C. 线虫小肠作为细胞间腔形态发生和体内极化膜生物单细胞水平的模型: 抗体染色、rna 干扰功能分析和成像标记

摘要

透明的C. 线虫小肠可作为 "体内组织室", 用于研究多细胞 tubulogenesis 中的单细胞和亚 apicobasal 膜和腔生物。本协议描述了如何结合标准标记, 功能的遗传/rna 干扰和微观的方法来解剖这些过程的分子水平。

摘要

多细胞管, 所有内脏的基本单位, 由极化上皮或内皮细胞组成, 顶端膜内衬的流明和侧膜接触对方和/或细胞外基质。在器官形态发生过程中, 这种独特的膜不对称是如何建立和维持的仍然是一个尚未解决的细胞生物学问题。本协议将线虫小肠描述为一个模型, 用于分析管状形态发生中的极化膜生物, 重点是心尖膜和腔生物。C. 线虫二十细胞单肠上皮被安排成一个简单的双边对称管, 允许在单细胞水平上进行分析。在早期胚胎发生过程中, 细胞膜极化伴随着极化细胞分裂和迁移, 但当细胞不再增殖和移动时, de 从头极化膜生物继续贯穿幼虫生长。后一种设置允许一个分离亚细胞的变化, 同时调解这些不同的极化过程, 很难区分在大多数极性模型。顶端, 侧膜-, 连接, 骨架和膜成分可以标记和跟踪整个开发中的 GFP 融合蛋白, 或评估的原位抗体染色。与生物体的遗传多样性, C. 线虫小肠因此提供了一个独特的体内模型的视觉, 发展, 和分子遗传学分析极化膜和管生物。这里描述的具体方法 (所有标准) 包括如何: 通过抗体染色对肠亚细胞成分进行标记;通过功能 tubulogenesis 基因的研究, 分析极化膜生物中涉及的基因;评估不同发育阶段的极性缺陷;用荧光、差分干涉对比 (DIC) 和共聚焦显微镜解释表型;量化视觉缺陷。该协议可以用来分析任何通常高度保守的分子涉及上皮极性, 膜生物, 管和流明形态发生。

引言

细胞及亚细胞不对称的产生, 如极化膜域的形成, 对于组织和器官的形态和功能是至关重要的¹。极化膜生物在上皮细胞中的研究仍然是一个技术上的挑战, 因为在亚单位成分分配的方向性变化取决于多个连续和重合的胞外和胞内信号很难分离在大多数模型和强烈依赖于模型系统。这里提出的模型-单线虫线虫肠道-是一个精致的简单组织。与单细胞的c. 线虫排泄管 (见附纸的极化膜生物在c. 线虫排泄管)², 它提供了几个独特的优势, 以识别和极化膜生物所需分子的表征。从酵母到人类的分子极性提示的保护使这个简单的无脊椎动物器官成为优秀的 "体内组织室", 以解决与人类系统直接相关的上皮极性问题, 这仍然是非常复杂的, 允许在单个单元格级别在体内对这些事件进行可视化剥离。

虽然多个保守的极性提示从 (1) 外矩阵, (2) 血浆膜及其交界处, (3) 胞内水泡贩运已被确定为³, 其基本的原理是它们在过程中集成极化上皮膜和组织生物不太了解⁴。经典的单细胞在体内模型 (e.g.S. 酵母和C. 线虫合子) 在确定极化细胞分裂和前后极性的原则方面发挥了重要作用, 并确定了关键膜相关的极性决定因素 (小 GTPases/CDC-42, 分区瑕疵的部)^5,6, 但它们依赖于唯一的对称折断提示 (芽疤, 精子进入) 和缺乏连接保护apicobasal 膜域和, 想必, 相应的胞内 apicobasal 分拣机械。然而, 我们目前对组织的极化贩运上皮的知识, 主要依赖于哺乳动物2D 单一⁷, 缺乏生理细胞外和发展的线索, 可以改变膜的位置贩运轨道的领域和方向 (从2D 到3D 的一个开关,在体外培养系统仅能在 MDCK (Madin-达比犬肾脏) 细胞中逆转膜极性)⁸。在体内无脊椎动物模型生物体的上皮极性的发育研究最初在扁平上皮中进行, 例如在果蝇表皮, 在那里他们确定了关键的贡献为极性细胞迁移和细胞板料运动的接合动力学⁹, 并且吞贩卖为极端维护¹⁰。3D体外和体内分析了 MDCK 细胞中管状上皮的腔内形态发生, 并分别在线虫肠道中, 最近确定了细胞内贩运的要求. 从头(心尖) 域和流明生物和定位^11,12,13。管状 (相对扁平) 上皮细胞的厚度是一个优势, 3D 分析的亚单位不对称, 因为它允许卓越的视觉区分顶端腔膜, apico 侧结, 侧膜, 和细胞器的位置。对于这些视觉优势, C. 线虫模型添加了体内设置、发育轴、透明度、人体计划的简单性、不变和定义的细胞谱系、分析 (遗传) 和下面描述的其他优点。

