; oneneedle驱动，r 12.5厘米;几条外科缝合线（△1/2 4×10）;棉签。
   3. 用盐水溶液准备注射器（无针头）以保持水合作业区域。
   4. 准备麻醉气体（100％O ₂ +异氟烷）。
2. 脑血流量检测:
   1. 设置LDF仪器。
   2. 腹腔注射小鼠镇痛药:metamizol 200 mg / kg，carprofen 4 mg / kg，丁丙诺啡0.1 mg / kg。
   3. 将小鼠放入感应室中，用4％异氟烷在氧气中进行麻醉，直到身体自发移动，并将其停止。
   4. 将鼠标置于俯卧位置，其鼻子装入鼻锥并维持异氟醚为1.5％，以后的程序。
   5. 在双眼睛上涂抹松香酚眼膏。
   6. 用70％乙醇消毒头部。
   7. 使用手术刀在眼睛和耳朵之间做出正确的paramedian皮肤切口，以暴露胭脂红。
   8. 用无菌棉揉颅骨。
   9. 在头骨表面涂一滴至两滴手术胶。
   10. 将光纤探头的尖端5 mm尾部放置到腋下，并将中线的外侧6 mm。
   11. 开始在计算机软件上记录血流量。等待直到发生稳定的血流基线，然后在胶上涂上20μL催化剂以固定探针。
       注意:理想的基线应该超过500个通量。
   12. 如果基线小于200通量，请精细调整位置以获得合适的基线。在实验期间，将探头连接到颅骨。
   13. 用碘伏消毒头连接光纤探头。
3. MCAO:
   1. 将麻醉的小鼠（用LDF探针连接到其头骨）放置并固定，仰卧位置，并在整个手术过程中使用加热灯保持其体温。用70％乙醇消毒颈部。
   2. 使用手术刀在颈部做一个paramedian皮肤切口;用镊子钝化软组织以暴露血管。向暴露的组织中加入一滴盐水以保持水分。
   3. 使用眼科钳将周围组织和迷走神经解剖颈总动脉。小心不要损伤迷走神经。颈总动脉暴露后再次用碘伏消毒颈部皮肤。
   4. 在颈总动脉的远端放置微血管夹，然后在近端用6-0丝线缝合死结。将夹具尽可能靠近以进行后续操作。确保长度钳夹与死结之间的血管尽可能长，以便后续操作。
   5. 通过捆扎一个松散的结将临时缝合线靠近夹具。确保单丝插入之间有足够的空间。
   6. 用微型眼科剪刀在两节之间进行一个小的纵向切口。确保切口尽可能靠近死结，以便后续操作。小心不要切断船只。
   7. 通过切口插入12毫米尖端钝的单丝进入动脉内腔，并将其推进几毫米。拧紧单丝尖端的松散结，然后取下夹具。
   8. 使用眼科钳将长丝推进颈内动脉（10mm，以阻塞大脑中动脉），直到LDF软件显示血流量急剧下降（基线血流减少80％以上）。记录遮挡的开始时间。
      注意:LDF仪器设置为在2.2节中描述。
   9. 大脑中动脉闭塞1 h。切断LDF探针，并将其放入30℃的培养箱中，以保持闭塞状态。
4. 再灌注和APC:
   1. 在开始闭塞后55分钟，用异氟醚再次麻醉动物。将小鼠放置并固定在仰卧位。打开颈部切口并重新暴露颈总动脉。
   2. 在闭塞期后用眼科钳子轻轻拉出长丝，以达到再灌注，并通过拧紧结而将临时缝合线变成永久缝合线。
   3. 为酸中毒的治疗，再灌注后5，50，或100分钟改变由鼻锥吸入到含有20％CO _{2，20％O 2}和60％N ₂ 5分钟混合气体的气体。用中断的手术缝合缝合切口。
   4. 将小鼠放在30°C的保温笼中，直到小鼠恢复意识然后将老鼠送回清洁的个别笼子里。为小鼠提供水培养和滋润的食物。手术后密切观察小鼠的过度疼痛和死亡。
5. 脑梗塞体积测量:
   1. 再灌注24 h后采用TTC染色测量脑梗死体积。
   2. 在指定的牺牲时间之前，按步骤1.4.1中所述准备0.25％的TTC溶液。将溶液转移到覆盖在箔中的24孔板（1mL /孔）中并将其储存在4℃。
      注意:TTC和TTC染色的组织对光敏感。
   3. 在再灌注后24小时，在诱导室中用异氟醚过量处死动物。解脱老鼠用小剪刀和镊子解剖大脑。检查大脑上的流血点，以排除在威利斯圈发生蛛网膜下腔出血的小鼠。
   4. 将大脑放在-20°的干净的玻璃片上 ; C冰包。将大脑和玻片放在-20°C冰箱中5分钟，使大脑更容易切片。
   5. 将大脑和玻璃片从-20°C取出，放回-20°C冰袋。用刀片和镊子解剖额极和小脑。
   6. 用刀片将脑切片水平切割成1mm厚度以产生5片。将切片转移到含有TTC溶液的24孔板（每孔1片）中并用镊子拉伸，并拉伸溶液中的切片。将TTC溶液中的切片在37℃下在浅水浴中孵育30分钟。
   7. 吸出TTC溶液。加入10％甲醛（1mL /孔），并在室温下孵育30分钟。将切片按切片顺序放置在玻璃纸上，并将片段扫描到照相板成像仪中。
   8. 使用ImageJ分析软件分析梗塞面积占整个脑切片的百分比lass ="xref"> 8基于视觉识别; 见图2 （左图）。

结果

在上述皮质纹状体切片模型中，在再灌注后1小时通过TTC测定定量皮质硬膜下切片存活力。通过将490nm处的吸收归一化到对照切片来计算TTC转化。根据TTC转换，APC在起始时间和持续时间依赖的方式保护OGD诱导的再灌注损伤。详细地，1和3分钟的酸中毒治疗在OGD 15分钟后5分钟显着改善了活力，而5分钟没有（OGD:0.609±0.029,5 / 1:0.758±0.034,5 / 3:0.821±0.041， 5/5:0.672±0.053，数据报告为?...

讨论

在这里我们提出两个实验模型来研究APC对脑缺血的神经保护作用。在脑切片中，APC通过在再灌注发生后用20％CO ₂鼓泡的酸性缓冲液中孵育小鼠皮质纹状体切片来实现，而在MCAO模型中，APC是通过在再灌注后向小鼠吸入20％CO ₂而实现的。这两种模型反映了APC对脑缺血的神经保护作用。保护与通过缺血后处理实现的保护相当，但是具有更宽的时间窗口。在MCAO模型，再灌注后相比10分钟?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma	S5886
Potassium chloride	Sigma	P5405
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P9791
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C5080
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021
Vibratome	Leica	VT1000 S
2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride	Sigma	T8877
Absolute Ethanol	Aladdin Industrial Corporation	E111993
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D8418
Laser Doppler Flowmetry	Moor Instruments Ltd	Model Moor VMS-LDF2
Diethyl ether anhydrous	Sinopharm Chemical Reagent Corporation	80059618
Trichloroacetaldehycle hydrate	Sinopharm Chemical Reagent Corporation	30037517
10% Formalin	Aladdin Industrial Corporation	F111936
24-well plates	Jet Biofil	TCP-010-024