C. elegans кишечника как модель для межклеточных люмен морфогенеза и In Vivo поляризованной мембраны биогенеза на уровне одной ячейки: маркировка Пятнать антитела, RNAi потери функции анализа и обработки изображений

Резюме

Прозрачный C. elegans кишечника может служить в качестве «в vivo ткани палата» для изучения apicobasal мембраны и Люмене биогенеза на одну ячейку и субклеточном уровне во время многоклеточных tubulogenesis. Этот протокол описывает, как сочетать стандартные маркировки, потеря функции генетических/RNAi и микроскопических подходов к вскрыть этих процессов на молекулярном уровне.

Аннотация

Мультиклеточные трубы, базовых единиц всех внутренних органов, состоят из поляризованные эпителия или эндотелиальных клеток, верхушечный мембран подкладки люмен и базолатеральной мембраны, связавшись с друг друга и/или внеклеточного матрикса. Как эта асимметрия отличительные мембрана создана и поддерживается в течении морфогенеза орган все еще нерешенный вопрос о клеточной биологии. Этот протокол описывает C. elegans кишечника как модель для анализа биогенеза поляризованной мембраны при морфогенеза трубки, с упором на апикальной мембраны и Люмене биогенеза. C. elegans однослойные двадцать клеток кишечного эпителия аранжирован в простой на двусторонней основе симметричных трубки, позволяющих анализ на уровне одной ячейки. Поляризацию мембраны происходит одновременно с поляризованными деление клеток и миграции в раннем эмбриогенезе, но de novo поляризованных мембраны биогенеза продолжается в течение всего роста, когда клетки больше не размножаются и двигаться. Последняя настройка позволяет отделить субцеллюлярные изменения, которые одновременно посредником эти различные поляризационные процессы, трудно отличить в большинстве моделей полярности. Верхушечный, базолатеральной мембраны-, соединительной-, цитоскелета- и endomembrane компонентов может быть помечены и отслеживается GFP синтез белков на протяжении развития или оценены в situ Пятнать антитела. Вместе с организма генетических универсальность C. elegans кишечника таким образом обеспечивает уникальный в vivo модель для визуального, развития и молекулярно генетический анализ поляризованной мембраны и биогенеза трубки. Конкретные методы (все стандартные) описанные здесь включают как: этикетка кишечных субцеллюлярные компоненты путем пятнать антитела; анализ генов, участвующих в поляризованной мембраны биогенеза исследования потери функции адаптированы к обычно основные tubulogenesis генов; оценить полярности дефектов на разных этапах развития; интерпретировать фенотипов эпифлуоресцентного, дифференциальной помехи контраст (ОПК) и confocal микроскопии; определить дефекты. Этот протокол может быть адаптирована для анализа любого из зачастую весьма сохранены молекул, участвующих в эпителиальных полярности, мембраны биогенеза, трубки и Люмене морфогенеза.

Введение

Поколение клеточном и субклеточном асимметрии, таких как формирование поляризованной мембраны доменов, имеет решающее значение для морфогенеза и функции клеток, тканей и органов¹. Исследования на поляризованной мембраны биогенеза в эпителия остаются технической проблемой, поскольку направленного изменения в распределении субцеллюлярные компоненты зависят от нескольких подряд и совпадающих внеклеточные и внутриклеточных сигналов, которые трудно отделить в большинстве моделей и сильно зависят от модели системы. Модели представленные здесь - однослойная Caenorhabditis elegans кишечника - это ткани изысканная простота. Вместе с одной ячейкой C. elegans выделительной канал (см. сопроводительный документ на поляризованной мембраны биогенеза в C. elegans выделительной канал)², он предоставляет несколько уникальных преимуществ для идентификации и характеристика молекулы, необходимые для биогенеза поляризованной мембраны. Сохранению молекулярных полярности сигналы от дрожжей человеку сделать этот простой беспозвоночных орган отлично «в vivo ткани палата» на вопросы об эпителиальных полярности которые имеют непосредственное отношение к системе человека, который до сих пор слишком комплекс для обеспечения визуального рассечение этих событий на сингл ячейки уровня в естественных условиях.

Хотя несколько сохранившихся полярности сигналы от матрица (1 extracelluar, (2 плазматической мембраны и его узлов и (3) внутриклеточных везикулярного людьми были определены³, основополагающие принципы их интеграции в процессе Поляризованные эпителиальных мембраны и ткани биогенеза является плохо понимали⁴. Модели классических одноклеточных в vivo (e.g.S. cerevisiae и C. elegans зиготы) играют важную роль в определении принципов поляризованные деление клеток и передней задней полярности и определили критических связанный мембранами полярности детерминанты (небольшой GTPases/CDC-42, разметка дефектных PARs)^5,6, но они зависят от уникальных симметрии сигналы (бутон шрам, спермы запись) и отсутствие безопасного соединения apicobasal мембраны домены и, предположительно, соответствующий внутриклеточных apicobasal, сортировка машин. Наши текущие знания о организации поляризованные оборота эпителия, однако, главным образом опирается на млекопитающих 2D монокультур⁷, которых недостает физиологических внеклеточные и развития сигналы, которые могут изменить позиции мембраны домены и направления торговли людьми траекторий (переход от 2D к 3D в vitro системах культуры только достаточно поменять полярность мембраны в клетках MDCK (Мадин-Дарби собак почек))⁸. В естественных условиях развития исследования по эпителиальных полярности в беспозвоночных модельных организмов первоначально проводились в плоского эпителия, например в эпидермисе Drosophila melanogaster , где они выявили решающий вклад Джанкшен динамики миграции поляризованные ячейки и ячейки листа движения⁹и endocytic торговли полярности обслуживания¹⁰. 3D в пробирке и в естественных условиях анализа люмен морфогенеза в трубчатых эпителия в MDCK клетках и в C. elegans ЖКТ, соответственно, недавно определили требования внутриклеточных людьми для де Нову (верхушечно) домен и биогенеза люмен и позиционирования^11,12,13. Толщина от трубчатые (по сравнению с плоским) эпителиальных клеток является преимуществом для 3D анализа субцеллюлярные асимметрии так как он позволяет улучшенные визуальные различия верхушечно lumenal мембрану, apico боковое развязок, боковые мембраны и позиции внутриклеточных органелл. Эти визуальные преимущества, в C. elegans модель добавляет параметр в vivo , развития оси, прозрачность, простота план тела, инвариантные и определенных клеток линии, аналитический (генетических) и дополнительные преимущества, описанные ниже.

