대뇌 허혈에 대한 산성 후행 조절의 신경 보호를 연구하기위한 실험 모델

요약

산성 후 조절은 뇌 허혈을 예방합니다. 여기서는 APC를 실행하는 두 가지 모델을 제시합니다. 이들은 시험 관내에서 산소 - 글루코스 부족 후에 산성 버퍼 corticostriatal 슬라이스를 전달함으로써 생체 내에서 중간 대뇌 동맥 폐색 후 20 % CO _{2 흡입에} 의해 각각 달성된다.

초록

뇌졸중은 전 세계적으로 사망률과 장애의 주요 원인 중 하나이며 제한된 치료 방법을 사용합니다. 신경 보호를위한 내생 적 전략으로서, 후 조절 (postconditioning treatment)은 뇌 허혈에 대한 유망한 치료법으로 입증되었다. 그러나 복잡한 절차와 잠재적 인 안전 문제로 인해 임상 적용이 제한됩니다. 이러한 단점을 극복하기 위해 우리는 실험적인 국소 뇌 허혈에 대한 치료법으로 산성 후 조절 (acidic postconditioning, APC)을 개발했습니다. APC는 허혈 재관류 동안 CO _2를 흡입하여 온화한 산증의 치료를 의미합니다. 여기서 우리는 각각 in vitro 및 in vivo에서 APC를 수행 할 수있는 두 가지 모델을 제시합니다. 생쥐의 산소 - 포도당 결핍 (OGD) 처리 및 생쥐의 대뇌 피질 선종 및 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO)을 사용하여 뇌허혈을 모방 하였다. APC는 단지 20 % CO _2로 버블 산성 버퍼 뇌 조각을 전송함으로써 달성 될 수있다 O20 % CO _{2 마우스를} 흡입하여 R. APC는 조직 생존력 및 뇌경색 양에 의해 반영되는 바와 같이, 뇌허혈에 대한 유의적인 보호 효과를 나타내었다.

서문

뇌졸중은 전 세계적으로 사망률과 장애를 유발하는 주요 원인 중 하나입니다. 지난 수십 년 동안 뇌졸중에 대한 효과적인 치료법을 찾기 위해 많은 노력을 기울 였지만 그 성과는 아주 불만족 스럽습니다. 사후 조절 (postconditioning)는 허혈성 에피소드에 따른 독성 스트레스에 의해 조작되는 과정입니다. 허혈, 저산소증, 저 포도당 및 원격 허혈 후 조절을 포함한 사후 조건 조절은 내인성 적응 메커니즘을 유발하고 뇌허혈에 대한 유망한 치료법으로 입증되었습니다 ^{1 , 2 , 3 , 4} . 그러나, 허혈 후 조절은 추가적인 상해를 유발할 수 있습니다. 사지의 원격 허혈성 후 조절은 동측 또는 양측 뒷다리 ^{5 , 6 , 7} 에 5 ~ 20 분간의 폐색과 재관류를 반복해야합니다. Th따라서 이러한 사후 조건 조종 조작은 임상 적으로 위험하거나 비실용적입니다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 우리는 생쥐 ⁸ 국소 뇌허혈에 대한 치료로 APC를 개발했다. 단순히 CO ₂ 20 %를 흡입에 의해 유도, APC는 훨씬 더 실현 가능한 안전한 방법으로 허혈성 뇌 손상을 줄일 수 있습니다. 최근에 우리는 APC가 뇌졸중 치료 ⁹ APC의 중요성을 강조, 재관류 창을 확장 함을 확인 하였다.

여기에 우리는 뇌 허혈에 대한 APC의 신경 보호를 연구하기위한 두 가지 실험 모델을 제시한다. 첫 번째는 생쥐 corticostriatal 조각에서 산소 - 포도당 박탈 (OGD) 모델입니다. 인공적인 환경으로 신속한 준비 및 뇌 슬라이스 전송 보통 인공 뇌척수액 (ASCF) 가능 체외 ¹⁰ <뇌 기능을 연구 할 수있는 세포 생존 및 신경 회로를 유지할 수있다¹¹ . ASCF의 OGD는 대뇌 국소 빈혈을 모방하고 허혈성 손상을 유발한다 ( ^{12 , 13 , 14)} . OGD 후 뇌 조각은 재관류를 제공하기 위해 정규 ASCF (R-ASCF)에서 갱신 된 후 20 % CO _2로 버블 산성 ASCF APC를 사용하여 처리 하였다. corticostriatal 조각은 일차 배양 세포와 비교하여 손상되지 않은 조직학 특성을 유지합니다.

