Évaluation des voies urinaires Junction Obstruction défauts par Injection de colorant de bleu de méthylène

Résumé

Injection de colorant de bleu de méthylène dans le bassinet facilite l’évaluation des voies urinaires junction obstruction défauts au cours du développement embryonnaire des voies urinaires chez la souris. Ici, un protocole pour l’injection de colorant de bleu de méthylène dans le bassinet est décrite.

Résumé

Défauts d’obstruction des voies urinaires junction sont des anomalies congénitales induisant une hydronéphrose et hydroureter. Murine urinaires junction obstruction défauts peuvent être évaluées grâce au suivi des flux de colorant de bleu de méthylène au sein du système urinaire. Colorant de bleu de méthylène est injecté dans le bassinet des reins embryonnaires périnatales et flux de colorant est contrôlée depuis le bassinet du rein par le biais de l’uretère et dans la lumière de la vessie après l’application de la pression hydrostatique. Accumulation de colorant se manifesteront dans la lumière de la vessie du tractus urinaire normal périnatale, mais sera limitée entre le bassinet et le point final d’un uretère anormale, obstruction des voies urinaires en cas. Cette méthode facilite la confirmation des obstructions de jonction des voies urinaires et la visualisation de l’hydronéphrose et hydroureter. Ce manuscrit décrit un protocole pour l’injection de colorant de bleu de méthylène dans le bassinet pour confirmer les obstructions de jonction des voies urinaires.

Introduction

Le système urinaire se compose d’une paire de reins et uretères et une commune la vessie et l’urètre. La fonction principale du système urinaire est de maintenir l’homéostasie de l’organisme de gestion de l’équilibre de l’eau et d’électrolytes du sang. Les reins filtrent le sang pour contrôle électrolyte concentrations et équilibre acido-basique et produisent de l’urine pour excréter les excès d’eau et des déchets, y compris des solutés et métabolites. Urine est ensuite transporté par le biais de l’uretère du bassinet du rein à la bladderin de manière unidirectionnelle, où elle est stockée et finalement éliminé par l' urètre¹.

Les uretères sont des tubes droits provenant de la gaine de réserves. Après bourgeonnement de la gaine de réserves à jour embryonnaire 10,5 (E10.5) chez la souris, la tige de l’uretère s’allonge et différencie en une structure multicouche appelée urothélium imperméable entre souris E12.5 et E16.5. Les cellules mésenchymateuses entourant la tige de l’uretère sont aussi différenciés en trois couches, consistant en des cellules stromales internes, fibres musculaires lisses intermédiaires épais et fibroblastes adventitiels externes. Les ondes péristaltiques urétérales initier dans le bassinet sont propagées à travers la couche de muscles lisses de la paroi de l’uretère jusqu'à la vessie pour transporter l’urine^2,3, qui est produit à partir de E16.5 dans la souris¹.

Anomalies congénitales du rein et des voies urinaires (CAKUT) sont parmi les maladies génétiques les plus fréquentes, présentes chez environ 1 % des foetus humains^1,4et composé d’une variété des phénotypes y compris hydronéphrose et hydroureter. L’accumulation anormale de l’urine dans le rein et l’uretère conduit à la formation de rein et hydroureter hydronephrotic. Une cause de formation de l’hydronéphrose ou hydroureter est une obstruction des voies urinaires. Obstruction de jonction Ureteropelvic (UPJO) est causée par l’écoulement de l’urine anormale causée par un blocage entre l’uretère proximal et le bassinet, entraînant une hydronéphrose et hydroureter proximal rétrécissement avec angulation ou persistants pliant^{5, 6}. En outre, l’insertion ectopique de l’uretère distal dans la paroi de la vessie ou de l’appareil génital est appelée obstruction de jonction ureterovesical (UVJO). UVJO peut également induire une hydronéphrose et hydromegaureter formation^7,8. Un défaut de jonction (UVJ) ureterovesical supplémentaires est reflux vésicourétérique (RVU). VUR se caractérise par l’écoulement de l’urine rétrograde de la vessie vers le rein à UVJ. Par rapport à UVJO, embryons périnatales avec VUR ne distinctement montrent un rein hydronephrotic distendu ou de phénotype sévère hydroureter⁹.

