שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה

Summary

כתב יד זה מתאר שיטת תיוג תעתיקים RNA שליח בודדים (mRNA) עם הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH היא שיטת הדמיה המאפשרת זיהוי בו זמנית, לוקליזציה, כימות של יחיד מולקולות mRNA בתאים בודדים קבוע.

Abstract

שיטה מתוארת עבור תיוג RNA שליח בודדים (mRNA) תעתיקים של חיידקים קבוע עבור שימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH מאפשר מדידת השתנות לתא במספר עותק ה-mRNA של הגנים של עניין, כמו גם המיקום subcellular של התרשימים. הצעדים העיקריים הכרוכים הינם קיבוע של התרבות תא החיידק, permeabilization של קרום התא, הכלאה של התרשימים היעד עם קבוצות של הגששים זמינים מסחרית oligonucleotide קצר עם התווית fluorescently. smFISH יכול לאפשר ההדמיה של התרשימים של גנים מרובים באותו התא, עם מגבלות שהוטלו על ידי ספקטרלי החפיפה בין סמנים שונה פלורסנט. בעקבות השלמת פרוטוקול מאויר להלן, תאים יכולים בקלות לדימות באמצעות מיקרוסקופ בשילוב עם מצלמה מתאימה פלורסצנטיות בעוצמה נמוכה. תמונות אלה, יחד עם קווי המתאר תא שהושג פילוח של שלב ניגודיות מסגרות, או קרום התא מכתים, לאפשר את החישוב של mRNA עותק מספר התפלגות דגימה של תאים באמצעות תוכנת קוד פתוח או שכתוב מותאמת אישית. שיטת תיוג המתוארים כאן גם יסייע לי תמונה תעתיקים עם מיקרוסקופ סטוכסטי שחזור אופטי (סערה).

Introduction

Stochasticity הוא היבט היסוד, נמנע של ביטוי גנים ונותן עלייה לתא-תא הטרוגניות¹, שניהם ברמה של תעתיקים, חלבונים^2,3. לכימות ההשתנות בין תאים בתנאים מוגדרים היטב מציעה חלון ייחודי תהליכים בסיסיים העומדים בבסיס ביטוי ובקרת גנים שלה. מקור חשוב אחד של תא-תא הטרוגניות של חיידקים מתרחש ברמת תעתיק. התעתיק מספרי משתנים לא רק בשל את stochasticity של שעתוק, אלא גם לתהליכים post-transcriptional כגון רגולציה על ידי קטן RNAs ו RNAases². דרך אחת של גישה ישירה זו הטרוגניות בצורה כמותית היא על-ידי תיוג fluorescently בודדים תעתיקים של גן מסוים ב- smFISH. מתודולוגיה זו מאפשרת זיהוי ולוקליזציה subcellular של מולקולות RNA מסוים בתוך תיקנו, תאים חיידקיים בודדים⁴. mRNAs הם hybridized עם קבוצה של fluorescently-ידי ~ 20 בסיס באורך oligonucleotides שנועדו לאגד באופן סלקטיבי תעתיקים של ריבית^5,6. תיוג מרובים מבטיחה זיהוי מעל רקע זריחה, מולקולות mRNA בודדות מופיעות נקודות עקיפה-מוגבלת תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות⁷ (ראה איור 1). ישנן גישות אחרות עבור תיוג מולקולות mRNA, שבו הגששים אוליגומר משלימים לשאת haptens מצומדת (למשל, ביוטין או digoxigenin) שזוהו באמצעות טכניקות משני כתב שכותרתו fluorescently⁸.

ישנן שיטות אחרות המספקים מידע כמותי אודות תעתיקים, בנוסף smFISH. כמה כמו הצפוני כתם או בדיקה הנפח PCR כמותי, ובכך יכול למדוד את מספר העותקים mRNA לא ולא עמדתם בתאים בודדים. לכן שיטות אלה אינם מתאימים לכמת השתנות מתא לתא. המערכת פותחה טכניקה המבוססת על תמונה האחרונות מאפשר כימות של הן מספר עותק RNAs בתוך התאים, כמו גם המיקום תאיים שלהם, שנקרא מרובב פלורסצנטיות שגיאה-חזקה בחיי עיר הכלאה (MERFISH). MERFISH מבוסס על ההקצאה של ברקוד ייחודי המורכב שילוב מוגדר של מספר קבוע של הגששים שכותרתו fluorescently oligonucleotide. ברקודים אלה נקראים סיבובים רציפים של מדידות smFISH, עם photobleaching הבאים בכל סיבוב של הכלאה, ובכך מגדיל את התפוקה על-ידי שני סדרי גודל^9,10. טכניקה זו מחייבת של נוזל אוטומטיות טיפול המערכת ואת העיצוב המתאים של ערכת בדיקה.

