单分子荧光原位杂交实验中单个大肠埃希菌细胞的转录标记方法

摘要

这篇手稿描述了一种方法, 标记个别信使 RNA (mRNA) 转录与荧光标记的 DNA 探针, 用于分子荧光原位杂交 (smFISH) 实验在大肠杆菌. smFISH 是一种可视化方法, 它允许在固定的单个细胞中同时检测、定位和量化单个 mRNA 分子。

摘要

一种方法被描述为标记单独信使 RNA (mRNA) 抄本在固定的细菌为使用在分子荧光原位杂交 (smFISH) 实验在大肠杆菌. smFISH 允许测量感兴趣基因的 mRNA 拷贝数的细胞变异, 以及转录的亚细胞位置。所涉及的主要步骤是固定的细菌细胞培养, 性的细胞膜, 和杂交的目标抄本与一套商业可用的短荧光标记寡核苷酸探针。smFISH 可以允许对同一细胞中的多个基因的转录进行成像, 并在不同荧光标记之间的频谱重叠施加限制。在下面所示的协议完成后, 细胞可以很容易地成像使用显微镜和适合低强度的荧光相机。这些图像, 连同从相衬框架的分割获得的细胞轮廓, 或从细胞膜染色, 允许计算的 mRNA 拷贝数分布的样本细胞使用开源或定制的软件。本文所描述的标记方法也可以应用于随机光学重建显微镜 (风暴) 的图像记录。

引言

随机性是基因表达的一个基本的和不可避免的方面, 并引起细胞细胞的异质性¹, 无论是在转录和蛋白质水平上的^2,3。在定义良好的条件下量化细胞间的变异性, 为基因表达及其调控的基本过程提供了一个独特的窗口。一个重要来源的细胞细胞异质性细菌发生在转录水平。成绩单的数量不仅因转录的随机性而异, 也因后的过程, 如由小 rna 和 RNAases²的调节。一种直接以定量方式访问这种异质性的方法是通过荧光标记特定基因在 smFISH 中的单个转录。这种方法允许检测和特定的 RNA 分子的亚细胞定位固定的, 个别的细菌单元⁴。基因与一组荧光标记的 ~ 20 基长的寡核苷酸杂交, 目的是选择性地绑定到感兴趣的记录^5,6。多重标记可确保在背景荧光之上检测, 而单个 mRNA 分子在荧光显微镜下显示为衍射限制斑点⁷ (见图 1)。还有其他方法来标记 mRNA 分子, 其中互补齐聚物探针携带共轭半 (如, 生物素或辛), 被检测使用第二荧光标记的记者技术⁸。

除了 smFISH, 还有其他方法可以提供关于成绩单的定量信息。一些, 如北印迹或定量 PCR, 探针的体积, 从而可以测量既不是 mRNA 的数量, 也不是他们的位置在单个细胞。因此, 这些方法不适合量化细胞的变异性。最近的一种基于图像的技术, 允许定量的 rna 的副本数量和细胞内的位置, 称为复用误差鲁棒荧光原位杂交 (MERFISH) 已经发展。MERFISH 是基于一个独特的条形码的分配, 由固定数量的荧光标记的寡核苷酸探针的定义组合。这些条形码在 smFISH 测量的连续的圆读出来, 与漂白跟随每轮杂交, 从而增加吞吐量由二个数量级^9,10。这种技术需要一个自动流体处理系统和适当的探头设置设计。

多重荧光标记的个人成绩单组合, 连同新的超分辨率技术, 如随机光学重建显微镜 (风暴)¹¹, 使分辨率增加十倍转录的亚细胞定位。在风暴中, 一个合适的组合荧光探针和成像缓冲允许多个周期的荧光发射每个探针分子 (闪烁)。风暴也可用于图像的大肠杆菌转录和观察 RNA 的全基因组的空间组织, 通过标签同时所有的记录的兴趣,¹²。