Chez la souris de laboratoire, écoulement de l’urine peut être examiné par l’injection d’un colorant, comme le bleu de méthylène, dans le bassinet⁹. La solution de bleu d’injectedmethylene retracera le trajet de l’urine du bassinet par le biais de l’uretère et la vessie. Hydronéphrose se distingue par une expansion du colorant dans le rein. UPJO peut être détecté comme un blocage de l’écoulement de la teinture à l’uretère proximal avec bassinet dilaté⁵. Toute dilatation de l’uretère par un diamètre élargi montre un exemple de hydroureter. Enfin, accumulation de colorant à la paroi de la vessie ou sur le site de l’appareil génital indique UVJO rein hydronephrotic distendu et dilatées hydromegaureter^7,10. Pour détecter les VUR, la solution de colorant est injectée dans la vessie et flux rétrograde subséquente est contrôlée dans le rein⁹.

Ici, un protocole pour l’injection de colorant de bleu de méthylène dans le bassinet d’un embryon de périnatale est présenté. Ce protocole permet le suivi du flux d’urine le bassinet par le biais de l’uretère et la vessie et vérifie les potentiels obstacles de jonction des voies urinaires tels que UPJO ou UVJO.

Protocole

souris (Wnt5a flox / souris flox (Wnt5a ^tm1.1Tpy) et Dll1Cre ligne, modèle de souris UVJO) ⁷ étaient gérés selon les directives des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et a étudié sous un protocole approuvé par le Comité de l’emploi et de la NCI-Frederick animalier.

1. préparation de Solution de colorant bleu de méthylène

1. mesurer la poudre de bleu de méthylène de 0,1 g.
2. Dissoudre le bleu de méthylène dans 10 mL de soluté physiologique ou 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) complètement vortexer.
3. Filtrer la solution de bleu de méthylène de 10 mg/mL avec une seringue-filtre (taille des pores membranaires 0.45µm) pour éliminer l’obstruction pendant l’injection de.
Ensemble des veines
4. Assemble un cuir chevelu stérile (27GX3/4 ″) avec une seringue de 3 mL et remplir la seringue de 3 mL filtré la solution de bleu de méthylène.
   Remarque : Pour empêcher la pression hydrostatique et flux teinture ultérieure, placez la pointe de l’aiguille au-dessus de la seringue remplie de solution de bleu de méthylène.

2. Dissection des embryons prénatal

1. propre disséquant les ciseaux et pinces avec l’éthanol à 70 %.
2. Pour recueillir les embryons périnatales au E18.5 ou E19.5, euthanasier souris enceintes tout d’abord à l’aide de CO ₂ par inhalation, puis effectuez une dislocation cervicale selon les lignes directrices des NIH.
   Remarque : La souris femelle enceinte habituellement donne naissance à partir de E18.5, mais plus gros reins sont plus faciles à manipuler. Par conséquent, les reins à E19.5 plus près à la naissance sont plus faciles à réaliser cette analyse sur. Cependant, chiots avec die obstruction bilatérale des voies urinaires après la naissance. Selon les caractéristiques des souris de laboratoire, une date et heure de collecte approprié devrait être empiriquement déterminée.
3. Spray éthanol à 70 % sur la surface ventrale abdominale et puis ouvrez la cavité abdominale sur le ventre à l’aide de ciseaux et pinces de dissection.
4. Lever tout l’utérus et le séparer du corps par une coupe avec les ciseaux à l’extrémité des cornes utérines de dissection.
5. Rincer tout l’utérus avec du PBS 1 x dans une boîte de Pétri.
6. Couper l’utérus bandes avec ciseaux de dissection et enlever decidua placentaire avec dissection forceps pour exposer les embryons en sacs vitellins.
7. Enlevez d’abord le sac vitellin et puis enlever la membrane amniotique avec dissection forceps pour libérer les embryons périnatales.
8. Décapiter un embryon avec ciseaux de dissection. Essuyer l’excès de sang avec tampons de gaze stérile. Cerner l’embryon avec sa face ventrale vers le haut sur un microscope à dissection équipé d’un appareil photo numérique pour l’imagerie. Sa queue pour le génotypage de recueillir si nécessaire.
   Remarque : Effectuez un embryon d’injections à la fois.
9. Ouvrez avec précaution la cavité abdominale d’un embryon avec une pince en déchirant la peau. Ensuite, retirez soigneusement excès organes et tissus tels que le foie, estomac et l’intestin avec une pince en les coupant ou en les tirant pour exposer les reins, les uretères et la vessie qui se trouvent sur le dos ( Figure 1 a). Absorber le sang excédentaire de l’embryon disséqué avec tampons de gaze stérile si nécessaire.
   NOTE : Sang excès interfère avec identification du bassinet pour l’injection de colorant.