השילוב של קרינה פלואורסצנטית מרובים תיוג של תעתיקים בודדים, יחד עם טכניקות הרומן סופר-רזולוציה כגון שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה)¹¹, מאפשר גידול ten-fold רזולוציה לוקליזציה subcellular של הפרוטוקולים. בסערה, שילוב מתאים של הגששים פלורסנט ומאגר הדמיה מאפשר מספר מחזורים של פליטת קרינה פלואורסצנטית לכל מולקולה בדיקה (מהבהב). הסערה עשוי לשמש גם תמונה של e. coli transcriptome ולבחון את הגנום כולו הארגון המרחבי של RNA, על-ידי תיוג בו זמנית כל התרשימים של ריבית¹².

כל השיטות בתא יחיד שנסקרו לעיל מבוססים על הדמיה תעתיקים בתאים קבוע. לפיכך, הם אינם מספקים מידע כלשהו בדבר המאפיינים קינטי של תעתיקים בתוך התאים. לעקוב תעתיקים תאים חיים¹³, mRNAs יכול להיקרא על ידי היתוך גרעיני של הגן עניין למערך של איגוד אתרים. ואלו מכן מוכרות על ידי מחייב RNA חלבון, כמו bacteriophage MS2 המעיל חלבון, אשר היא דבוקה חלבון פלואורסצנטי כגון ה^14,10,חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)¹⁵.

כאן נתאר שיטת תיוג mRNAs בודדים עם סט של הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים smFISH, בפרט ב e. coli. יתר על כן, אנו מראים כי שיטת תיוג אותו עשוי לשמש למדידות סערה עם שינויים מזעריים.

Protocol

1. בדיקה עיצוב

הערה: פרוטוקול זה משתמשת oligonucleotide זמינים מסחרית הגששים כבר מתויג עם fluorophores. הגששים מורכב סט של משלים מטרה ספציפית רצפי mRNA, כל בדיקה להיות מצומדת כדי פלורסנט מולקולה בודדת. לחלופין, זה אפשרי לצרף סמני פלורסנט הגששים, כמתואר^5,16.

1. עיצוב smFISH הגששים באמצעות האלגוריתם¹⁶ מעצב בדיקה שפותחה על ידי Raj ארג'ון (ואן Oudenaarden מעבדה, המכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס); רצפים של הגששים smFISH בשימוש כתב יד זה מפורטים בטבלה של חומרים.
   הערה: המספר המינימלי של זונדי בערכת אות לזיהוי זה ~ 30. מספרם המדויק עשויים להשתנות בהתאם הגן של עניין, במיוחד אם תעתיקים קצר מאוד נמדדים.
2. לבחור צבע שמתאים הגדרת אופטי (ראה טבלה של חומרים).
   הערה: לצבוע Cy3 או של צבע שוות ערך שטיחות עם רגישות נמוכה כדי הלבנת-תמונה מומלצת מאוד. מועמד תיוג כפול הוא Cy5 או שוות ערך שטיחות לצבוע (ראה טבלה של חומרים). צבעים מתאימים עבור סערה הדמיה של mRNA שכותרתו מאופיינים שטמונה בהם מספר מחזורים של פליטת קרינה פלואורסצנטית. קצת צבע smFISH יכול לשמש עבור הדמיה סערה (ראה טבלה של חומרים). לשיקוף תעתיקים שני (או יותר) המתאים גנים שונים באותו התא, אחד צריך לבחור את הגששים oligonucleotide מצומדת כדי צבעי הספקטרום של מי יש חפיפה קטנה או לא.

2. מגיב הכנה

הערה: חשוב לשמור את הדגימות נטולת RNAse באמצעות נטולת RNase מתכלים כגון פיפטה מסוננים טיפים וצינורות, וכדי לשמור בכל סביבת עבודה נקייה. כדי למנוע השפלה של התרשימים היעד, ריאגנטים כל פעם בעקבות קיבוע תא להיות נטול נוקלאז (ראה טבלה של חומרים) או diethylpyrocarbonate (DEPC)- ובא מחוטא.