线虫本身是管状结构的蛔虫, 其透明和简单的结构使其同样管状的内部器官直接进入管和流明形态发生的可视化分析。它的肚腑的二十细胞 (偶尔地21或22个细胞)¹⁴从一个单一的祖细胞 (E) 获得, 并且从一个双层上皮发育成一个双侧对称的九 INT 环管 (四个细胞在第一圈;图 1示意图)^14,15,16。肠道的谱系和组织分析, 最初由 Nomarski 光学通过核身份¹⁷和随后通过荧光显微镜通过标记的膜, 提供了重要的洞察力的形态发生,特别是细胞自治和细胞自治的要求为它的定向细胞分裂和运动 (例如, 插层, 左不对称, 前和后管旋转)^14,18.早期胚细胞规范和基因调控网络控制该克隆模型器官的发育, 具有良好的特征^19,20。然而, 这里的重点是分析单管细胞中的极化膜和腔生物, 以及伴随这个过程的 endomembranes、骨架结构和细胞器的胞内不对称。这一分析是便利的简单的这一管, 所有顶端膜 (在超微结构的水平, 由绒毛) 面对的流明和所有基底膜面对外管表面, 与侧膜接触对方,由接合处与顶端膜分离 (图 1示意图; 为C. 线虫特定组织的紧密和黏着连接组件的参考 (^16,21)。顶端膜生物与腔内形态形成重合。此外, 成年小肠细胞的大小-这个小动物的最大的细胞 (除排泄细胞外)-近似哺乳动物细胞的大小, 允许在体内对亚单位元素的视觉跟踪,例如囊泡轨迹, 通常是在培养皿中尝试体外。

对于这种细胞和亚型分析的目的, 适当的标签是至关重要的。肠内-或等离子膜领域, 结, 骨架结构, 细胞核和其他亚细胞细胞器可以通过标记其特定的分子成分来可视化。许多此类组件已被定性并继续被发现 (表 1提供了几个示例并引用了资源)。例如, 不同的分子区分管状和/或水泡室的肠道膜系统, 从 ER 到高尔基通过后高尔基囊泡到等离子膜, 已被确定为²²。特定的蛋白质 (以及脂质和糖) 可以直接标记, 或通过结合蛋白间接。本协议侧重于原位固定标本的抗体染色, 这是两种标准标记技术之一 (参见排泄运河 tubulogenesis 的附文, 用于描述其他技术² -体内标记通过荧光蛋白融合-这是直接适用于肠道;Table2提供了一些肠道特异促进剂的例子, 可以用来驱动这种融合蛋白在肠道中的表达。双或多个标签的两种方法, 或结合额外的化学染色, 允许更大的 in-depth 视觉分辨率和检查的空间和时间的变化, 在共存和招募特定分子或亚细胞组分 (图 2)。本协议中描述的固定和染色程序支持在免疫过程中保存绿色荧光蛋白 (GFP) 标记。对于成像, 通过标准显微程序 (荧光解剖和共聚焦显微镜) 检测和表征 tubulogenesis 表型的关键点被描述(图 3, 4)。这些可以扩展到更高的分辨率成像方法, 例如超显微镜和透射电子显微镜 (这里没有描述)。

这个系统的一个关键力量是能够在不同发育阶段的个体细胞中分析极性, 从胚胎发育到成年。例如, 顶端膜领域和流明生物可以跟踪整个开发在单细胞水平通过标记与 ERM-1, 高度保守的膜肌动蛋白链接器的 Ezrin-Radixin-Moesin 家族^23,24.ERM-1 形象化顶端膜生物 (1) 在胚胎管形态发生时, 当它伴随极化细胞分裂和迁移 (细胞移动顶部在流明期间在插层期间)¹⁵;(2) 在晚期胚胎和幼体管延长期间, 在没有细胞分裂或迁移的情况下进行;和 (3) 在成人肠道, 在那里的极化膜域保持 (图 1)。在扩张的有丝分裂幼虫上皮, 从头极化膜生物因此可以从极化组织形态发生分离, 这是不可能在大多数 体内和体外上皮极性模型,包括具有单细胞分辨率的 (例如3D MDCK 囊肿模型⁸)。对于其他成分的标签, 这个设置提供了机会 (特别是在 L1 幼虫阶段, 当细胞具有较高的细胞质/核比), 以区分这些细胞内的变化是特定的极化膜生物 (例如重新定向贩运的轨迹), 使之与极化细胞分裂和迁移所需的同时进行。