3. Injection de colorant de bleu de méthylène dans le bassinet et le suivi des flux de colorant

1. enlever des bulles dans l’aiguille et le tube en l’expulsant de solution de bleu de méthylène de l’extrémité de l’aiguille de pression hydrostatique. Soulevez la seringue contenant la solution de colorant au-dessus du niveau de la pointe de l’aiguille pour faire couler souhaitée et puis abaissez la seringue pour arrêter l’écoulement.
2. Insérer l’aiguille dans le bassinet près de l’uretère proximal, en prenant soin de ne pas pour le déranger une fois placé. Effectuer l’injection de colorant dans un rein pour déterminer son obstruction des voies urinaires.
   Remarque : Effectuez teindre injection dans n’importe quel rein anormal ⁷ premier par suite de la même manière pour déterminer son obstruction des voies urinaires.
3. Lever la seringue jusqu'à environ 20 cm pour fournir la pression hydrostatique et laisser 15 µL - 60 µL de l’écoulement de solution de colorant. Le débit sera environ 3 µL/s si la seringue est portée à cette hauteur au-dessus de l’embryon.
4. Surveiller la couleur bleue du colorant partant en premier dans le bassinet, puis dans la longueur de l’uretère et enfin dans la lumière vésicale.
   Remarque : Il faut environ 5 s pour voir une couleur de teinture faible à émerger dans la lumière vésicale si l’uretère est correctement inséré dans la vessie. Permettre le colorant s’accumuler sur le site bloqué environ 15 s si aucune couleur de teinture apparaît dans la lumière vésicale.
5. Placer la seringue jusqu'à coule de colorant de stop et de retirer l’aiguille du rein.
6. Prendre des images du rein, l’uretère et la vessie tracée avec la solution de colorant à l’aide de l’appareil photo et imagerie programme relié à un stéréomicroscope.
7. Faire un compte rendu de l’hydronéphrose du rein, hydroureter et la position finale de la solution de colorant dans un cahier de laboratoire.
8. Perform injection du rein controlatéral comme décrit dans les sections 3.1) à 3,5) et permettent l’écoulement de colorant environ 20 s Autotal.
   NOTE : La lumière de la vessie sera remplie de solution de colorant, indiquée par une couleur bleue, si l’uretère est correctement insérée dans le lumen de la vessie. Après évaluation de l’obstruction de jonction des voies urinaires, les uretères et la vessie peuvent être fixés pour le sectionnement.

Résultats

Les reins et le système urinaire inférieur sont trouvent dorsal à la plupart des autres organes internes comme le foie et les intestins. Après avoir retiré ces autres organes internes, une paire de reins et uretères et la vessie unique sont visibles (Figure 1 a). Après dissection réussie, le colorant injecté dans le bassinet coulera du rein dans la vessie par l’uretère. Le bassinet est l’entonnoir dilatée partie proximale de l’uretère du rei...

Discussion

Les reins de souris sont fonctionnelles en commençant à E16.5 et un test d’injection de colorant est théoriquement possible à partir de ce point dans le temps. Toutefois, le rein est trop petit pour être injectés avec la solution de colorant et phénotypes comme hydronéphrose et hydroureter ne sont pas clairement respectées puisque ces phénotypes sont un effet secondaire de l’urine accumulée dues au transport de l’urine anormale. Ces phénotypes, des obstructions telles que UPJO ou UVJO, sont visibles à ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Quality Biological Inc. NORMAL SALINE - 500ML	Fisherscientific	50-983-204
3 mL disposable syringe with BD Luer-Lok tip	BD	309657
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane	Pall corporation	4614
Exel Scalp Vein (Butterfly) Sets; 27G x 3/4" 12"	EXELINT	26709
Delicate Operating Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6702
Micro Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5135
Dumont Tweezers; Pattern #5	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5045
BD PrecisionGlide Needles 30 G x 1/2"	BD	305106