생체 내에서 뇌 기능을 연구하기 위해 마우스 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 모델을 사용합니다. 중간 대뇌 동맥은 총 경동맥을 통해 난연성 모노 필라멘트를 삽입하여 막습니다. 가장 널리 사용되는 뇌졸중 모델 중 하나 인 MCAO 모델은 임상 관련성을 보여 주며 monofilament의 적용으로 재관류를보다 쉽게 ​​수행 할 수 있습니다. 전자 reperfusio의 발병 후 20 %의 _CO2를 함유하는 정상 산소의 혼합 가스를 흡입하여n, APC는 뇌경색의 감소로 나타나는 뇌허혈에 유의 한 보호 효과를 나타냈다.

프로토콜

모든 실험은 Zhejiang 대학 동물 실험위원회의 윤리 지침에 따라 승인되고 시행되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 보건 연구소의 지침을 완벽하게 준수했습니다. 고통이나 불편 함을 최소화하기위한 노력이 이루어졌으며 최소한의 동물 수가 사용되었습니다.

1. Corticostriatal 조각의 OGD

1. 솔루션 준비 :
   1. 1000 mL의 R-ACSF (124 밀리몰 / L, 염화나트륨을 준비 5 밀리몰 / L의 KCl, 1.25 밀리몰 / L의 KH ₂ PO _4, 2 밀리몰 / L _황산, 26 밀리몰 / _{L의 NaHCO3,} 2 밀리몰 / L의 _CaCl2를, 10 mmol / L 포도당, 최종 pH 7.4). 실험 전반에 걸쳐 5 % CO ₂ 및 95 % O ₂ 를 포함한 거품.
   2. 5 % CO ₂ 및 95 % N ₂ 버블 글루코스 위는 제외 200 mL의 포도당없는 ACSF (GF-ACSF)를 준비한다. br에 적용하기 전에 30 분 동안 기체를 버블 링하십시오.용액의 산소 함량을 줄이기 위해 얇게 썬 것입니다. OGD 절차가 끝날 때까지 버블 링을 계속하십시오.
   3. 20 % CO ₂ 및 80 % O _2로 r-ACSF 200 mL를 평형화하여 산성 ACSF (a-ACSF)를 준비한다. 뇌 조각에 적용하기 전에 30 분 동안 가스를 버블 링하여 용액의 pH를 pH 6.8로 낮추고 APC 절차가 끝날 때까지 버블 링을 계속하십시오.
   4. 3 개의 조직 홀더를 각각 r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF에 놓습니다.
2. 두뇌 준비 :
   참고 :이 연구에서는 8 주 된 수컷 C57Bl / 6J 마우스를 사용했습니다. 동물들은 조절 된 온도 (22 ± 2 ℃)하에 12 시간의 명암 사이클주기 및 펠렛 화 된 음식 및 물에 접근하여 보관 하였다.
   1. 유도 챔버에서 isoflurane의 과다 복용으로 마우스를 희생. 마우스를 처치하십시오. 작은 가위와 집게를 사용하여 두뇌를 해부. 얇은 주걱으로 뇌를 제거하고 조심스럽게 유리 비이커에 넣으십시오이닝 빙냉 R-ACSF 5 % CO _2, 95 % O _2로 평형화.
      참고 :이 단계는 가능한 한 신속하지만 세 심하게 수행해야합니다.
   2. ice-cold r-ACSF에 뇌를 5 분간 보관하십시오. 뇌의 움직임을 피하기 위해 가스 압력을 조절하십시오.
   3. 두 stripe에 vibratome 접시에 cryoprecipitate 접착제를 놓으십시오. 두뇌를 지원하기 위해 블레이드에서 멀리 접착제 스트립에 3 % 아가로 오스 조각을 넣어.
   4. 얼음에 10cm 페트리 접시를 뒤집은 다음 접시에 여과지를 넣어. 얼음처럼 차가운 r-ACSF로 여과지를 적 십니다.
   5. 집게로 두뇌를 여과지에 옮기십시오. 전두엽과 소뇌를 칼날과 집게로 잘라냅니다.
      참고 : 횡단면은 가능한 한 부드럽고 시상면에 수직이어야합니다.
   6. 나머지 두뇌 조직을 접착제의 다른 스트립에 수직으로 배치하고 두뇌가 아가로 오스에 기대어 두도록하십시오. 얼음 저온 r-ACSF를 절단 저장조에 추가뇌를 잠수하고 얼음 홀더 영역에 얼음을 추가하십시오. 5 % CO ₂ 및 95 % O _2로 버블 링 된 저장소의 r-ACSF를 유지합니다.