上述所有的单细胞方法都是基于固定细胞的成像记录。因此, 他们没有提供任何关于细胞内转录物的动力学特性的信息。要跟踪活细胞的转录¹³, 基因可以标记的基因的融合的利益, 以一个数组的绑定网站。后者由 RNA 结合的蛋白质认可, 例如噬菌体 MS2 外套蛋白质, 被熔化对荧光蛋白质例如绿色萤光蛋白质 (GFP)^10,14,15。

在这里, 我们描述一种方法, 标记个别基因与一组荧光标记的 DNA 探针, 用于 smFISH 实验, 特别是在大肠杆菌中使用。此外, 我们表明, 相同的标记方案可以用于风暴测量, 小修改。

研究方案

1. 探头设计

注: 本协议使用商业上可用的寡核苷酸探针已标记荧光。探针由一组与目标 mRNA 互补的特定序列组成, 每个探针被共轭到一个单一的荧光分子。或者, 可以将荧光标记附加到探测器上, 如其他地方所述^5,16。

1. 设计 smFISH 探针使用由阿金 Raj 开发的探针设计器¹⁶算法 (Oudenaarden 实验室, 马萨诸塞技术学院);本手稿中使用的 smFISH 探针序列列在材料表中。
   注意: 在一组检测信号中, 探头的最小数目是 ~ 30。确切的数字可能根据兴趣基因变化, 特别如果非常短的抄本被测量。
2. 选择适合光学设置的染料 (参见材料表)。
   注: Cy3 染料或光学等效染料与低易感性到相片漂白强烈推荐。双重标记的候选人是 Cy5 或光学上等效染料 (参见材料表)。在标记 mRNA 的风暴成像中, 合适的染料具有多周期荧光发射的能力。一些 smFISH 染料可用于风暴成像 (见材料表)。要对同一细胞中的不同基因的两个 (或更多) 抄本进行图像处理, 就应该选择共轭于染料的寡核苷酸探针, 其光谱很少或没有重叠。

2. 试剂制备

注意: 重要的是要保持样品无核糖核酸, 使用无核糖核酸的消耗品, 如过滤吸管提示和管, 并保持任何工作环境清洁。为了避免目标记录的退化, 所有使用的试剂都必须是无核酸的 (见材料表) 或 diethylpyrocarbonate (DEPC) 治疗和灭菌。