C. elegans сам является аскариды трубчатой структуры, чьи прозрачности и простая архитектура сделать его также трубчатые внутренних органов непосредственно доступными для визуального анализа трубки и Люмене морфогенеза. Двадцать клетки его кишечника (по случаю 21 или 22 клетки)¹⁴ являются производными от одного прародителя ячейки (E) и развиваются из эпителия двуслойная путем интеркаляции шаг в двустороннем симметричные трубку девяти INT колец (четыре клетки в первое кольцо; Рис.1 схема)^14,,1516. Кишечника тканей и линии анализ, первоначально определяется Номарски оптики через ядерных тождества¹⁷и впоследствии микроскопии флуоресцирования через обозначенные мембран, оказывает критическое понимание его морфогенеза, в частности клеток автономной и клеток неавтономной требования к его направленного клеточных делений и движений (например, интеркаляции, справа слева асимметрии, передняя и задняя труба вращения)^14,18 . Ранние эндодермы клеток спецификации и гена регулирования сети, контроль развития этого органа клоновых модели являются хорошо характеризуется^19,20. В центре внимания здесь, однако, находится на анализе поляризованной мембраны и биогенеза Люмене в одиночных клетках трубчатых и внутриклеточных асимметрий endomembranes, цитоскелета структур и органеллы, которые сопровождают этот процесс. Анализ способствует простота этой трубки, где все апикальной мембраны (на ультраструктурные уровне отличается микроворсинки) сталкиваются просвета и все базальной мембраны торцевые поверхности наружной трубы, с боковой мембраны связаться друг с другом, отделенный от апикального мембраны развязок (схемарис 1 ; см. ссылки (^2116,) для C. elegans-конкретной организации туго и adherens соединения компонентов). Апикальном мембрана биогенеза таким образом совпало с люмен морфогенеза. Кроме того размер взрослых клеток кишечника - крупнейший клетки этот зверек (с исключением выделительной ячейки) - примерный размер клеток млекопитающих, позволяющие в vivo визуального отслеживания субцеллюлярные элементов, например везикул траектории, которые обычно является попытка в пробирке в культуры блюдо.

Для целей данного анализа клеточном и субклеточном соответствующие маркировки имеет решающее значение. Кишечные Эндо - или плазматической мембраны домены, перекрестки, цитоскелетаструктуры, ядер и других внутриклеточных органелл могут быть визуализированы, снабдив их конкретные молекулярные компоненты. Многие такие компоненты были и продолжают быть обнаружены (Таблица 1 дает несколько примеров и относится к ресурсам). Например различные молекулы, отличающие трубчатых или везикулярного отсеков кишечных endomembrane системы, от ER Гольджи через пост Гольджи везикулы в плазматической мембране, были определены²². Конкретные белки (а также липиды и сахара) может либо быть помечены прямо или косвенно через привязки белков. Этот протокол посвящен в situ антитело пятная фиксированной образцов, один из двух стандартных методов маркировки (см сопроводительный документ на выделительную канал tubulogenesis для описания других техника² - в естественных условиях маркировки через флуоресцентный протеин сплавливания - которые непосредственно применимо к кишечника; Таблица 2 примеры кишечника конкретных промоутеров, которые могут использоваться для привода выражение такого синтеза белков в кишечнике). Двух - или несколько маркировки с любой подход, или сочетанием обоих плюс дополнительные химические окраски, позволяет более углубленного визуальные резолюции и изучение пространственных и временных изменений в совместно локализации и набор конкретных молекулы или внутриклеточных компонентов (Рисунок 2). Фиксации и окраски процедуры, описанные в этом протокол поддержки сохранения зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) маркировки во время процедуры иммуноокрашивания. Для изображений, ключевые точки обнаружения и характеристика tubulogenesis фенотипов через микроскопические стандартных процедур (рассечения и конфокальной микроскопии флуоресцирования), описалРисунок 3, 4 (). Это может распространяться на более высокое разрешение изображений подходы, для экземпляра сверхразрешение микроскопии и передачи электронной микроскопии (здесь не описывается).

Сила ключа этой системы является способность анализировать полярности в отдельных ячейках на разных этапах своего развития, от эмбриогенеза до зрелого возраста. Например домен и Люмене биогенеза апикальном мембрана может отслеживаться на протяжении развития на уровне одной ячейки через маркировки с ERM-1, высоко сохранены мембраны актина компоновщика Эзрин-Radixin-Moesin семьи^23,24 . ERM-1 визуализирует биогенеза апикальной мембраны (1) во время эмбрионального трубки морфогенеза, когда это происходит параллельно с поляризованными деление клеток и миграции (клетки передвигаться вершине люмен во время интеркаляции)¹⁵; (2) во время позднего эмбриональных и личинок трубки расширение, которое продолжается в отсутствие деления клеток или миграции; и (3) в кишечнике взрослых, где поляризованной мембраны домены поддерживаются (рис. 1). В эпителии расширения после митотическая личиночной de novo поляризованной мембраны биогенеза таким образом может быть отделена от поляризации ткани морфогенеза, что невозможно в большинстве моделей эпителиальных полярности в vivo и in vitro , числе с одной ячейкой резолюции (например 3D MDCK кисты модель⁸). С маркировка для других компонентов, этот параметр обеспечивает возможность (особенно на L1 личиночной стадии, когда клетки имеют более высокий коэффициент цитоплазме/ядро) отличить эти внутриклеточные изменения, которые являются специфическими для поляризованной мембраны биогенеза ( например переориентации торговли людьми траекторий) от тех сопутствующе обстоятельств необходимых для поляризованные деление клеток и миграции.