1. מאגרים עבור smFISH
   1. להכין ללא RNase PBS 1 x (buffered פוספט תמיסת מלח, פתרון עם ריכוז מאגר פוספט של 0.01 M, ריכוז נתרן כלוריד של 0.154 מ', (pH 7.4)). לדלל נטולת RNase PBS 10 x (ראה טבלה של חומרים) ב נוקלאז ללא מים (ראה טבלה של חומרים) ב 1:10 יחס v/v.
      1. לחילופין להכין שטופלו DEPC 1 x PBS.
   2. להכין ללא RNase 2 x SSC (תמיסת מלח-נתרן ציטראט מאגר, 0.3 M NaCl ב M 0.03 נקודות סודיום ציטרט, (pH 7.0)). לדלל נטולת RNase 20 x SSC (ראה טבלה של חומרים) במים נטולי נוקלאז בעשר: 1 יחס v/v.
      1. לחלופין, להכין 2 שטופלו DEPC x SSC.
2. Oligonucleotide בדיקה מניות פתרון.
   1. לפזר מחדש את התערובת בדיקה oligonucleotide יבשים ב 200 µL מאגר TE (10 מ מ טריס-HCl, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0) ליצירת מלאי רגש של 25 מיקרומטר. לערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה, ואז מערבולת, צנטריפוגה בקצרה.
   2. כדי למנוע את פריזר ואת הפשרה של הצינור פתרון מניות, להפוך מספר aliquots של הפתרון מניות, המתאים הסכום צפוי לשמש ניסיוני יחיד להפעיל. לאחסן את הפתרון מניות ב-20 ° C או להלן, להגן מפני אור.
      הערה: ערכה בדיקה של 5 nmol יכול לספק עד 250 ריאקציות הכלאה.
3. מאגר הכלאה (בעקבות סקינר. et al. ⁷ ):
   1. הוסף 5 מ ל מים נטולי נוקלאז לרכבת התחתית התחתונה חרוט פוליפרופילן 50 מ. להוסיף 1 g של סולפט לתוספי למים, להמיס על-ידי vortexing נמרצת. מערבבים את התוכן שייקר-מסלולית עד בועות נעלמים (~ 30 דקות).
   2. הוסף µL פתרון 3,530 של formamide יונים, 10 מ ג של e. coli tRNA, 1 מ"ל של 20 x האס, µL 100-200 מ מ vanadyl-ribonucleoside קומפלקס, µL 40 של 50 מ"ג/מ"ל BSA. להביא את עוצמת הקול הסופי 10 מ"ל על ידי תוספת של מים שטופלו DEPC או נוקלאז ללא מים, מערבולת הפתרון עד הוא הומוגני.
      הערה: כדי למנוע את פריזר ואת הפשרה של הפתרון, לבצע מספר aliquots של הפתרון מניות, המתאים הסכום צפוי לשמש ניסיוני יחיד להפעיל. חנות הפתרון מניות ב-20 ° C. הקפד לשחרר את formamide חמים לטמפרטורת החדר לפני פתיחת הבקבוק. כדי להפחית את הרקע, הוא הציע כדי לכייל את ריכוז אופטימלי formamide (10-40% יחס v/v).
      התראה: אזהרה! Formamide הוא רעיל מאוד, teratogen הידוע של. יש להימנע ממגע עם העיניים או העור, שאיפה או בליעה. . להתמודד עם זה ברדס fume בעת לבישת חלוק מעבדה וכפפות מגן
   3. לחטא את הפתרון על ידי העברתו דרך מסנן 0.22-מיקרומטר. לשמור על aliquots, לאחסן ב-20 ° C עד שנה אחת.
4. הכנת מאגר קיבעון (4.6% פורמלדהיד ב- 1 x PBS) על-ידי הוספת 37% פורמלדהיד (v/v) 1 x PBS (ראו 2.1.1) יחס v/v 1:8, מערבולת.
   אזהרה: אזהרה! פורמלדהיד הוא רעיל מאוד, חומר מסרטן ידוע. . להתמודד עם זה ברדס fume בעת לבישת חלוק מעבדה וכפפות מגן
5. להכין מאגר לשטוף smFISH (20% formamide 2 x SSC) על-ידי הוספת יונים formamide 2 x SSC (ראה 2.1.2) יחס v/v 1:4 ו מערבולת.
6. להכין מאגר הדמיה smFISH על-ידי הוספת 5 מ מ cysteamine וחמצן אוכלי נבלות (7 מיקרומטר גלוקוז אוקסידאז, קטלאז nM 56 ו- 10% גלוקוז (w/v)) כדי לשטוף את מאגר (20% formamide 2 x SSC)
7. מאגרים עבור סערה
   1. להכין מאגר על-ידי הוספת 50 מ"מ טריס-HCl 10 מ מ NaCl נוקלאז ללא מים.
      הערה: החנות RT במשך שנים.
   2. להכין מאגר B על-ידי הוספת 50 מ מ w/v טריס-HCl, 10 מ מ NaCl ו- 10% גלוקוז ללא נוקלאז למים.
      הערה: החנות 4 ° C עד שנה.
   3. להכין מאגר MEA על ידי המסת cysteamine 77 mg ב 1 מ"ל של מאגר A (עושה פתרון 1 מ').
      הערה: ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.
   4. להכין מאגר Gloxy על-ידי הוספת 8,440 AU (יחידות שרירותיות) גלוקוז אוקסידאז, קטלאז AU 70,200 מ ל 1 מאגר א
      הערה: גורם 50 x מניות פתרון, ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.
   5. להכין מאגר הדמיה סערה על-ידי הוספת 50 מ מ של מאגר MEA, 1 x Gloxy מאגר אל מאגר ב'
      הערה: המאגר הדמיה סערה מורכב 5 מ מ cysteamine נבלות חמצן (7 מיקרומטר גלוקוז אוקסידאז ו 56 קטלאז ננומטר) ב- 50 מ מ טריס עם 10 מ מ NaCl, גלוקוז 10% ב- pH 8.0. להכין רק לפני הדמיה, יכולים להיות מאוחסנים ב RT המשמש כ 2 h.