1. smFISH 的缓冲区
   1. 准备无核糖核酸的 1x PBS (磷酸盐缓冲盐水, 溶液的磷酸盐缓冲浓度为0.01 米, 氯化钠浓度为0.154 米, (pH 7.4))。稀释无核糖核酸的 10x PBS (参见材料表) 在无核酸的水中 (见材料表) 以 1:10 v/v 比。
      1. 或者准备 DEPC 处理的 1x PBS。
   2. 准备无核糖核酸的 2x SSC (生理盐水-柠檬酸钠缓冲液, 0.3 米氯化钠在0.03 米柠檬酸钠, (pH 7.0))。稀释无核糖核酸的 20x SSC (见材料表) 在核酸的水中以 1:10 v/v 的比例。
      1. 另外, 准备 DEPC 处理的 2x SSC。
2. 寡核苷酸探针库存解决方案。
   1. 重新溶解干寡核苷酸探针混合在200µL 的 TE 缓冲器 (10 毫米三盐酸, 1 毫米 EDTA, pH 8.0) 创造一个探针库存25µM. 移上和下, 然后漩涡和离心机简要地混合好。
   2. 为了避免冻结和解冻的股票溶液管, 使几个等分的股票解决方案, 对应的金额预计将使用在一个单一的实验运行。存储在-20 ° c 或以下的股票解决方案, 并保护免受光。
      注: 探针组 5 nmol 可以提供多达250杂交反应。
3. 杂交缓冲 (跟随剥皮器et al.⁷ ):
   1. 在50毫升聚丙烯锥底管上加入5毫升无核酸水。在水中加入1克葡聚糖硫酸酯, 并通过剧烈的涡流溶解。混合在一个轨道振动筛的内容, 直到气泡消失 (〜30分钟)。
   2. 添加到解决方案3530µL 的去离子甲酰胺, 10 毫克的大肠杆菌tRNA, 1mL 的 20x SSC, 100 µL 200 毫米钒 ribonucleoside 复合体和40µL 50 毫克/毫升 BSA。通过加 DEPC 处理的水或无核酸的水, 将最终的体积带到10毫升, 然后漩涡溶液直到它是均匀的。
      注意: 为了避免冻结和解冻的解决方案, 使几个等分的股票解决方案, 对应的金额预计将使用在一个单一的实验运行。储存在-20 ° c 的股票解决方案。在打开瓶子之前, 一定要让甲酰胺温暖到室温。为了减少背景, 建议校准最佳甲酰胺浓度 (10-40% v/v 比)。
      警告:警告!甲酰胺是剧毒和已知的致。避免接触眼睛或皮肤, 吸入或吞食。穿着实验室大衣和防护手套, 在通风橱下处理。
   3. 通过0.22 µm 过滤器对溶液进行灭菌。保持在等分和存储在-20 ° c, 长达一年。
4. 在 1x pbs 中加入37% 甲醛 (v/v) 至 1x pbs (见 2.1.1), 在 1:8 v/v 比和涡旋上制备固定缓冲剂 (4.6% 甲醛)。
   小心: 警告!甲醛是剧毒和已知的致癌物。穿着实验室大衣和防护手套, 在通风橱下处理。
5. 为 smFISH (2x ssc 中的20% 甲酰胺) 准备洗涤缓冲器, 将去离子甲酰胺加入到 2x ssc (见 2.1.2) 至1:4 伏/v 比和涡旋。
6. 通过添加5毫米半胱胺和氧清除剂 (7 µM 葡萄糖氧化酶、56 nM 过氧化氢酶和10% 葡萄糖 (w/v)) 清洗缓冲液 (2x SSC 中的20% 甲酰胺) 来制备 smFISH 的成像缓冲器
7. 缓冲风暴
   1. 准备缓冲 A, 加入50毫米的三盐酸和10毫米氯化钠, 以核酸无水。
      注: 在 RT 中存储多年。
   2. 准备缓冲 B, 加入50毫米的三盐酸盐, 10 毫米氯化钠, 和10% 核酸葡萄糖到无水。
      注: 贮存时间为4° c, 可达一年。
   3. 在1毫升的缓冲器 a 中溶解77毫克半胱胺, 以制备一个1米的溶液。
      注: 可储存在4° c 1 月。
   4. 将 8440 au (任意单位) 葡萄糖氧化酶和 70200 au 过氧化氢酶添加到1毫升缓冲 A, 准备 Gloxy 缓冲液。
      注: 制作50x 库存解决方案, 可存放在4° c 1 月。
   5. 通过在缓冲区 B 中添加 50 mM 缓冲区和 1x Gloxy 缓冲区, 准备风暴的成像缓冲器。
      注: 风暴成像缓冲器由5毫米半胱胺, 氧清除剂 (7 µM 葡萄糖氧化酶和 56 nM 过氧化氢酶) 在50毫米三与10毫米氯化钠, 和10% 葡萄糖在 pH 8.0。在成像前准备, 它可以存储和使用在 RT 约2小时。

3. 样品固定

1. 培养细菌细胞 (例如, e.

