亚甲蓝染料注射液评价泌尿道结肠梗阻的缺陷

摘要

亚甲蓝染料注射入肾盂有助于评估尿路结肠梗阻的缺陷, 在小鼠胚胎泌尿道发育。在这里, 一个协议的亚甲蓝染料注射到肾盂是描述。

摘要

尿路结肠梗阻是先天性异常, 诱发肾积水和 us。小鼠泌尿道结肠梗阻的缺陷可以通过跟踪在泌尿系统内的亚甲基蓝染料流动来评估。将亚甲蓝染料注入围产期胚胎肾脏的肾盂中, 在应用静水压后, 通过输尿管肾脏的肾盂和膀胱腔内的染料流进行监测。在正常围产期泌尿道的膀胱腔内, 染料堆积明显, 但在肾盂与输尿管异常的终点之间, 如果出现尿路梗阻, 则会受到限制。该方法可促进尿路结肠梗阻的确诊和肾积水和 us 的可视化。这份手稿描述了一个协议的亚甲蓝染料注射液进入肾盂, 确认泌尿道交界处的障碍。

引言

泌尿系统包括一对肾脏和输尿管和一个共同的膀胱和尿道。泌尿系统的主要功能是通过管理血液的水和电解质平衡来维持身体的稳态。肾脏过滤血液以控制电解质浓度和酸碱平衡, 并产生尿液排出过量的水和废物, 包括溶质和代谢物。然后, 尿液通过输尿管从肾脏的肾盂转移到 bladderin 的单向的方式, 它是储存和最终消除通过尿道¹。

输尿管是来自肾导管的直管。在小鼠胚胎日 10.5 (E10.5) 的肾导管萌芽后, 输尿管柄拉长并分化成一种称为膀胱的多层结构, 在小鼠 E12.5 和 E16.5 之间是不透水的。输尿管柄周围的间充质细胞也被分为三层, 包括内基质细胞、中层粗平滑肌细胞和外外成纤维细胞。输尿管蠕动波起始于肾盂, 通过输尿管壁的平滑肌层传播至膀胱以传输尿液^2,3, 它是在鼠标¹中从 E16.5 开始生成的。

先天性异常的肾脏和泌尿道 (CAKUT) 是最常见的遗传性疾病, 目前在大约1% 的人类胎儿^1,4, 并组成的各种表型包括肾积水和 us。肾脏和输尿管的尿液异常积累导致积水肾和 us 的形成。肾积水和/或 us 形成的一个原因是尿路梗阻。肾盂结肠梗阻 (UPJO) 是由于在近端输尿管和肾盂之间的堵塞造成的尿流异常, 导致肾积水和近端 us 狭窄与角度或持续折叠^{5, 6}。此外, 远端输尿管的异位插入膀胱壁或生殖道称为输尿管结肠梗阻 (UVJO)。UVJO 还可诱发肾积水和 hydromegaureter 形成^7,8。另外的输尿管结 (UVJ) 缺陷是膀胱回流 (VUR)。VUR 的特点是逆行尿流从膀胱向肾脏在 UVJ。与 UVJO 相比, 围产期胚胎与 VUR 不明显显示肿胀积水肾或严重 us 表型⁹。

在实验小鼠, 尿液流动可以通过注射染料, 如亚甲蓝, 进入肾盂⁹。injectedmethylene 蓝溶液将从肾盂经输尿管进入膀胱, 追踪尿液轨迹。肾积水可以通过在肾脏中的染料的膨胀来识别。UPJO 可被检测为堵塞的染料流在近端输尿管与肿胀肾盂⁵。经加宽的直径所示的输尿管的任何扩张都显示了 us 的一个例子。最后, 染料堆积在膀胱壁或在生殖道的站点表明 UVJO 与膨胀的积水肾脏和扩张的 hydromegaureter^7,10。为了检测 VUR, 染料溶液注入膀胱, 随后的逆行流在肾脏的⁹中被监测。

在这里, 提出了一个协议的亚甲蓝染料注射到肾盂的围产期胚胎。这项协议允许追踪尿液从肾盂通过输尿管和进入膀胱, 并验证潜在的泌尿道交界处的障碍, 如 UPJO 或 UVJO。

研究方案

鼠标 ( Wnt5a flox / flox 小鼠 (Wnt5a ^tm1.1Tpy ) 和 Dll1Cre 线, UVJO 小鼠模型) ⁷ 是根据 NIH 关于实验室动物护理和使用的指导方针进行管理的。并根据由动物保护和使用委员会批准的议定书进行研究.

1. 亚甲基蓝染料溶液的制备

1. 测量 0.1 g 亚甲蓝粉.
2. 在10毫升生理盐水或1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中完全由涡流溶解亚甲基蓝.
3. 用注射器过滤器 (膜孔径0.45 和 #181; m) 过滤10毫克/毫升亚甲基蓝溶液, 以消除注射过程中的堵塞.
4. 组装一个无菌头皮静脉集 (27GX3/4 和 #8243;) 与3毫升一次性注射器和填充注射器3毫升过滤亚甲蓝溶液.
   注意: 为了防止静水压和随后的染料流动, 将针尖放在装有亚甲基蓝溶液的注射器上.