   7. 공기통을 들어 올리고 면도날을 가능한 한 두뇌 가까이에두고 뇌의 바로 위에 면도날의 위치를 ​​조정하십시오.
   8. 두뇌 섹션을 계속 슬라이스하려면 "연속"모드를 선택하십시오. 절단 두께를 400 μm, 진동 주파수를 6 - 8, 속도를 3 - 4로 설정하십시오. "start / stop"버튼을 눌러 자동 절단을 시작하십시오.
   9. 뇌 조각의 크기에 맞는 개구부를 만들기 위해 3 mL 파스퇴르 피펫의 끝 부분을 자릅니다.
      참고 : 개구부는 뇌 조각에 대한 추가 손상을 피할 수있을만큼 커야합니다.
   10. 오 개 뇌 조각에게 팁 cutPasteur 피펫 하나 하나를 그려 얼음처럼 차가운 R-ACSF의 조직 홀더에 넣지 5 % CO _2, 95 % O ₂ 부풀어. 생산 된 첫 조각을 수집하지 마십시오. 가스 압력을 조정하십시오뇌 조각의 움직임.
       참고 : 두뇌 조각은 서로를 가려서는 안됩니다.
   11. 30 분 동안 실온에서 r-ACSF로 두뇌 슬라이스를 놓고 시냅스 기능을 회복하기 위해 수 욕에서 37 분간 추가로 10 분간 두었다.
3. OGD 및 APC :
   1. 37 ℃의 수조에 gf-ACSF와 a-ACSF를 놓고 위에서 언급 한 1.1 f와 1.1.3의 해당 가스로 완충액을 버블 링하십시오.
   2. r-ACSF의 한 조각을 컨트롤로 둡니다. 조심스럽게 예열 gf - ACSF와 조직 홀더에 다른 네뇌 두 조각을 전송하고 15 분 동안 품어. 재관류를 달성하기 위해 슬라이스를 r-ACSF의 조직 홀더로 다시 옮긴다.
   3. APC 시간대를 연구하려면 gf-ACSF에서 a-ACSF로 직접 슬라이스 하나를 전송하십시오. 처음에 다른 세 조각을 r-ACSF로 옮긴 다음 재관류 후 5 분과 15 분에 각각 ACSF로 조직 홀더로 옮깁니다.
   4. Incubata-ACSF에서 2 조각을 3 분간 추출한 다음 r-ACSF로 다시 전송합니다. r-ACSF의 세 조각을 다른 1 시간 동안 품어 낸다. r-ACSF의 나머지 슬라이스를 OGD 그룹으로 설정하십시오.
   5. 용량 반응 연구를 위해, OGD 후 r-ACSF의 조직 보유자에게 4 개의 모든 조각을 옮기고 5 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 한 조각을 r-ACSF에 OGD 그룹으로두고 다른 세 조각을 ACSF로 전송합니다. a - ACSF의 조각을 각각 1, 3, 5 분 동안 품어 낸 다음 다시 r-ACSF로 전송합니다. r-ACSF의 세 조각을 다른 1 시간 동안 품어 낸다.
4. 슬라이스 생존력 측정 :
   1. 2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride (TTC) 0.25 % 생리 식염수 용액을 준비한다. 500 mL의 생리 식염수에 TTC 분말 1.25 g을 넣는다.
      참고 : 분말이 완전히 녹은 후 호일로 덮인 24- 웰 플레이트 (500 μL / 웰)에 용액을 옮기고 4 ° C에 보관하십시오. TTC 및 TTC로 염색 된 조직은 빛 센sitive.
   2. 슬라이스를 TTC 솔루션이 들어있는 24- 웰 플레이트 (웰당 한 조각)에 옮기고 용액에서 슬라이스를 늘립니다. 37에서 TTC 솔루션의 조각을 품어 ° C 30 분 얕은 수조에서.
   3. 호일로 덮인 깨끗한 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 조각을 옮기고 슬라이스의 건조 중량을 측정합니다.
   4. 원심 분리기 튜브 (v : w = 10 : 1)에 에탄올 / 디메틸 술폭 시드 (1 : 1)를 첨가하여 포르 마잔을 추출한다. 24 시간 동안 빛으로부터 멀리 실온에서 에탄올 / 디메틸 술폭 시드의 조각을 품어.
   5. 모든 에탄올 / 디메틸 sulfoxide를 96- 웰 플레이트에 넣고 플레이트 판독기로 490 nm에서 흡광도를 측정한다.
   6. 흡광도를 슬라이스의 건조 중량으로 표준화하고 생존력을 대조 슬라이스의 백분율로 나타냅니다.