遗传多样性的线虫是众所周知的²⁵, 并使它成为一个强大的模型系统的分子分析的任何生物问题。例如, 对形态发生的研究可以从一种野生型菌株开始, 这种转基因菌株的结构利益 (例如膜) 是用荧光标记标记的, 或者是有缺陷的功能突变体。结构.一个典型的反向遗传研究可能会产生一个突变体, 在系 (例如被目标删除) 中删除感兴趣的基因 (通常是产生点突变, 随之而来的损失、减少或增加功能的基因), 或者它的转录减少的 rna 干扰。在线虫²⁶中, 通过喂养方便地进行 rna 干扰, 还有助于设计有针对性的屏幕, 以检查更大的一组感兴趣的基因。一个遗传模型生物体可以说是最大的力量是能够进行在体内前向屏幕 (如诱变, 系统或全基因组的 rna 干扰屏幕), 允许公正的调查分子原因的表型兴趣.例如, 一个无偏的视觉线虫rna 干扰 tubulogenesis 屏幕, 开始与 ERM-1-labeled 顶端膜的转基因动物, 发现了一个有趣的可逆性肠道极性转换和异位腔表型, 使用这里是这类分析的一个例子。这个屏幕确定了糖的损耗 (GSLs; 强制膜脂质, 通过他们的生物合成酶鉴定) 和囊泡涂层的组分格和它的 AP-1 适配器作为特定分子瑕疵导致这个极性转换表型, 从而将这些贩运分子定性为在体内提示心尖膜极性和流明定位^12,13。当从特定的基因突变/形态发生表型开始时, 这样的屏幕 (或单一的基因/rna 干扰交互实验) 也可以检查两个或多个感兴趣的基因之间的功能相互作用 (参见随附的纸张排泄运河为这样分析的例子)²。该协议的重点是 rna 干扰, 除了它的能力, 以直接确定的基因, 其损失导致表型在前屏幕, 提供了具体的优势, 分析的形态发生。由于基因产物对形态发生的作用通常以剂量依赖性的方式起作用, 所以 rna 干扰通常是成功地生成了一个表型的频谱。产生信息性部分功能表型的能力也有助于解决大多数重要的 tubulogenesis 基因是必不可少的, 它们的损失导致不孕和早期胚胎致死的问题。该协议包括有条件的 rna 干扰策略, 以克服这一困难, 并建议的方法, 以优化生成更广泛的表型, 如位系列产生的突变。

研究方案

1。标记 C. 线虫 小肠

注意: 有关排泄管 tubulogenesis ² 用于组织特异性荧光标记物的分析, 请参阅所附文件质粒和转基因动物的产生, 包括讨论转录和转化融合蛋白 (后者需要的亚细胞定位的一个分子的兴趣)。这些程序可以通过使用特定的促进剂来驱动肠道中的分子来适应。请参见 表 1 , 以了解用于可视化 C. 线虫 肠道内和细胞膜及其连接的分子的示例, 表 2 以推动表达的例子, 在肠道,和 表 3 用于更全面地收集肠道标记物和促进剂的资源.