3. מדגם קיבוע

1. לגדל תאים חיידקיים (למשל, אי

קולי MG1655) בתקשורת צמיחה של בחירה (למשל, בינוני ליברות) לילה ענאן תפקודי לב / נשימה-260 סל ד ו- 37 מעלות צלזיוס.
הערה: כדי לקבוע את הרקע בשל הכריכה לא ספציפית של הגששים, מידות זן שבו נמחק את הגן עניין וצריך להתנהל, בעקבות אותם הליכים (ראה Δgalk ב איור 1 וδsodB ב איור 2).

לדלל את בטחונות תרבות לילה בינוני טריים ולמדוד את צפיפות אופטית (OD₆₀₀) בספקטרופוטומטר כל h ~ 1, עד ערך של 0.2 - 0.4; תרבות 4 מ"ל אמורה להספיק.
הערה: אם המיקרוסקופ שבחרת לא קיים שלב חדות או התערבות דיפרנציאלית חדות יכולות, e. coli ממברנות החיצוני ניתן שכותרתו עם 2 μM סמן פלורסנט lipophilic (ראה טבלה של חומרים), אשר צריך להוסיף ההשעיה חיידקי 20 דקות לפני קיבוע¹⁷. קיבוע וטיפול נוסף מוכשרות כמתואר להלן. חייבים להקפיד לבחור סמן פלורסנט יש ספקטרום פליטה שונה, כדי לצמצם את החפיפה ספקטרלי עם ערכת בדיקה עם התווית.

צניפה תאים על ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב g 4,500 ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע לכל הצינורות.

להוסיף 1 מ"ל של 1 x PBS כל שפופרת, resuspend בגדר כדי למזער את צבירת מתא לתא. לאחר מכן להוסיף 4 מ"ל של קיבעון מאגר ו מערבולת בעדינות.

דגירה בדגימות שייקר מסלולית-סל ד 260 למשך 30 דקות ב- 24 מעלות צלזיוס.

צניפה תאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות, 1000 גרם, 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע. הוסף PBS 1 x 1 מ"ל.

להעביר את המתלים 1.8 µL חרוט למטה מיקרו-צנטריפוגה צינורות (ראה טבלה של חומרים) וחזור על שלב 3.6 פעמיים.

4. מדגם Permeabilization

1. הסר בזהירות את תגובת שיקוע. השתמש פיפטות נפח קטן, במידת הצורך להסיר את כל הנוזל החוצה בגדר.
2. Resuspend 300 µL שטופלו DEPC במים או נוקלאז ללא מים. מוסיפים 350 µL כיתה גבוהה מוחלטת אתנול (99%) ומערבבים בעדינות על-ידי היפוך ברכבת התחתית. להוסיף עוד 350 µL של אתנול, מערבבים שוב, כדי להגיע ריכוז האתנול הסופי של 70% (יחס v/v).
   אזהרה: אזהרה! אתנול הוא דליק.
3. לסובב את הדגימה עם שפופרת מסובב ב rpm 20 לשעה בטמפרטורת החדר (RT), או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. דוגמאות ניתן לאחסן ב 4 ° C כשבוע.