大肠杆菌 MG1655) 在生长培养基的选择 (如, LB 中等) 过夜阿齐兹·伊南轨道振动筛在 260 rpm 和37° c。
注意: 要确定由于探针的非特异性结合而产生的背景, 应按照相同的步骤进行测量, 在这种情况下, 应在已删除感兴趣的基因的应变中进行测试 (请参见图 1和δsodB中的δgalk 图 2)。

在新鲜培养基中稀释隔夜培养 1:100, 测量其光学密度 (OD₆₀₀) 在分光光度计中每〜 1 h, 其值为 0.2-0.4;4毫升的文化应该是足够的。
注: 如果所选显微镜没有相位对比度或差分干扰对比能力, 则大肠杆菌外膜可以用2μ m 脂溶性荧光标记 (见材料表) 标记, 应添加到细菌性悬浮20分钟前固定¹⁷。固定和进一步治疗是完成如下所述。必须注意选择具有不同发射谱的荧光标记, 以尽量减少与标记探针集的频谱重叠。

颗粒细胞由离心5分钟在 4500 g 在4° c。从所有管子中取出上清液。

加入1毫升的 1x PBS, 每管和重的颗粒, 以减少细胞聚集。然后轻轻地加入4毫升的固定缓冲液和涡旋。

在 260 rpm 的轨道振动筛中孵育30分钟, 在24° c。

颗粒细胞离心10分钟, 1000 克, 4 ° c。除去上清液。添加1毫升 1x PBS。

将悬浮液转移到1.8 µL 锥底微离心管 (见材料表), 重复步骤3.6 次。

4. 样品性

1. 非常小心地除去上清。如有必要, 使用小体积管, 除去颗粒外的所有液体。
2. 重在300µL DEPC 处理的水或无核酸水。添加350µL 高品位绝对乙醇 (99%), 并通过倒置管轻轻搅拌。再加入350µL 乙醇和混合, 以达到最终的乙醇浓度为 70% (v/v 比)。
   小心: 警告!乙醇是易燃的。
3. 在室温 (RT) 或在4° c 一夜之间旋转 20 rpm 的试管回转试样。样品可贮存在4° c 至一周。

5. 杂交

1. 颗粒细胞离心7分钟, 750 x g, 4 ° c。除去上清液。
2. 在样品上加入1毫升20% 洗涤缓冲器, 并离开站立几分钟, 或吸管完全溶解颗粒。
3. 颗粒细胞离心7分钟, 在 750 x g, 4 ° c。
4. 用移轻轻地除去清液。如有必要, 使用小体积管除去颗粒外的所有液体。
5. 加入寡核苷酸探针集料溶液到杂交缓冲分, 使最终的寡核苷酸浓度为 250 nM;漩涡大力。
   注意: 一个可以在同一单元格中同时标记两个或多个不同的目标基因。将两个目标的探测集添加到杂交缓冲中。必须注意选择具有不同发射光谱的染料, 以尽量减少频谱重叠 (例如、Cy3 和 Cy5)。确保用于风暴成像的样品与一个与合适的染料相结合的寡核苷酸探针集 (例如, 在材料表中) 杂交。
6. 在包含寡核苷酸探针的50µL 杂交缓冲中暂停样品 (见步骤 5.4), 同时避免产生气泡 (溶液相当粘性)。
7. 将样品隔夜放在30° c 的热块中。
   注: 在此之后, 样品可在4° c 下贮存长达6月。

6. 洗涤

1. 使用一个新的离心管为每个样品的图像。添加1毫升洗涤缓冲器。
2. 添加10-15 µL 从杂交样品到新的管, 包含洗涤缓冲和混合/漩涡。
3. 颗粒细胞由离心7分钟, 750 x g 在4° c。除去上清液。
   注意: 为减少背景, 孵育1小时在30° c。
4. 再洗两次 (重在1毫升洗涤缓冲液, 离心机和去除颗粒)。
5. 重在25µL 洗涤缓冲器。
   注: 为了减少光漂白, 可以在洗涤缓冲液中添加一个氧清除系统 (2.6), 以提高分子荧光实验的染料稳定性⁶。