2。产前胚胎解剖

1. 用70% 乙醇清洗解剖剪刀和镊子.
2. 在 E18.5 或 E19.5 中收集围产期胚胎, 先使用 CO ₂ 吸入, 然后根据 NIH 指南执行宫颈脱位.
   注意: 怀孕的雌性老鼠通常从 E18.5 开始分娩, 但是, 较大的肾脏更容易操作。因此, 在 E19.5 接近出生的肾脏更容易进行这一分析。然而, 有双侧尿路阻塞的幼崽在出生后死亡。根据实验小鼠的特点, 应该经验地确定适当的收集日/时间.
3. 在腹腹表面喷洒70% 乙醇, 然后用解剖剪刀和镊子打开腹腔腹.
4. 抬起整个子宫, 用解剖剪刀在子宫角上切开, 将它与身体分开.
5. 在培养皿中用 1x PBS 冲洗整个子宫.
6. 用解剖剪刀切开子宫分段, 用解剖钳切除胎盘蜕膜, 将胚胎暴露在卵黄囊中.
7. 先取下蛋黄囊, 然后用解剖钳取出羊膜, 释放围产期胚胎.
8. 用解剖剪刀斩首胚胎。用无菌纱布擦拭多余的血液。在解剖显微镜上, 用数码相机进行成像, 将胚胎从腹面上固定下来。如果需要, 收集它的基因分型的尾巴.
   注: 一次进行一次胚胎注射.
9. 通过撕裂皮肤小心地打开一个胚胎的腹腔。然后, 通过切割或拔出它们来暴露肾脏、输尿管和位于背的膀胱 ( 图 1A ), 小心地清除多余的器官和组织, 如肝脏、胃和肠道。如有必要, 从解剖胚中吸收多余的血液, 用无菌纱布垫.
   注: 过量的血液会影响到对染料注射的肾盂识别.

3。注射亚甲基蓝染料到肾盂和监测染料流

1. 通过将亚甲基蓝溶液从针尖上排出, 通过静水压来除去针头和油管中的气泡。提起含有染料溶液的注射器, 在针尖的水平以上开始流动, 然后放下注射器停止流动.
2. 将针插入靠近输尿管近端的肾盂, 注意不要在放置后再将其干扰。在肾脏中进行染料注射以确定其尿路梗阻.
   注: 将染料注射到任何异常的肾脏 ⁷ 首先遵循同样的方法来确定其尿路梗阻.
3. 抬起注射器约20厘米, 以提供静水压, 并让15和 #181; l 60 和 #181; 染料溶液流动的 l。流速将是大约3和 #181; 如果注射器是上升到这个高度在胚胎之上.
4. 监测染料的蓝色颜色首先在肾盂中开始, 然后在输尿管的长度, 最后在膀胱腔.
   注: 如果将输尿管正确插入膀胱内, 则需要大约5秒才能看到在膀胱腔中出现微弱的染料颜色。如果没有染料的颜色出现在膀胱腔中, 允许染料在被堵塞的地方堆积十五年代.
5. 将注射器放下以停止染料流并从肾脏中取出针头.
6. 使用与显微镜连接的照相机和成像程序, 将肾脏、输尿管和膀胱的图像与染料溶液一起跟踪.
7. 将肾脏、us 和染料溶液的最终位置记录在实验室笔记本中.
8. 执行3.1 节中描述的对侧肾脏的注射) 到 3.5), 并允许染料流在二十年代总.
   注: 膀胱腔内将充满染料溶液, 以强烈的蓝色表示, 如果输尿管被正确插入膀胱腔。经尿路结肠梗阻评估, 输尿管和膀胱可固定切片.

结果

肾脏和下泌尿系统位于背部的大多数其他内脏器官, 如肝脏和肠道。取出这些其他内脏器官后, 可看到一对肾脏和输尿管和一个膀胱 (图 1A)。成功解剖后, 注入肾盂的染料将通过输尿管从肾脏流向膀胱。肾盂是肾中输尿管的漏斗状扩张的近端部分。因此, 染料注射点附近的可见近端输尿管与肾脏连接, 用黑色箭头表示 (图 1B-1...

讨论

老鼠肾脏是功能开始在 E16.5 和染料射入测试从理论上可能从这个时间点。然而, 肾脏太小, 不能被注射的染料溶液和表型, 如肾积水和 us 没有清楚地观察到, 因为这些表型是由于尿液转运异常而产生的二次作用。这些表型, 从障碍, 如 UPJO 或 UVJO, 是明显的 E18.5 肿胀肾脏和输尿管。E19.5 或新生幼崽的胚胎肾脏比 E18.5 或更年轻的胚胎更容易操作。然而, 有双侧尿路阻塞的幼崽在出生后死亡。因此, 根据?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML	Fisherscientific	50-983-204
3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip	BD	309657
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane	Pall corporation	4614
Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12"	EXELINT	26709
Delicate Operating Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6702
Micro Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5135
Dumont Tweezers; Pattern #5	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5045
BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2"	BD	305106