2. MCAO

1. 예비:
   1. 작업대, 레이저 도플러 유량계의 표면을 소독하십시오.y (LDF) 장비 및 70 % 에틸 알콜을 포함한 액세서리.
   2. 오토 클레이브 된기구 준비 : 두 개의 가위, 10cm; 두 포셉, 10cm; 한 안과 용 집게, 11cm; 하나의 마이크로 안과 가위, 9cm; 하나의 미세 혈관 클램프, 1.8cm; oneneedle 운전, r 12.5 cm; 몇몇 수술 봉합사 (△ 1/2 4 × 10); 면봉.
   3. 수화 작용 영역을 유지하기 위해 식염수로 주사기 (바늘 제외)를 준비하십시오.
   4. 마취 가스 (100 % O ₂ + isoflurane)를 준비하십시오.
2. 뇌 혈류 탐지 :
   1. LDF 장비를 설치하십시오.
   2. Metamizol 200 mg / kg, carprofen 4 mg / kg 및 buprenorphin 0.1 mg / kg으로 마우스에 복강 내 진통제를 주입하십시오.
   3. 마우스를 유도 챔버에 4 % isoflurane을 산소와 함께 마취시켜 신체와 정맥류의 자발적인 움직임이 멈출 때까지 마취시킨다.
   4. 코를 엎드린 위치에 마우스를 놓고코 콘을 투여하고 후속 절차를 위해 이소 플루 란을 1.5 %로 유지한다.
   5. 양쪽 눈에 dexpanthenol 안 연고제를 바르십시오.
   6. 70 % 에틸 알코올로 머리를 소독하십시오.
   7. 브레 그마를 폭로하기 위해 메스를 사용하여 눈과 귀 사이의 올바른 파라 메디아 피부 절개를하십시오.
   8. 두개골을 멸균면으로 문지릅니다.
   9. 두개골 표면에 수술 용 접착제 1-2 방울을 바르십시오.
   10. bregma에 5mm 꼬리 광섬유 프로브의 팁을 넣고 정중선에 6mm 측면을 놓습니다.
   11. 컴퓨터 소프트웨어에서 혈류 기록을 시작하십시오. 안정된 혈류량 기준선이 생길 때까지 기다린 다음 접착제에 20 μL 촉매를 가하여 프로브를 고정하십시오.
       참고 : 이상적인베이스 라인은 500 플럭스 이상이어야합니다.
   12. 기준선이 200 플럭스보다 작 으면 적절한 기준선을 얻기 위해 미세하게 위치를 조정합니다. 실험 기간 동안 두개골에 프로브를 붙이십시오.
   13. iodophor af로 머리를 소독하십시오.광섬유 프로브가 부착되어 있습니다.
3. MCAO :
   1. 마취 된 마우스 (그 두개골에 부착 된 LDF 탐침 포함)를 앙와위로 놓고 수술 중에 열 램프를 사용하여 체온을 유지하십시오. 70 % 에틸 알코올로 목을 소독하십시오.
   2. 메스를 사용하여 목에 paramedian 피부 절개를하십시오; 부드러운 조직을 포셉로 절개하여 혈관을 노출시킵니다. 수분을 유지하기 위해 노출 된 조직에 한 방울의 식염수를 추가하십시오.
   3. 안과 집게를 사용하여 주변 조직과 미주 신경에서 총 경동맥을 해부합니다. 미주 신경을 손상시키지 않도록주의하십시오. 총 경동맥이 노출 된 후 iodophor로 목 피부를 다시 소독하십시오.
   4. 총 경동맥의 말단에 미세 혈관 클램프를 놓은 다음 기단에서 6-0 실크 봉합사로 죽은 매듭을 묶습니다. 후속 작업을 위해 클램프를 가능한 한 근위에 놓습니다. 길이가클램프와 데드 매듭 사이의 용기는 후속 작업을 위해 가능한 한 길다.
   5. 느슨한 매듭을 묶어 클램프의 근위에 임시 봉합을하십시오. 모노 필라멘트 삽입을위한 두 개의 매듭 사이에 충분한 공간이 있는지 확인하십시오.
   6. 마이크로 안과 가위로 두 개의 매듭 사이에 종 방향 절개를하십시오. 후속 수술을 위해 가능한 한 절개가 죽은 매듭에 가까워 졌는지 확인하십시오. 배를 자르지 않도록주의하십시오.