Генетическая универсальность C. elegans хорошо известно²⁵и делает его мощная модель системы для молекулярного анализа любых биологических вопрос. Исследование на морфогенеза, например, можно начать с одичал тип деформации, трансгенных штамм, где структура интереса (например мембраны) помечается с флуоресцентных маркеров, или потеря получить из функции или мутант с дефектом в этом структура. Типичный обратный генетическое исследование может генерировать мутант, где удаляется гена интереса в микрофлорой (например , целевых удаления), изменена мутагенез (обычно производит точечные мутации с последующей потерей, сокращение или увеличение функции гена) или где его транскрипт уменьшается на РНК-интерференции. Простота RNAi кормления в C. elegans²⁶ также поддается разработке целенаправленных экранов, которые изучить более крупной группы генов интерес. Возможно сильной генетической модели организма является способность поведения в естественных условиях вперед экраны (например мутагенеза, систематических или геном общесистемной RNAi экраны), разрешающие расследование беспристрастной молекулярных причина фенотип интерес. К примеру, беспристрастной visual C. elegans RNAi tubulogenesis экран, начиная с трансгенных животных с ERM-1-меченых апикальной мембраны, обнаружили интригующий реверсивные кишечных полярности преобразования и внематочная люмен фенотип, используемые Здесь в качестве примера для этого типа анализа. Этот экран истощение гликосфинголипиды (GSLs; облигатные мембранных липидов, выявленных через их GLS-биосинтетических ферментов) и компоненты Клатрин пальто везикул и его AP-1 адаптер названы конкретные молекулярные дефекты, вызывая этом полярность фенотип преобразования, тем самым характеризуя эти людьми молекул как в естественных условиях Кии апикальном мембрана полярности и Люмене позиционирования^12,13. Когда начиная с конкретных генетических мутаций/морфогенеза фенотип, такие экраны (или одной генетической/RNAi взаимодействия эксперименты) можно также проанализировать функционального взаимодействия между двумя или несколькими генов интерес (см. сопроводительный документ на выделительную ²канала в качестве примера такого анализа). Этот протокол фокусируется на РНК-интерференции, который, в дополнение к его способности напрямую идентифицировать ген, потеря которых причины фенотипа вперед экранах, предоставляет особые преимущества для анализа морфогенеза. Поскольку продукты гена, направляя морфогенеза часто работают в зависимости от дозы моды, RNAi обычно успешно в генерации спектр фенотипов. Способность создавать информативные частичной потери функции фенотипов также помогает для решения этой проблемы, что большинство важных tubulogenesis генов имеют важнейшее значение и что их потери вызывают бесплодие и ранних эмбриональных летальность. Этот протокол включает условное RNAi стратегии для преодоления этой трудности и предлагает способы оптимизации поколения широкого спектра фенотипы, например аллельные серии, производимые мутагенеза.

протокол

1. Маркировка в C. elegans кишечнике

Примечание: увидеть сопроводительный документ авторами на анализе выделительной канал tubulogenesis ² для строительства конкретных флуоресцентные маркер ткани плазмиды и создания трансгенных животных, в том числе обсуждение транскрипционный анализ и трансляционная фьюжн белков (последний для субцеллюлярные локализации молекулы интерес). Эти процедуры могут быть адаптированы с помощью конкретных промоутеров для привода молекулы интерес в кишечник. Таблица 1 примеры молекул, доказано полезным для визуализации кишечные нематоды Caenorhabditis elegans эндо - и плазменных мембран и их соединениях, Таблица 2 примеры промоутеров для вождения выражение в кишечник, см и Таблица 3 ресурсов для более всеобъемлющей коллекции кишечные маркеров и промоутеров.