1. 抗体染色 C. 线虫 肠道 ^{27 28}
   1. 固定
      采取清洁的玻璃滑动, 使用聚 l-赖氨酸为蠕虫产生一个薄膜。放置30和 #181; l 0.1-0.2% 多聚 l-赖氨酸 在幻灯片上, 并在多聚 l-赖氨酸滴上放置第二张幻灯片, 以使 #34; 三明治和 #34;。然后轻轻地擦几下幻灯片, 使两个表面都湿润, 让它们风干30分钟. 用铅笔将幻灯片的磨砂面标签.
      注: 0.2% 聚 l-赖氨酸等分200和 #181; 我是由溶解粉末在 dH ₂ O;这可以存储在-20 和 #176; c. 使用高分子量聚 l-赖氨酸改善蠕虫的黏附。聚 l-赖氨酸的浓度也很重要。太低的浓度不会让蠕虫黏附, 但过高的浓度可能产生荧光背景信号。一部太厚的胶卷可能会全部松动.
      1. 将一个扁平金属块牢牢地放在容器的底部 (如: 聚苯乙烯容器), 装满液氮.
         注: 一个可以使用干冰代替, 但液氮使金属块更稳定的容器底部和发冷.
      2. 通过将蠕虫从他们的盘子中洗掉, 用 M9 ²⁹ 或选取不同的阶段蠕虫 (鸡蛋、L1、L2、L3 或 L4 幼虫阶段蠕虫) 到每张幻灯片上。通常, 选择〜100幼虫和 #160; 和胚胎或〜20成人每张幻灯片。放置10和 #181; 我把虫子洗到滑梯的中间, 或者把鸡蛋/虫子放到 10 #181; l M9 或10和 #181; l 1x PBS ²⁷ (磷酸盐缓冲盐水)。
         1. 使用吸管分散大量的蠕虫以避免结块.
            注: 由于拥挤和不同的阶段厚度, 混合的被冲刷的蠕虫的人口, 不黏附好并且是较少有效地冻裂 (参见下面), 因此采摘阶段特定蠕虫 (或同步的人口) 给卓越的结果。幼虫比成年人棒得多, 每张幻灯片可以放置更多的动物.
         2. 在将蠕虫移到幻灯片上之前, 将它们转移到 线虫生长培养基 (NGM) 板 ²⁹ , 而不 OP50 细菌。附着在蠕虫上的过量细菌也会干扰黏附。当心蠕虫不会干涸.
      3. 轻轻地放置 (放置) 22 毫米和 #215; 22 mm 片交叉在收集的蠕虫的顶部, 使其边缘在幻灯片的至少一侧挂起。轻轻地按下, 但牢牢地用一两个手指片。避免剪切会损害组织的完整性.
      4. 立即轻轻地将滑块移至液态氮气中的金属方块, 并让它坐约5分钟即可冻结。然后, #34; 挥 #34; 片在一个快速移动通过使用悬垂边缘.
         注意: 这一步必须果断地完成, 而幻灯片被冻结, 以达到和 #34; 开裂和 #34; 角质层。注意: 使用液氮时, 请遵循 PPE (个人防护设备) 指南.
      5. 将冻结裂纹的幻灯片浸入到 甲醇 填充的玻璃 Coplin 罐中, 在-20 和 #176 中为5分钟;然后转移到一个 丙酮 填充玻璃 Coplin 罐为另5分钟, 在-20 和 #176; C.
         注: 甲醇和丙酮应贮存在-20 和 #176; C 至少在使用前30分钟。在固定后, 幻灯片可以存储在-20 和 #176; 注意: 甲醇和丙酮是有毒的.
      6. 从 jar 中取出幻灯片, 并在使用前使其在室温 (RT) 中风干.
   2. 着色
      1. 环绕固定蠕虫区域, 幻灯片上有一层薄薄的凡士林。在幻灯片底部的该区域周围绘制一个圆圈以标记该点.
         注意: 重要的是, 果冻圈保持完整的染色程序, 以防止泄漏的染色解决方案.
      2. 准备 #34; 湿室和 #34; 在带有盖子的塑料桶中放置湿纸巾。将幻灯片放在 #34 的机架上; 湿室和 #34; 防止在染色过程中滑滑梯的干燥.
         注: 幻灯片不应与水或彼此接触.
      3. 轻轻吸管大约50和 #181; L 1x PBS 进入果冻圈, 足以覆盖该地区。关闭 #34; 湿室和 #34; 盖子在 RT 中孵育5分钟
         注意: 为了避免在这一步失去蠕虫, 不要将 PBS 直接移到蠕虫上。轻轻地将吸管尖端放在圆的边缘, 让液体平滑地分散在蠕虫上.
      4. 倾斜幻灯片并用吸管缓慢地吸入 PBS。将幻灯片向后平放到机架上, 并添加50和 #181; L (或所需的金额以覆盖现场) 阻止解决方案 仔细。在 RT 的潮湿室内孵育15分钟。在等待时, 稀释阻断溶液中的主要抗体 (请参阅 材料表 中的主要抗体和浓度的例子).
         注意: 使用 1x PBS (10 毫升)、10% 吐温 (50 和 #181; L) 和奶粉 (0.2 克) 的新鲜制备堵塞液。洗涤剂的数量和牛奶的浓度可能因所使用的抗体而异, 可能需要根据经验确定。从滑梯吸出的液体是容易失去蠕虫的又一步骤。检查在解剖范围下的幻灯片的进度, 但要注意幻灯片不会变干.
      5. 倾斜幻灯片并使用上述相同的预防措施来抽离阻塞解决方案。将幻灯片向后平放到机架上, 然后慢慢地添加50和 #181; 使用相同的预防措施稀释主抗体。关闭和 #34; 湿室和 #34; 孵育在4和 #176; C 夜间或在 RT 上较短的时间.
         注意: 潜伏期可能需要对特定抗体进行经验测定.
      6. 吸掉 主抗体解决方案 , 如其他解决方案所做的那样。然后用阻塞解决方案清洗幻灯片10分钟, 3 次, 添加和删除解决方案的方式与上面描述的相同.
      7. 添加 辅助 (荧光标记) 抗体 在阻塞溶液中稀释, 在 RT 处孵育1小时。有关次要抗体和浓度的示例, 请参见 材料表 .
      8. 移除二次抗体并清洗, 如上所示, 与阻塞解决方案2次, 并清除堵塞解决方案, 与 1x PBS, 每10分钟.
      9. 将尽可能多的 PBS 吸走, 而不允许标本晾干, 并小心地除去标本周围的果冻.
      10. 添加一滴 安装介质 到标本上, 并把片轻轻放在上面。用指甲油封住片的边缘。将幻灯片放在深色的幻灯片框中, 以保存着色并存储在4和 #176; C.
          注意: 由于光线敏感 (荧光可能随着时间的推移而褪色) 并防止空气暴露, 由于同样的原因, 在黑暗中保持幻灯片。幻灯片可在4、#176、c 或-20、#176 等长时间内存储; c.

2。在 线虫 肠道中对基本 tubulogenesis 基因功能的干扰。示例: rna 干扰.