7. 成像样品的制备

注意: 细胞需要固定, 以便在荧光和相衬显微镜下进行适当的成像。以下方法可用于准备样品, 在不同的焦平面上可以对不同的视场进行成像。

1. 琼脂糖凝胶制剂
   1. 添加150毫克琼脂糖到10毫升 2x SSC 缓冲。不要将 2x SSC 添加到琼脂糖中, 否则它将无法正常溶解。
   2. 每次10-15 秒的微波, 直到大气泡开始形成。放在一旁冷静几分钟。
   3. 在幻灯片上放置一个分离的硅胶框架, 使幻灯片的中心保持曝光。
   4. 在滑动中心放置一个10毫米宽 (1-2 毫米厚) 的刚性环, 并在其中沉积少量的凝胶, 用于封口。等待几分钟, 让它变硬。
   5. 添加更多的凝胶, 直到形成一个高圆顶形状。等待10分钟, 使其硬化, 并删除环 (使用细镊子或任何其他方法)。
   6. 沉积〜10μ l 洗涤的细菌细胞 (参见 6.5) 在胶凝体和封印与 #0 片幻灯片。
2. smFISH 室样品的制备
   1. 或者 (对步骤 7.1) 准备样品为成像通过固定洗涤细菌细胞 (参见 6.5) 在聚-d-赖氨酸被涂覆的玻璃底部一次性塑料培养皿。
   2. 在黑暗中孵育样品, 在室温下, 在可视化之前过夜, 使细胞黏附在表面。在可视化清洗前用洗涤缓冲器 (. 5);用洗涤缓冲器 (2.5) 或 smFISH (2.6) 的成像缓冲器使样品湿润。
3. 风暴室样品准备
   1. 准备在聚 d-赖氨酸涂层玻璃底部的成像风暴样品一次性塑料培养皿。
   2. 在黑暗中, 在 RT, 一夜之间孵化样品。在形象化洗涤以前用洗涤的缓冲为 smFISH (2.5);并为风暴 (2.7.5) 添加成像缓冲器。

8。字幕可视化

1. 具有一个机动阶段的广域荧光显微镜的图像细胞 (见材料表)。
   注意: 对于风暴的修改, 使用标记有染料的细胞可以多循环的荧光发射。图像的样品使用3D 超分辨率成像系统 (例如, 请参阅材料表)。
2. 使用 (推荐) 60-100x; #62; 1.3 油浸相对比物镜与强光源, 如汞或金属卤化物灯;led 光源也推荐使用。
3. 使用标准的冷 CCD 相机, 理想的优化低光水平成像而不是速度 (我们使用16µm 像素大小的相机) (见材料表)。
   注: 使用冷 EMCCD (电子倍增电荷耦合器件) 相机 CCD 相机是必要的, 以减少热噪声, 防止检测, 特别是单一分子。
4. 使用适合于所选荧光的筛选器集。
5. 为了确定适当的细胞边界, 在每个样品中获得不同视场的图像, 或者用相衬光学, 或者通过标记荧光外细胞膜。在不同的焦平面 (z 堆叠) 上获取图像 (通常13片被 250 nm 分开)。
   注: 显微镜和过滤器的电控阶段应由商业 (见材料表) 或 in-house 软件控制, 可以按顺序捕获一堆图像。

9. 数据分析

1. 将图像堆栈转换为适当的数据分析格式。
2. 估计的目标 mRNA 的拷贝数从总强度的荧光病灶的细胞, 而不是从计数离散的 "斑点", 在其他现有的协议。
3. 使用开源软件¹⁸或 custom-built 程序进行图像分析。有关数据成像和分析的详细信息, 请参阅斯金纳et al.⁷

结果

我们进行了 smFISH 测量的 galK 和 sodB 转录在大肠杆菌细胞。抄本与一组与目标序列互补的特定序列杂交, 每个探针被共轭到一个单一的荧光分子 (见材料表)。MG1655 野生型大肠杆菌菌株的荧光和相衬图像 (或 JW0740)¹⁹ galK-已删除的应变 (ΔgalK) 被暴露到2毫米 D-藻显示在图 1A和1B中。在接触 d-藻后, 细胞被固...