Антитело пятная C. elegans кишечника
1. ^{27 , 28}
   1. фиксации
      1. взять на чистой стеклянное скольжение и использовать поли L-лизин в генерировать тонкой пленки для червей держаться на. Место 30 мкл 0,1-0,2% поли L-лизин на слайд и место второго слайда на поли L-лизин падение сделать " сэндвич ". Затем руб слайды плавно несколько раз намочить всю поверхность обоих и пусть воздух сухой для 30 мин Label стороне матового слайды с карандашом.
         Примечание: 0,2% поли L-лизин аликвоты 200 мкл были сделаны путем растворения порошка в dH ₂ O; Это может храниться при-20 ° C. Использование высокомолекулярного поли L-лизин, для улучшения, торчащие из червей. Важно также концентрация поли L-лизин. Слишком низких концентрациях не допустит червей на палку, но слишком высоких концентрациях может генерировать флуоресценции фонового сигнала. Слишком толстый фильм может ослабить во всей его полноте.
      2. Место плоский металлический блок твердо стоит на нижней части контейнера (например полистирола контейнеров), заполнены с жидким азотом.
         Примечание: Можно использовать вместо сухого льда, но жидкого азота держит блок металла более стабильной на дне контейнера и озноб хорошо.
      3. Собрать червей либо путем мыть их покинуть их пластины с M9 ²⁹ или выбрать различные стадии червей (либо яйца, L1, L2, L3 и L4 личиночной стадии черви) на каждый слайд. Как правило выберите ~ 100 личинок и эмбрионы или ~ 20 взрослых к каждому слайду. Место 10 мкл смывается червей на середине слайда или забрать яйца/червей в 10 мкл M9 или 1 x 10 мкл PBS ²⁷ (-фосфатный буфер).
         1. Использование пипетки разложить большое количество червей во избежание слипания.
            Примечание: Смешанных популяций смывается червей, из-за скученности и различные толщины этапов, не прилипают также и являются менее эффективного замораживания трещины (см. ниже), поэтому комплектации стадии конкретных червей (или синхронизированные населения) дает превосходные результаты. Личинки палку лучше, чем взрослые и более животных могут быть размещены на слайд.
         2. , Прежде чем собирание червей на слайды, перевести их на пластине среднего роста нематода (НГМ) ²⁹ без ОР50 бактерий. Избыток бактерий приверженцем черви могут также столкнуться с прилипания. Заботиться, что черви не сухим из.
      4. Мягко место (капля) 22 × 22 мм coverslip кросс пути на вершине собранные червей, таким образом, чтобы его края свисать на по крайней мере одной стороне слайда. Нажмите прямо вниз нежно но твердо с одним или двумя пальцами на coverslip. Избегайте резки, что нанесет ущерб целостности тканей.
      5. Сразу и осторожно передача слайд на металлических блок в жидком азоте и пусть сидят около 5 минут для замораживания. Затем " Флик от " coverslip в одном swift перемещение с помощью нависающие края.
         Примечание: Этот шаг необходимо решительно и хотя слайд замораживается до достижения " крекинг " кутикулы. Предупреждение: Пожалуйста, следуйте СИЗ (средства индивидуальной защиты) руководящие принципы при работе с жидким азотом.
      6. Погружать замораживания трещины слайды в метанол-заполнены Coplin Стеклянна банка для 5 мин при-20 ° C. Затем перенесите ацетон-заполнены Coplin Стеклянна банка для еще 5 мин при -20 ° C.
         Примечание: Метанол и ацетон должны храниться в-20 ° C для по крайней мере 30 минут перед использованием. После фиксации, слайды могут храниться при -20 ° C. Осторожно: метанол и ацетон токсичны.
      7. Удалить слайды из jar и дайте им высохнуть при комнатной температуре (RT) перед использованием на воздухе.
   2. Окрашивания
      1. окружают области фиксированной червей с тонким слоем вазелина на слайде. Нарисуйте круг вокруг этой области в нижней части слайда, чтобы отметить место.
         Примечание: Очень важно, что круг желе остается неизменным на протяжении окрашивание процедуры для предотвращения утечки окрашивания растворов.
      2. Подготовка " влажной камере " в пластичный ящик с крышкой, поместив влажные бумажные полотенца в него. Поместите слайд на решетку в этом " влажной камере " для предотвращения высыхания слайды во время окрашивания.
         Примечание: Слайды не должно быть при соприкосновении с водой или друг с другом.
      3. Нежно Пипетка примерно 50 мкл ПБС в круг желе, достаточно для покрытия области. Закрыть " влажной камере " с крышкой. Инкубируйте на RT на 5 мин
         Примечание: Чтобы избежать потери червей на этом шаге, не Пипетка PBS непосредственно на червей. Осторожно поместите наконечник пипетки на краю круга и позволяют жидкости разойтись плавно над червей.
      4. Наклона слайд и медленно аспирационная PBS с пипеткой. Поместите слайд назад плоский на стойку и добавьте 50 мкл (или необходимой суммы для покрытия месте) блокирование решения тщательно. Инкубируйте это в зале мокрый в РТ за 15 мин. Во время ожидания, разбавить первичных антител в блокировании решение (см. Таблицу материалов для примеров первичных антител и концентрации).
         Примечание: Свеже Подготовьте блокирования решения с помощью 1 x PBS (10 мл), 10% анимации (50 мкл) и сухого молока (0,2 грамма). Количество моющего средства и концентрация молока может варьироваться в зависимости от антитела, которые используются и может потребоваться определяется эмпирически. Аспирации жидкости из слайд является еще одним шагом к легко потерять червей. Проверить прогресс путем изучения слайд под рассечения, но будьте осторожны, что слайд не сухим из.
      5. Наклона слайд и аспирационная от блокирования решения, используя те же меры предосторожности, как описано выше. Место слайд обратно на стойку и медленно добавьте 50 мкл разбавленного основное антитело, используя те же меры предосторожности. Закрыть " влажной камере " и Инкубируйте на 4 ° C на ночь или на более короткие периоды на RT.
         Примечание: Время инкубации может потребоваться определяется эмпирически для специфического антитела.
      6. Аспирата от основного антитела решения как для других решений. Затем вымойте слайды с блокировки решение для 10 мин, 3 раза, Добавление и удаление решения таким же образом, как описано выше.
      7. Добавить вторичные антитела (дневно меченых) разводят в блокирующие решение, инкубировать в РТ за 1 ч. Смотрите Таблицу материалов для примеров вторичных антител и концентрации.
      8. Удаление вторичных антител и мыть, как указано выше, с блокировкой решение 2 раза и погасить блокирования решения с ПБС втечение 10 мин.
      9. Прочь аспирационная столько PBS как можно без разрешения образца высохнуть и тщательно удалить желе вокруг образца.
      10. Добавить одну каплю монтажа средних на образец, и Осторожно поместите coverslip на вершине. Уплотнение края coverslip с ногтей. Место слайды в коробке темный слайд для сохранения окрашивание и хранить в 4 ° C.
          Примечание: Хранить слайды в темноте из-за светочувствительность (флюоресценции может исчезать с течением времени) и предотвращения воздействия воздуха, сохраняя их опечатаны, по той же причине. Слайды можно хранить в течение продолжительных периодов времени при 4 ° С или -20 ° с.