注意: C. 线虫 根据标准协议 29 ^{在 NGM 板上播种的 OP50 细菌上培养的菌株。对于 rna 干扰, C. 线虫 在 HT115 上以25和 #181 为补充, 以 rna 为原料, 以羧和2毫米 IPTG (异丙 beta-D-1-thiogalactopyranoside) 为诱导细菌启动剂, 生成双链 RNA (dsRNA) 从介绍的 C. 线虫 基因。抗生素和 IPTG 浓度可能会因 rna 干扰克隆/库和所需的 rna 干扰强度而变化. 特定的 rna 干扰克隆可以从商业上可用的基因组范围内的 rna 干扰喂养库获得 (请参见 26 , 30 , 31 ) 为在 C. 线虫 和 材料表中的材料/试剂和 rna 干扰库中的 rna 干扰提供背景.}

1. 通过喂养的标准 rna 干扰 ^{26 , 31}
   1. 从-80 和 #176 中取出 rna 干扰库板, 然后放在干冰上。取下密封胶带, 使用无菌吸管末端将感兴趣的克隆的附着细菌转移到 LB (Luria 肉汤) 琼脂板 ²⁹ 补充100和 #181; g/毫升氨苄西林和15和 #181; g/毫升四环素。细菌在琼脂板上的条纹。用新的密封胶带封住 rna 干扰库板。在37和 #176 的夜间生长细菌; C.
      注意: 这些琼脂板可以储存在4和 #176; C 几个星期。新的细菌可以直接培养, 以保护原始的 rna 干扰库.
   2. 第二天, 将从 lb 琼脂平板上接种的干扰物细菌, 放入1毫升 lb 液体培养基 ²⁹ 包含50和 #181; 每毫升氨苄青霉素, 分别为 14 (8-18) h 或隔夜在37和 #176 晃动; C.
      注: 为了获得最佳效果, 每次使用新鲜细菌。请参见参考 ( ³⁰ ), 以比较不同的区域性条件 ( 例如, 区域性的 时间).
   3. 第二天, 种子200和 #181; 每克隆在分离的 rna 干扰板上培养的 rna 干扰细菌。让盘子晾干, 在室温下过夜, 以诱导细菌启动剂.
   4. 将 4-6 L4-stage 幼虫转移到每个 rna 干扰板上。在 RT 或22和 #176 上孵育种子的 rna 干扰板; C 3-5 天.
      注意: 选择 L4 幼虫首先到一个 NGM 板上没有细菌, 以消除粘附的 OP50, 将干扰 rna, 或串行转移到一个新的 NGM 板没有 OP50 三倍。确保菌株不被污染, 因为污染细菌的 OP50 喜欢的食物, 也会干扰 rna。根据需要调整温度: 例如 以更高的温度加速发展;菌株可能是温度敏感.
   5. 为发展研究, 检查 F1 后代的表型从2天起.
      注意: 在开发过程中评估极化膜生物时, 经常检查动物以避免丢失表型 ( 例如 标记位移) 的外观或进展是至关重要的。富 F2 人口为强的表型 ( 例如 通过采摘父母雌雄同体到新的 rna 干扰板在天2选择为他们的后裔的最强烈受影响的中间部分) 很少是必要的, 因为光谱从温和到强表型是可取的.
2. 条件性干扰
   注意: 可以对干扰条件进行修改, 以减少严重, 或增加轻度影响, 或干预阶段-具体; 修改有助于对表型效果进行全面评估致命的 tubulogenesis 基因。
   1. 幼虫干扰-在同一世代 (轻度、特定阶段的 rna 干扰) 中对 rna 效应的评估
      注: 为了克服不育或胚胎的致命性, 或扰乱基因功能在特定阶段后胚胎发生, rna 诱发幼虫, 后 embryonically。要么安置未处理的蛋 (2.2.1.1), 怀孕的成人 (2.2.1.2) 或同步 L1 (或, 如果需要, 最新阶段) 幼虫 (2.2.1.3) 在 rna 干扰板;评估在同一世代的 rna 干扰效应, 例如 在幼虫和/或成人的两天后和以后。
      1. 将30-50 个妊娠成虫放入一滴 漂白溶液 (a 1: 4 溶液 10 M 氢氧化钠和家用次氯酸钠) 置于 rna 干扰板的边缘。让干燥, 使 L1s 孵化和移动到细菌的草坪.
         注意: 漂白溶液, 一般用于去污, 将杀死一切, 但胚胎在其蛋壳。因此, 不要将漂白溶液置于或接近于 rna 干扰的细菌上.
      2. 在 rna 干扰板上选择或播种 ~ 20 年轻的妊娠成虫, 让他们产卵2-3 小时, 或直到有约300鸡蛋在盘子上, 然后摘下成人.
         注: 该方法可引起 OP50 的干扰。为了减少这种风险, 首先将成人转移到无细菌的 NGM 板上, 以去除 OP50 附着在蠕虫上的病毒。注意, 成年人不要在 rna 干扰板上停留太久, 以免对胚胎产生 rna 干扰作用.
      3. 将 L1 阶段蠕虫直接放在 rna 干扰板上 (参见参考 ( ²⁹ )-用于同步协议).
         注意: 可以使用缩写的同步协议 ( 例如 进行适度的大规模设置), 方法是从人口稠密的 M9 中清洗蠕虫数次, 直到只剩下鸡蛋。之后, 2-3h 孵化 L1s 可以收集在 M9 从这些板块, 清洗额外的洗涤清除细菌 (3x 在 M9), 并播种到 rna 干扰板.
   2. 使用空的矢量 rna 干扰细菌 (轻度的 rna 化) 来稀释 rna. 注意: 减少 dsRNA 的数量, 通过稀释大量的 rna 干扰细菌, 可以引起更温和的效果, 也可以减少胚胎的杀伤力。不废除所有的胚胎效应对 rna 干扰细菌的稀释也用于双 rna 干涉实验和滴定条件的遗传相互作用实验 ( 例如 , 以产生轻微的效果评估的增强和强大的影响评估抑制)。
      1. 长大后的 rna 干扰和 em在 1 ml LB 培养基中与50和 #181 的 HT115 rna 干扰细菌, 如标准的 rna 处理条件下所做的 g/毫升氨苄西林.
      2. 用空的矢量 rna 干扰细菌来稀释 rna, 以达到不同浓度的范围, 例如5%、15%、30%、50%、70%。移上下混合细菌。吸管200和 #181; 我把细菌混合到一个 rna 干扰板上.
      3. 在每个 rna 干扰板上选取 4-6 L4 幼虫。从2天开始检查表型.
   3. 干扰敏感菌株 (强干扰)
      1. 使用可用的具有 rna 干扰敏感性的菌株, 例如, eri-1 (mg366)、rrf-3 (pk1426) 或 eri-1 (mg366) lin-15B (n744) (后者敏感), 并遵循标准的干扰程序描述在 2.1 ^{31 , 32 , 33} 。 注意: rna 干扰敏感菌株 ( 如 rrf-3 和 eri-1 ) 可能比野生型动物的育雏规模小, 并在25和 #176 无菌; C。他们也可能有自己的表型的低背景, 例如 低渗透胚胎的杀伤力, 在评估特定的 rna 干扰作用时必须考虑到.