   7. 절개를 통해 12mm 팁 둔화 모노 필라멘트를 삽입하여 동맥 루멘에 들어가서 몇 mm 전진시킵니다. 모노 필라멘트 끝에 느슨한 매듭을 조인 다음 클램프를 제거하십시오.
   8. LDF 소프트웨어가 혈류량이 급격히 감소 (기준 혈류보다 80 % 이상 감소) 될 때까지 안과 용 집게로 필라멘트를 내 경동맥 (중간 대뇌 동맥을 막기 위해 10mm)으로 전진시킵니다. 오 클루 전 시작 시간을 기록하십시오.
      참고 : LDF 장비 설정은 다음과 같습니다.2.2 절에서 설명했다.
   9. 중간 대뇌 동맥을 1 시간 동안 폐색한다. LDF 프로브를 차단하고 교합 기간 동안 30 ° C 배양기에 마우스를 넣으십시오.
4. 재관류 및 APC :
   1. occlusion의 시작 시간 후 55 분 위에서 설명한대로 isoflurane로 동물을 다시 마취. 쥐를 눕히거나 눕히십시오. 목 절개를 열고 총 경동맥을 다시 노출 시키십시오.
   2. 가려움 기간 후 안과 용 집게로 부드럽게 필라멘트를 꺼내어 재관류를 이루고 매듭을 조여 임시 봉합사를 영구 고정시켜줍니다.
   3. 산증의 치료를위한, 재관류 후 5, 50, 또는 100 분 20 %의 5 분 동안 CO _2, 20 % O ₂ 및 60 % N _2를 포함하는 혼합 가스로 노즈콘 의해 흡입 가스를 변경. 중단 수술 봉합과 절개를 닫습니다.
   4. 생쥐가 의식을 회복 할 때까지 30 ° C 열 케이지에 마우스를 놓습니다.마우스를 깨끗하고 개별적인 우리로 되 돌린다. 물과 축축한 음식의 페트리 접시를 쥐에게 제공하십시오. 과도한 통증과 사망에 대한 수술 후 마우스를 면밀히 관찰하십시오.
5. 뇌경색 체적 측정 :
   1. 재관류 24 시간 후 TTC 염색을 사용하여 뇌경색 양을 측정하십시오.
   2. 지정된 희생 시간 이전에 1.4.1 단계에서 언급 한대로 0.25 % TTC 용액을 준비한다. 호일로 덮인 24 - 웰 플레이트 (우물당 1 ML)에 솔루션을 전송하고 4 ° C에 보관하십시오.
      참고 : TTC 및 TTC로 염색 된 조직은 빛에 민감합니다.
   3. 재관류 24 시간 후 유도 챔버에서 isoflurane의 과다 복용으로 동물을 희생. 마우스를 처치하십시오. 작은 가위와 집게를 사용하여 머리를 해부하십시오. 윌리스 서클에서 지주막 하 출혈을 일으킨 마우스를 제외하기 위해 두뇌의 피가 섞이는 부분을 검사하십시오.
   4. -20 °에 깨끗한 유리 슬라이드에 두뇌를 놓습니다 C 아이스 팩. 뇌를 조각 내기가 더 쉽도록 5 분 동안 -20 ° C 냉장고에 두뇌와 유리 슬라이드를 놓습니다.
   5. -20 ° C에서 두뇌와 유리 슬라이드를 꺼내 -20 ° C 얼음 팩에 올려 놓습니다. 정면 기둥과 소뇌를 칼과 포셉로 해부하십시오.
   6. 블레이드를 사용하여 뇌 부분을 수평으로 1mm 두께로 슬라이스하여 5 개의 슬라이스를 만듭니다. 슬라이스를 집게로 TTC 용액 (웰 당 1 슬라이스)이 들어있는 24- 웰 플레이트로 옮기고 용액에서 슬라이스를 뻗는다. 37에서 TTC 솔루션의 조각을 품어 ° C 30 분 얕은 수조에서.
   7. TTC 솔루션을 대기음. 10 % 포름 알데히드 (웰 당 1 mL)를 첨가하고 실온에서 30 분 동안 인큐베이션한다. 셀로판 시트에 자른 순서대로 슬라이스를 놓고 사진 플레이트 이미 저로 세그먼트를 스캔합니다.
   8. ImageJ 분석 소프트웨어를 사용하여 전체 뇌 조각의 백분율로 경색 크기 분석lass = "xref"> 8 시각적 식별에 기초; 그림 2 (왼쪽)를 참조하십시오.