2. Вмешательство с помощью функции основных tubulogenesis генов в C. elegans intestine. Пример: RNAi.

Примечание: штаммы C. elegans культивированный на ОР50 бактерии посеян на тарелках NGM согласно стандартных протоколов ²⁹. Для RNAi, C. elegans питаются HT115 интерференции бактерий на RNAi пластины, дополненная 25 мкг/мл carbenicillin и 2 мм ИПТГ (изопропиловый бета D-1-тиогалактопиранозид) для индукции бактериальных промоутер, который генерирует двойной мель РНК (dsRNA) из интродуцированных C. elegans гена. Антибиотики и IPTG концентрации могут варьироваться в зависимости от интерференции клон/библиотека и требуемой прочности интерференции, отв конкретных RNAi клоны могут быть получены из коммерчески доступных генома общесистемной RNAi кормления библиотек (см ( ^{26 , 30 , 31}) для фоновой на кормлении RNAi в C. elegans и Таблица материалов для RNAi библиотек и материалы/реагенты).

1. 1. Стандартный RNAi кормления ^{26 , 31} вывезти RNAi библиотека пластины от-80 ° C и положил его на сухой лед. Удаление Уплотнительная лента и использовать стерильные пипетки подсказка для передачи адэрентных бактерии клон интерес плиты агара фунтов (бульоне Лурия) ²⁹ дополнена 100 мкг/мл Ампициллин и тетрациклин 15 мкг/мл. Полоса бактерий на агаре пластину. Уплотнение пластину библиотеки РНК-интерференции с новой Уплотнительная лента. Расти бактерий на ночь при 37 ° с.
      Примечание: Эти плиты агара может храниться при температуре 4 ° C на несколько недель. Новые бактерии могут быть культивировали непосредственно от них, чтобы защитить исходной библиотеки RNAi.
   2. Следующий день, прививать RNAi бактерий от LB агар пластины в 1 мл жидкой среды LB ²⁹ содержащие 50 мкг/мл Ампициллин и встряхнуть для 14 h (8-18) или на ночь на 37 ° C.
      Примечание: Для оптимальных результатов используйте свежие бактерии каждый раз. Посмотреть справочник ( ³⁰) для сравнения различных культуры условий (например, сроки культуры).
   3. Следующий день, семян 200 мкл на клон культивировали RNAi бактерий на отдельных плит RNAi. Пусть пластины сухой и оставить на RT на ночь для индукции бактериальный промотор.
   4. Передачи 4-6 L4-стадии личинки на каждой пластине RNAi. Инкубировать посеян RNAi пластины на RT или 22 ° C для 3-5 дней.
      Примечание: Сначала выберите L4 личинок на NGM пластину без бактерий, чтобы удалить сторонник ОР50, которые будут мешать интерференции, или серийно перенести их в новую пластину NGM без ОР50 три раза. Убедитесь, что не загрязнены штаммов, как загрязняющие бактерий - как ОР50 предпочитают пищу для червей - также будет мешать RNAi. При необходимости измените температуру: например, развитие разгона с высокой температурой; штаммы могут быть чувствительна к температуре.
   5. Для развития исследований, проверить фенотипов потомства F1 начиная с дня 2.
      Примечание: Важно, чтобы проверить животных часто, чтобы избежать отсутствует внешний вид или прогрессирование фенотип (например маркер перемещения) при оценке поляризованной мембраны биогенеза во время разработки. Обогащение населения F2 для сильной фенотипов (например, выбирая гермафродитки родителя к новой плите RNAi на день 2, чтобы выбрать для наиболее сильно затрагиваемых середине часть их потомства) требуется редко, поскольку спектр от легкой до сильного желательно фенотипов.
2. Условного RNAi
   Примечание: RNAi условия могут быть изменены сократить тяжелой, или увеличить мягкие эффекты, или вмешиваться в стадии специально; изменения полезны для полной оценки фенотипические эффекты часто Смертельное tubulogenesis генов.
   1. Личинок RNAi - оценки RNAi эффекты же поколения (мягкий, зависящие от стадии RNAi)
      Примечание: для преодоления бесплодия или эмбриональных летальность, или нарушить функции гена на определенной стадии эмбриогенеза пост, RNAi индуцируется в личинки, пост embryonically. Место без лечения яйца (2.2.1.1), беременных взрослых (2.2.1.2) и синхронизированы L1 (либо, при необходимости, позднее этап) личинки (2.2.1.3) на RNAi пластины; Оцените эффекты интерференции в том же поколении, например два дня спустя и далее, в личинок и взрослых.
      1. Забрать 30-50 беременных взрослых в одно падение, Отбеливание решение (раствор 1: 4 10 M NaOH и бытовые гипохлорита натрия) размещены на краю пластины RNAi. Пусть сухой и позволяют Л1С люк и двигаться в бактериальных газон.
         Примечание: Решения, как правило, используется для очистки, отбеливания убьет все но эмбрионов в их яичную скорлупу. Таким образом, не ставьте отбеливающий раствор на или вблизи бактерий RNAi.
      2. Выбрать семян ~ 20 молодых беременных взрослых на пластине RNAi и пусть они откладывают яйца на 2-3 ч или до тех пор, пока существует около 300 яиц на пластину, затем обрывать взрослых.
         Примечание: Этот метод может вызвать загрязнение RNAi бактерий к ОР50. Чтобы уменьшить этот риск, перевести взрослых на NGM пластину без бактерий для удаления ОР50 приверженцем червей. Заботиться, что взрослые не слишком долго оставаться на RNAi пластины, чтобы избежать эффекта RNAi на эмбрионах.
      3. Выбрать или место L1 стадии червей непосредственно на RNAi пластины (см. ссылку ( ²⁹)-для синхронизации протоколов).
         Примечание: Можно использовать сокращенный синхронизации протокол (например для умеренно крупных масштабах set-up) путем промывания червей из густонаселенных пластины с M9 на несколько раз, до тех пор, пока остаются только яйца. После 2-3 ч, инкубационные Л1С затем могут быть собраны в M9 из этих плит, очищены от дополнительных смывки для удаления бактерий (3 x в M9) и посеян на плиты RNAi.
   2. Разрежения RNAi бактерий с пустой вектор RNAi бактерий (мягкий RNAi)
      Примечание: сокращение количества двуцепочечной ДНК путем разбавления количество бактерий РНК-интерференции может быть достаточно, чтобы побудить мягкий эффект и может также уменьшить эмбриональных летальность без отмены всех эмбриональных эффектов. Разбавление RNAi бактерий используется также для двойной RNAi экспериментов и титровать условия для взаимодействия генетических экспериментов (например для создания мягкой для оценки повышения и сильные последствия для оценки подавления).
      1. Расти вверх RNAi и emPTY вектор HT115 интерференции бактерий в 1 мл LB среде с 50 мкг/мл ампициллин, как это сделано для стандартных условий RNAi.
      2. Развести RNAi бактерий с пустой вектор RNAi бактерий для достижения диапазон различных концентраций, например, 5%, 15%, 30%, 50%, 70%. Смешайте бактерии хорошо закупорить вверх и вниз. Пипетка 200 мкл смешанные бактерий на пластину RNAi.
      3. Выбрать 4-6 L4 личинок на каждой табличке RNAi. Проверьте фенотипа от 2 день вперед.
   3. Интерференции чувствительных штаммов (сильной интерференции)
      1. использовать имеющиеся RNAi чувствительных штаммов, например, Эри-1 (mg366), СБР-3 (pk1426) или Эри-1 (mg366) Лин 15Б (n744) (последняя supersensitive) и следуйте стандартные процедуры интерференции, описанные в 2.1 ^{31 , , 32 33}.
         Примечание: RNAi чувствительных штаммов (например, СБР-3 и Эри-1) возможно ниже выводок размеров, чем одичал тип животных и быть стерильной при 25 ° C. Они также могут иметь низкий фоне собственных фенотипов, например низкий капиллярный эмбриональных летальность, который должен приниматься во внимание при оценке специфические эффекты интерференции.