3。 在体内 通过荧光解剖显微镜对 C. 线虫的肠道进行成像

在荧光光下可视化动物之前, 在任何解剖显微镜下, 在明亮的光线下检查 rna 干扰板。评估 (并有可能记录) 表型可见在明亮的光线下可能影响分析, 如致命性, 不育 (后裔数量较少), 发育 ( 例如 和 #160; 幼虫逮捕) 和其他可见的表型, 可能有助于描述了一个涉及极化膜生物和腔内形态发生的基因的功能.
注: 只有有足够的后代进行评估 (至少 50) 的分数, 否则尝试其他干扰条件。为了定量评估, 确保盘子不会被污染或生长 OP50 (干扰 rna).
1. 在荧光光下可视化动物, 取下盖子, 直接在解剖荧光显微镜下放置 rna 干扰板.
   注意: 为了检测微妙的肠道表型, 你将需要一个解剖显微镜与更高功率立体声荧光附件, 允许足够的范围放大。此协议描述了一个范围的使用, 它具有1.5 和 10 x 目标, 缩放范围从3.5 到 45.
2. 首先在明亮的光线下发现动物集中。接下来, 使用适当的过滤器, 在低放大率下 ( 例如 在1.5x 目标下) 在荧光灯下检查动物。系统检查板从左上到右下到扫描整个板块的表型.
3. 选择感兴趣的动物并更改为10x 目标。重点在肠道和使用变焦评估 tubulogenesis/流明形态发生表型。见5节表型评分。首先, 在低放大率下拍摄图像。然后切换到高倍放大倍数.
   注意: 由于健康动物动作快, 工作迅速, 一只手在电脑鼠标的图像采集, 同时聚焦显微镜与另一只手。在大多数被逮捕的胚胎和早期幼虫中使用 tubulogenesis 表型时, 可能不需要减慢动物 (例如, 通过瞬态放置板到4和 #176; C)。这些图像可以通过显微镜安装的 CCD 摄像机和图像采集软件来捕获.