讨论

我们在实验室测量了使用 smFISH 方法 ²的大肠杆菌细胞中不同基因的转录数量。简而言之, 这个过程包括以下步骤: 细胞固定, 性的膜, 允许探针穿透, 探针杂交, 和样品成像使用标准的荧光显微镜。此过程基于以前发布的一些修改^6,7,16。此前有报道称, smFISH 要求寡核苷酸探针的数量在48-72 范围内, 以达到在...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran sulfate sodium salt	Sigma-Aldrich	D8906
Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute	Mallinckrodt Baker - Avantor	8025.25
Diethylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758
RNase-free 20X SSC	Life Technologies/Ambion	AM9763
RNase-free 10X PBS	Life Technologies/Ambion	AM9625
TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology	Sigma-Aldrich	93283
nuclease-free water	Thermo Fisher Scientific	10977035
Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water	Sigma-Aldrich	F8775
Deionized formamide, nuclease free	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM9342
E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia)	Sigma-Aldrich	R1753-500UN
UltraPure BSA (50mg/ml)	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM2616
Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM	New England Biolab	S1402S
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707
Cysteamine and oxygen	Sigma-Aldrich	30070
Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
D-fucose	Sigma-Aldrich	F8150
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution	Life Technologies	V2286
Agarose,low melting reagent	Sigma-Aldrich	A9414
Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0	Grace Bio-Labs	JTR24R-A2-2.0 666208
poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes	MatTek Corporation	P35GC-1.5-14-C
Super life nitrile powder free examination gloves	Supermax	TC-N-9889
Brand sterilization incubator tape	Sigma-Aldrich	BR61750
Microcentrifuge tubes (1.8 ml)	Axygen - Corning Life Sciences	MCT-175C
Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml)	BD Biosciences	352059
Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml)	Corning	430828
Serological pipettes (Corning 5 ml)	Corning Life Sciences	4051
Serological pipettes (Corning 10 ml)	Corning Life Sciences	4488
Serological pipettes (Corning 25 ml)	Corning Life Sciences	4251
Spectrophotometer cuvettes	Sarstedt	67.742
RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl	FroggaBio	FT20
RNase-free pipette tips 10 - 200 μl	Axigene/corning	TF-200
RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl	FroggaBio	FT1000
RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl	Sorenson	14200
Syringe disposile 10 mL needle G-21	Becton Dickinson, Biosciences	BD-309643
Minisart 0.2 um Syringe Filter	Sartorius	16534 K
Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc	Nikon	MXA20233
Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm	Thermo Fisher Scientific	421-004ET
#0 coverslip slide 24x60	Thermo Fisher Scientific/Menzel	BNBB024060A0
Orbital shaker	M.R.C	TOU-50
Hot block	M.R.C
Vortex	Fried Electric Company	G-560-E
Microcentrifuge	Eppendorf	5427R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller	Drummond Scientific Company	4-000-501-I
OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer	Midsci	OD600-10
iXon X3 EMCCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV
Eclipse Ti microscope	Nikon	MEA53100
CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13	Nikon	MRD31905
Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP	Nikon	49005
Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P	Nikon	49009
Nis-elements AR auto reaserch software	Nikon	MQS31000
STORM microscope	Vutara	SR-200
NA 1.2 water immersion objective	Olympus
SRX image acquisition and analysis software	Vutara
Evolve 512 EMCCD camera	Photometrics
Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye	Biosearch Technologies Inc	SMF-1083-5
Probe Sequence for galK mRNA:
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acgaaaccgtcgttgtagtc
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Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye	Biosearch Technologies Inc	SMF-1083-5
Probe Sequence for sodB mRNA:
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