3. В естественных условиях изображений C. elegans кишечника путем рассечения микроскопии флуоресцирования

1. до визуализации животных под светом флуоресцирования, проверить RNAi пластины под яркий свет на любой рассечения микроскопа. Оценить (и потенциально записи) фенотипов, видимой в условиях яркого света, которые могут повлиять на анализ, такие как смертоносность, бесплодие (Нижняя количество потомства), развития (например, личинок арест) и другие видимые фенотипов, которые могут помочь характеризуют функции генов, участвующих в поляризованной мембраны биогенеза и Люмене морфогенеза.
   Примечание: Только оценка пластины, которые имеют достаточно потомства для оценки (по крайней мере, 50), в противном случае попробуйте альтернативные условия RNAi. Для количественной оценки убедитесь, что пластины не загрязнены или расти ОР50 (что мешает RNAi).
2. Для визуализации животных под люминесцентные лампы дневного света, снимите крышку и установите пластину RNAi непосредственно под рассечения флуоресцентным микроскопом.
   Примечание: Чтобы обнаружить тонкого кишечника фенотипов потребуется рассечения микроскопа с более высокой мощности стерео флуоресценции вложение, которое позволяет достаточно диапазон увеличения. Этот протокол описывает использование область с 1.5 и 10 x цель и масштаб диапазоне от 3,5 до 45.
3. Сначала найти животных при ярком свете сосредоточиться. Далее, изучение животных под флуоресцентный свет при низком увеличении (например под 1,5 x цель), используя соответствующий фильтр. Изучить пластины систематически от верхнего левого до нижнего правого сканировать весь пластина для фенотипов.
4. Выберите животное интерес и измените на 10 x цели. Сосредоточиться на ЖКТ и использовать зум для оценки tubulogenesis/люмен морфогенеза фенотип. В разделе 5 очков фенотипов. Во-первых принимать изображения в низком увеличении. Затем переключиться с большим увеличением.
   Примечание: Поскольку здоровых животных двигаться быстро, работает быстро, с одной стороны, на компьютерной мыши для захвата изображений уделяя микроскоп с другой стороны. Замедление животных (например, размещение переходных пластин до 4 ° C) могут не потребоваться при работе с tubulogenesis фенотипов в основном арестован эмбрионов и начале личинки. Изображения могут быть захвачен микроскопа монтируется ПЗС-камеры и программное обеспечение для захвата изображений.