4。通过激光扫描共聚焦显微镜对 C. 线虫 小肠进行高分辨率成像 ^{34 35}

1. 安装和固定
   使用指尖稀疏地将少量的油脂或凡士林放在玻片上的圆圈上 (直径为6-8 毫米).
   注: 油脂圈的厚度对安装至关重要。为了得到最佳的成像效果, 一次只用一个或几个幼虫, 并使用尽可能少的液体的超薄油脂圈, 使动物直接粘在玻片和盖板之间 (如果做得完美, 动物将被固定, 没有麻醉剂)。鸡蛋和较旧的动物的安装需要一个较厚的圆圈, 以避免破坏样品时, 增加盖滑移.
   1. 添加一滴通常3.5 和 #181; L 10 mM 叠氮化钠溶液 进入圆的中间, 并在解剖显微镜下将蠕虫带入它.
      注意: 在1和 #160 中溶解65.01 毫克 NaN3, 制备1米叠氮化钠溶液; ml dH ₂ O;添加200和 #181; 此1M 和 #160 的 L; 解决方案为 20 mL M9 缓冲区。将蠕虫迅速放入叠氮化钠溶液中, 避免溶液干燥。挑选阶段分开为最佳的装载, 瞄准大约50胚胎每张幻灯片和大约20幼虫, 当检查更大的人口时。在采摘胚胎时, 可以使用 M9 代替叠氮化钠溶液。如果使用叠氮化钠, 动物必须在30分钟内成像, 以避免这种有毒化学物质的组织损伤.
      注意: 叠氮化钠是有毒的.
   2. 轻轻地放置一个22毫米和 #215; 22 毫米片在幻灯片上。小心别把虫子碾碎了。在解剖显微镜下使用轻度压力和检查, 确保蜗杆在滑动和盖板之间固定好。为幻灯片添加标签.
      注: 正确的压力是至关重要的, 以避免损坏标本 (太多的压力), 而不是固定好 (太小的压力: 动物漂浮而不是坚持幻灯片)。漂浮动物基本上排除了适当的成像.
2. 图像
   1. 在共焦显微镜下放置幻灯片。搜索具有10x 目标和焦点的蠕虫.
      注意: 在可能的地方使用亮光以避免漂白.
   2. 更改为60x 或100x 目标并将焦点放在肠道上.
      注意: 在明亮的光线下, 肠道可以很容易地通过它的流明在动物中间运行, 从咽到肛门靠近尾巴尖端。为60x 或100x 油目标应用机油时要小心。混合不同类型的油可能会干扰进一步的成像。当使用垂直显微镜或使用倒置范围时, 将少量的油放在幻灯片上, 注意不要污染其他目标或显微镜的某些部分.
   3. 建立科勒 DIC/Nomarski 照明, 以便用于扫描 ³⁶ 。在萤光灯下用适当的通道检查动物的肠道标记和/或检查表型, 以便选择合适的标本进行成像。工作迅速, 以避免漂白.
   4. 切换到激光扫描, 通过设置其背部和腹侧的扫描边界来限制潜在的图像到肠道.
      注意: 如果荧光也在肠道外贴上标签, 那么以这种方式包围肠道是至关重要的。在这个试点扫描, 工作与快速扫描条件的 av老漂白.
   5. 停止扫描以选择实验的扫描参数。设置6-20 部分, 用于沿 z 轴进行肠道扫描, 例如 在0.2 和 #181; m 间隔, 取决于询问、动物阶段和/或技术考虑。根据标签的复杂程度和需要的分辨率来设置帧平均每幅图像以减少噪音.
      注: 设置细节因显微镜和实验而异。如果对三不同的荧光进行顺序扫描, 则可能需要减少部分的数量以避免漂白。将帧数调整为节数 (应小于节数, 以避免图像失真; 也称漂白增加)。4-6 帧通常是足够的.
   6. 返回到扫描与确定 (慢) 激光扫描条件和调整: 亮度 (使用最小增益减少背景); 激光功率 (尽可能高的要求, 尽可能低-增加漂白; 通常最小设置是足够的);针孔 (避免打开, 如果不需要, 保持分辨率).
      注意: 扫描条件取决于样本, 需要在扫描会话开始时进行经验确定。确保亮度不超过饱和度 (将限制图像随后通过成像软件进行修改的能力)。在设置扫描条件时, 也要考虑到所有的成像实验都必须使用相同的条件来比较实验动物和对照.
   7. 捕获图像系列。将图像合并到单个投影图像中.
      注意: 可能需要根据显微镜单独保存投影图像和/或叠加.
   8. 当采用多通道图像时, 使用顺序扫描来避免通道之间的出血 (对共存研究至关重要)
      注意: 如果增加的漂白连接到更长的扫描时间, 则可能需要更改图像设置.
   9. 总是获得相应的 DIC/Nomarski 图像 (剖面) 的地标和整体状态的扫描动物的形态学.

5 。极化膜生物缺陷的定量化在 线虫 小肠中的作用

注意: 示例: let-767 引起的心尖 ERM-1::GFP 和异位侧腔形成的侧移位和 aps-1 rna 干扰.