결과

위에서 설명한 corticostriatal 슬라이스 모델에서, corticostriatal 슬라이스 생존 능력은 재관류 후 1 시간 TTC 분석에 의해 계량되었다. TTC 변환은 490 nm에서의 흡수를 대조 절편으로 정규화함으로써 계산 하였다. TTC 전환에 따라, APC는 발병 시간과 지속 시간에 따라 OGD 유발 재관류 손상으로부터 보호했다. 구체적으로, 1 분 및 3 분의 산증 치료는 모두 15 분 OGD 후 5 분에서 생존율?...

토론

여기에 우리는 뇌 허혈에 대한 APC의 신경 보호를 연구하기위한 두 가지 실험 모델을 제시한다. 뇌 조각에서, APC는 MCAO 모델에서, APC는 재관류 후 마우스에 20 % CO _{2 흡입에} 의해 달성되는 동안 마우스, 재관류 개시 후 20 % CO _2로 버블 산성 완충액 슬라이스 corticostriatal 배양함으로써 달성된다. 두 모델 모두 대뇌 허혈에 대한 APC의 신경 보호를 반영한다. 보호는 허혈성 후 컨디셔닝에 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma	S5886
Potassium chloride	Sigma	P5405
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P9791
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C5080
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021
Vibratome	Leica	VT1000 S
2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride	Sigma	T8877
Absolute Ethanol	Aladdin Industrial Corporation	E111993
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D8418
Laser Doppler Flowmetry	Moor Instruments Ltd	Model Moor VMS-LDF2
Diethyl ether anhydrous	Sinopharm Chemical Reagent Corporation	80059618
Trichloroacetaldehycle hydrate	Sinopharm Chemical Reagent Corporation	30037517
10% Formalin	Aladdin Industrial Corporation	F111936
24-well plates	Jet Biofil	TCP-010-024