4. Визуализации C. elegans intestine с высоким разрешением, лазерного сканирования конфокальная микроскопия ^{34 , 35}

1. монтаж и иммобилизации
   1. использования пальца тонко распространять небольшое количество жиром или вазелином в круг на слайде стекла (~ 6-8 мм в диаметре).
      Примечание: Толщина жира круга имеет решающее значение для монтажа. Для лучших изображений результаты, изображение только один или несколько личинок в то время и использовать ультратонких смазка круг с как мало жидкости как можно скорее таким образом, что животное непосредственно застрял между стеклянное скольжение и крышка выскальзования (если сделано идеально, животное будет быть иммобилизованным без цистит). Монтаж из яиц и старых животных требуют несколько толще круг, чтобы избежать разрушения образца при добавлении крышка выскальзования.
   2. Добавить каплю обычно 3.5 мкл 10 мм раствор азид натрия в середину круга и выбрать червей в нее под микроскопом рассечения.
      Примечание: Подготовка запасов раствором азид натрия 1 М путем растворения 65.01 мг NaN3 в 1 мл dH ₂ O; Добавьте 200 мкл этой 1 М раствора в 20 мл M9 буфер. Выберите черви быстро в каплю решение азид натрия, чтобы избежать решения сушиться. Выберите этапы отдельно для оптимального монтажа, направленный на около 50 эмбрионов на слайд и около 20 личинок, при рассмотрении крупных групп населения. M9 можно использовать вместо решения азид натрия при выборе эмбрионов. При использовании азид натрия, животные должны отражаться в течение 30 мин, чтобы избежать повреждения тканей этой токсичных химических.
      Предупреждение: азид натрия является токсичным.
   3. Осторожно поместите 22 × 22 мм coverslip на слайде. Будьте осторожны, чтобы не подавить червей. Используйте мягкое давление и проверьте под рассекает микроскопом, чтобы убедиться, что черви являются фиксированными хорошо между слайд и крышка выскальзования. Метка слайда.
      Примечание: Правильное количество давления важно избежать повреждения образца (слишком много давления) и не хорошо его крепления (слишком мало давление: Животные плавать вместо прилипания к слайду). Плавающие животных по существу исключает соответствующих изображений.
2. Imaging
   1. место слайд под конфокального микроскопа. Поиск для червей с 10 x цели и направленности.
      Примечание: Используйте яркий свет сосредоточиться, где это возможно избежать Фотообесцвечивание.
   2. Изменения в 60 x или 100 x цель и сосредоточиться на кишечнике.
      Примечание: Кишечника может быть легко идентифицирован при ярком свете ее просвета, проходящей через середину животного, от глотки в анус возле кончика хвоста. Будьте осторожны при применении масла для 60 x или 100 x нефти цель. Смешивание различных видов масел может мешать дальнейшей обработки изображений. Место небольшой капли масла на слайд при вертикальном положении микроскопа или на цель при использовании Перевернутый область, стараясь не заражать других целей или части микроскопа.
   3. Установить Колер DIC/Номарски освещение для достижения цели, которые будут использоваться для сканирования ³⁶. Осмотрите животное под люминесцентные лампы дневного света с соответствующим каналом для проверки маркировки кишечника и/или проверить фенотип, чтобы выбрать подходящий образец для изображений. Работа быстро, чтобы избежать отбеливания.
   4. Переключатель для лазерного сканирования для ограничения перспективные изображения в кишечник, установив сканирования границ на его дорсальной и вентральной стороне.
      Примечание: Брекетинга кишечника таким образом имеет решающее значение, если Флюорофор также этикетки структуры вне intestine. Во время этой экспериментальной проверки работаете с быстрой проверки условий для avOID Фотообесцвечивание.
   5. Остановка сканирования для выбора параметров сканирования для эксперимента. Набор 6-20 секций для кишечных сканирования вдоль оси z, например интервалом 0.2 мкм, в зависимости от запроса, этап животных и/или технических соображений. Задайте усреднение за изображения в зависимости от сложности маркировки и требуется разрешение, чтобы уменьшить шум.
      Примечание: Установка детали варьируются в зависимости от Микроскоп и экспериментировать. Может понадобиться уменьшить количество секций во избежание обесцвечивания если выполняет последовательное сканирование трех различных флуорофоров. Отрегулируйте количество кадров на количество секций (должно быть меньше, чем количество разделов, чтобы избежать искажения изображения; также весят в увеличение Фотообесцвечивание). обычно достаточно кадры 4-6.
   6. Вернуться к сканирование с окончательным (медленно) лазерного сканирования условия и настройки: яркость (использование минимального прибыль для уменьшения фона); лазерной энергии (как требуется, как низко как можно - увеличивает Фотообесцвечивание выше; обычно минимальное значение адекватного); отверстие (избежать открытия, если не требуется, чтобы поддерживать резолюцию).
      Примечание: Сканирование условия зависят от образца и должны определяться эмпирически в начале сеанса сканирования. Убедитесь, что яркость не превышает насыщения (ограничит возможность впоследствии изменить изображения, изображения программное обеспечение). При задании сканирования условий, также считают, что должны использоваться одинаковые условия для всех изображений в экспериментах, которые сравнивают экспериментальных животных с элементами управления.
   7. Захвата изображения серии. Объединение изображений в одной проекции изображения.
      Примечание: Может потребоваться сохранить проекции изображения и/или наложения отдельно в зависимости от Микроскоп.
   8. При принятии многоканальные изображения использовать последовательное сканирование чтобы избежать кровотечения через между каналами (критических исследований совместно локализации).
      Примечание: Параметры изображения может потребоваться быть изменены с учетом повышенной Фотообесцвечивание, подключенных к больше время сканирования.
   9. Всегда приобрести соответствующие изображения DIC/Номарски (секции) достопримечательности и общее состояние морфология отсканированных животного.

5. Количественная оценка поляризованной мембраны биогенеза дефекты в C. elegans кишечника

Примечание: пример: базолатеральной перемещения апикальной ERM-1::GFP и формирования внематочная боковых люмен индуцированных пусть-767 и APS-1 RNAi.