1. 在解剖显微镜下评分表型 ( 图 5 A, D, E)
   1. 为评分定义类别。例子: (i) 狂放类型 (ii) 侧位移 ERM-1::GFP (极性瑕疵) 和 (iii) 异位流明形成 (以后开发侧位移).
      注: 低放大度的视觉分析可以为有或没有特定表型的动物评分。在这里, 我们选择了一个三定性不同表型的例子, 同时也表明了分析的极性表现型的恶化。然而, 可以评分不同的定性和定量表型, 如流明形态缺损, GFP 阳性细胞质液泡的缺席/存在 (或数), 流明直径和 intralumenal 囊肿的大小或数量 (见强类 = "xfig" > 图 3 示例)
   2. 根据预期差异的大小, 在解剖显微镜下, 在一组重复或三遍实验中, 在其琼脂板上约有100活蠕虫得分.
      注: 在扫描板系统时, 必须对每种进入视图的动物进行评分, 例如 从板的左上角到右下角 (确保蠕虫均匀地填充板).
   3. 对3独立的实验组重复此操作。生成条形图并评估结果的重要性.
2. 在共焦显微镜下评分表单 ( 图 5 B)
   1. 为评分定义分类, 每个动物的异位流明数 注: 放大倍数视觉分析可以为每种动物评分一个可量化的标记或表型, 并允许通过解剖显微镜而不能辨别的亚细胞标记的评分。目前的例子计数异位流明每动物在早先被评估的同一个实验的蠕虫子集 (5.1.1, 类别 3) 提炼对恶化的极性表型的评估在这里被审查。但是, 可以对其他表型或参数进行评分, 例如 囊泡的数目、存在/缺席或 co-localize 的亚细胞组分数量、荧光强度 (后者由 ImageJ 量化; 参见排泄管) ² .
   2. 根据预期差异的大小, 在共聚焦显微镜下的一组重复或三个实验中, 在大约20动物中量化表型标记 (这里为异位流明).
   3. 重复3独立的实验集。生成条形图并评估结果的重要性.

结果

该协议描述了如何分子分析和可视化极化膜生物和流明形态发生在线虫肠道, 在单细胞和亚细胞水平。二十细胞单线虫小肠是由细胞分裂和迁移过程中形成的中期胚胎。在这个时候, 极化膜领域成为建立, 但de 从头极化膜生物继续在成熟, 但扩大上皮整个四幼体阶段, 直到成年, 允许集中分析极化膜生物 (图 1A)。

讨论

本协议描述了如何将标准的功能遗传/rna 干扰和成像 (标记和显微) 方法结合起来, 利用线虫小肠上皮作为体内的视觉和分子解剖模型偏光膜和腔生物。

标签

本协议着重于抗体染色。原位抗体标记是一种高度特定的替代方法, 通过荧光融合蛋白 (在排泄管膜生物的附文中描述)²。虽然抗体染色不允许活体成?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Tween	Fisher Scientific	50-213-612
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Powdered milk	Sigma	MT409-1BTL
Primary antibodies
MH27 (mouse)			Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
MH33 (mouse)			Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
anti-ICB4 (rabbit)			Concentration: 1:5 Resources: A gift from Mario de Bono (Medical Research Council, England)
anti-PAR-3 (rabbit)			Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)
Secondary antibodies
Alexa Floor 568 (anti-rabbit)	ABCam	AB175471	Concentration: 1:200
Cy5 (anti-mouse)	Life technologies	A10524	Concentration: 1:200
TRITC (anti-rabbit)	Invitrogen	T2769	Concentration: 1:200
FITC (anti-mouse)	Sigma	F9006	Concentration: 1:100
Labeled chemicals
Texas Red-Phalloidin			Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471
Materials
Vacuum Grease Silicone	Beckman	335148
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
C. elegans related			see reference29 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates			see reference29 for protocols.
Tryptone	Acros Organics	611845000
Yeast Extract	BD Biosciences	212750
NaCl	Sigma	S7653
Bacto Agar	BD Biosciences	214040
Ampicillin	Sigma	A0116
Tetracycline	Fisher Scientific	BP912
M9 Medium			see reference29 for protocols.
NaCl	Sigma	S7653
KH2PO4	Sigma	P0662
Na2HPO4	Sigma	S7907
MgSO4	Sigma	M2773
NGM plates			see reference29 for protocols.
NaCl	Sigma	S7653
Peptone	BD Biosciences	211677
Tryptone	Acros Organics	611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	214040
MgSO4	Sigma	M2773
CaCl2	Sigma	C3881
Cholesterol	Sigma	C8667
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
RNAi plates			see reference30 for protocols.
NaCl	Sigma	S7653
Peptone	BD Biosciences	211677
Tryptone	Acros Organics	611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	214040
MgSO4	Sigma	M2773
CaCl2	Sigma	C3881
Cholesterol	Sigma	C8667
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
IPTG	US Biological	I8500
Carbenicillin	Fisher Scientific	BP2648
NaOH	Fisher Scientific	SS266-1
Sodium hypochlorite	Fisher Scientific	50371500
Bacteria
OP50 bacteria	CGC
HT115 bacteria	CGC
Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50)	Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51)	Source BioScience
Imaging related
Sodium azide	Fisher Scientific	BP9221-500
Equipment
dissecting microscope	Nikon	SMZ-U
dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions)	Olympus	SZX12
Laser-scanning confocal microscope	Leica Microsystem	TCS SL
laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope	Nikon	C2