1. , Забив фенотипов под микроскопом рассечения ( рис. 5 A, D, E)
   1. определить категории для скоринга. Пример: (i) одичал тип (WT), (ii) базолатеральной перемещения формирования МВК 1::GFP (полярности дефект) и (iii) внематочная люмен (развивается после перемещения базолатеральной).
      Примечание: Малое увеличение визуального анализа поддается забил количество животных, с или без конкретных фенотип. Здесь мы выбрали пример трех качественно фенотипические категорий, которые находятся на же время свидетельствует о ухудшение фенотип полярности, который анализируется. Однако, множество различных количественных и качественных фенотипов может быть забит, например люмен морфогенеза дефекты, отсутствие присутствия (или номера) GFP позитивные цитоплазменные вакуоли, люмен диаметр и размер или количество intralumenal кисты (см < сильный класс = «xfig» > рисунок 3 для примеров).
   2. В зависимости от величины ожидаемых различий, оценка примерно 100 живут черви на тарелках агар под микроскопом рассечения в двойные или тройные набор экспериментов.
      Примечание: Один необходимо Оценка каждое животное, которое приходит в поле зрения при сканировании пластины систематически, например от левого верхнего угла в нижний правый пластины (убедитесь, что черви населяли пластины равномерно).
   3. Повторить это для 3 независимых наборов экспериментов. Создание гистограммы и оценить значимость результатов.
2. Скоринга фенотипов под конфокального микроскопа ( рис. 5 B)
   1. определить категории для озвучивания, например количество внематочная люменов на животных
      Примечание: увеличение визуальный анализ поддается скоринга количественно маркер или фенотип за животное и позволяет скоринга внутриклеточных маркеров, которые не могут быть различимы путем рассечения микроскопии. Настоящий пример подсчета внематочная люменов на животных в подмножестве червей же эксперимента, ранее оцениваются путем рассечения микроскопии (5.1.1, Категория 3) уточняет оценку ухудшения фенотип полярности, что рассматривается здесь. Однако, различные другие фенотипы или параметров может быть забит, например количество пузырьков, наличие/отсутствие или количество субцеллюлярные компоненты, которые совместно локализации, интенсивности флуоресценции (последний количественно, ImageJ; см. сопроводительный документ на выделительной канал)- ².
   2. В зависимости от величины ожидаемых различий, количественно фенотипических маркеров (здесь, внематочная люмен) в приблизительно 20 животных в двойные или тройные набор экспериментов под конфокального микроскопа.
   3. Повтора для 3 независимые наборы экспериментов. Графов Бар и оценить значимость результатов.

Результаты

Этот протокол описывает молекулярно анализировать и визуализировать поляризованной мембраны биогенеза и Люмене морфогенеза в C. elegans ЖКТ, на одну ячейку и субклеточном уровне. Двадцать клетки однослойная C. elegans кишечника образуется режиссер деление клеток и...

Обсуждение

Этот протокол описывает как объединить Стандартная функция потерь генетических/RNAi и обработки изображений (маркировка и микроскопических) подходы к воспользоваться C. elegans кишечного эпителия как модель для визуального и молекулярных рассечение в естественных условиях поляр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Tween	Fisher Scientific	50-213-612
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Powdered milk	Sigma	MT409-1BTL
Primary antibodies
MH27 (mouse)			Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
MH33 (mouse)			Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
anti-ICB4 (rabbit)			Concentration: 1:5 Resources: A gift from MariodeBono (Medical Research Council, England)
anti-PAR-3 (rabbit)			Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)
Secondary antibodies
Alexa Floor 568 (anti-rabbit)	ABCam	AB175471	Concentration: 1:200
Cy5 (anti-mouse)	Life technologies	A10524	Concentration: 1:200
TRITC (anti-rabbit)	Invitrogen	T2769	Concentration: 1:200
FITC (anti-mouse)	Sigma	F9006	Concentration: 1:100
Labeled chemicals
Texas Red-Phalloidin			Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471
Materials
Vacuum Grease Silicone	Beckman	335148
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
C. elegans related			see reference29 for standardC. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates			see reference29 for protocols.
Tryptone	Acros Organics	611845000
Yeast Extract	BD Biosciences	212750
NaCl	Sigma	S7653
Bacto Agar	BD Biosciences	214040
Ampicillin	Sigma	A0116
Tetracycline	Fisher Scientific	BP912
M9 Medium			see reference29 for protocols.
NaCl	Sigma	S7653
KH2PO4	Sigma	P0662
Na2HPO4	Sigma	S7907
MgSO4	Sigma	M2773
NGM plates			see reference29 for protocols.
NaCl	Sigma	S7653
Peptone	BD Biosciences	211677
Tryptone	Acros Organics	611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	214040
MgSO4	Sigma	M2773
CaCl2	Sigma	C3881
Cholesterol	Sigma	C8667
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
RNAi plates			see reference30 for protocols.
NaCl	Sigma	S7653
Peptone	BD Biosciences	211677
Tryptone	Acros Organics	611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	214040
MgSO4	Sigma	M2773
CaCl2	Sigma	C3881
Cholesterol	Sigma	C8667
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
IPTG	US Biological	I8500
Carbenicillin	Fisher Scientific	BP2648
NaOH	Fisher Scientific	SS266-1
Sodium hypochlorite	Fisher Scientific	50371500
Bacteria
OP50 bacteria	CGC
HT115 bacteria	CGC
Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50)	Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51)	Source BioScience
Imaging related
Sodium azide	Fisher Scientific	BP9221-500
Equipment
dissecting microscope	Nikon	SMZ-U
dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions)	Olympus	SZX12
Laser-scanning confocal microscope	Leica Microsystem	TCS SL
laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope	Nikon	C2