5. הכלאה

1. צניפה תאים על ידי צנטריפוגה 7 דקות, 750 גרם x, 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע.
2. להוסיף 1 מ"ל 20% לשטוף את המאגר כדי הדגימות ולהשאיר במשך מספר דקות או פיפטה להתמוסס בגדר לחלוטין.
3. צניפה תאים על ידי צנטריפוגה במשך 7 דקות, ב- 750 x גרם, 4 מעלות צלזיוס.
4. הסר את תגובת שיקוע בעדינות על ידי pipetting. השתמש פיפטות בנפח מצומצם במידת הצורך להסיר את כל הנוזל החוצה בגדר.
5. להוסיף החללית oligonucleotide הגדר פתרון מניות aliquot מאגר הכלאה כך הריכוז oligonucleotide הסופי הוא 250 ננומטר; מערבולת נמרצות.
   הערה: אחד יכול תווית mRNAs מטרה שונים שניים או יותר בו זמנית באותו התא. להוסיף ערכות בדיקה של שתי מטרות המאגר הכלאה. חייבים להקפיד לבחור צבעי שיש ספקטרום הפליטה שונים כדי לצמצם את החפיפה ספקטרלי (למשל, Cy3 ו- Cy5). ודא כי דגימות מיועד סערה הדמיה הן hybridized עם בדיקה oligonucleotide להגדיר מצומדת עם צבע מתאים עבור סערה (למשל, בטבלה של חומרים).
6. להשעות דגימות (ראה שלב 5.4) 50 µL הכלאה מאגר המכיל את הגששים oligonucleotide, תוך הימנעות את הדור של בועות (הפתרון הוא צמיגה למדי).
7. יוצאים דגימות בן לילה על בלוק חם ב 30 מעלות צלזיוס בחושך.
   הערה: בעקבות זאת, דגימות ניתן לאחסן עד 6 חודשים ב 4 º C.

6. כביסה

1. להשתמש שפופרת אחת microcentrifuge חדש עבור כל דגימה על תמונות. להוסיף 1 מ"ל שטיפת מאגר.
2. להוסיף 10-15 µL בין דגימות hybridized הצינור החדש מכיל את מאגר לשטוף ואת תערובת/מערבולת.
3. צניפה תאים על ידי צנטריפוגה במשך 7 דקות, 750 גרם x-4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע.
   הערה: כדי לצמצם את הרקע, תקופת דגירה של 1 h ב- 30 ° C.
4. לשטוף פעמיים נוספות (resuspend במאגר שטיפת 1 מ"ל, צנטריפוגה ולהסיר גלולה).
5. Resuspend במאגר לשטוף µL 25.
   הערה: על מנת להפחית הלבנת-תמונה אחת ניתן להוסיף המאגר שטיפת חמצן ניקוי מערכת (2.6) כדי לשפר את יציבות צבען מולקולה בודדת פלורסצנטיות ניסויים⁶.

7. הכנת דוגמאות עבור הדמיה

הערה: תאים צריך להיות מרותק למיטה על מנת לאפשר הדמיה תקין תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות, שלב-ניגודיות. ניתן להשתמש בשיטות הבאות כדי להכין דוגמאות שבו השדות מבט שונות יכול לדימות-מטוסים מוקד שונים.

1. הכנת ג'ל Agarose
   1. להוסיף 150 מ"ג agarose למאגר x SSC 10 מ ל 2. אל תוסיף 2 x SSC כדי agarose, אחרת זה לא יתמוסס כראוי.
   2. מיקרוגל עבור s 10-15 בכל פעם עד בועות גדולות מתחילים להיווצר. להפריש להתקרר כמה דקות.
   3. המקום מסגרת סיליקון הפרדת בשקופית כך המרכז של השקופית נשאר חשוף.
   4. במקום טבעת נוקשה 10 מ מ רחב (1-2 מ מ עובי) במרכז השקופית, להפקיד כמות קטנה של ג'ל בו עבור איטום. המתן מספר דקות בשביל זה להקשיח.
   5. הוסף ג'ל נוסף עד נוצרת צורת כיפה גבוהה. חכה 10 דקות בשביל זה להקשיח, ולהסיר את הטבעת (באמצעות פינצטה בסדר או כל שיטה אחרת).
   6. להפקיד ~ 10 μL של שטף תאים חיידקיים (ראה 6.5) על ג'ל, חותם עם מגלשת coverslip #0.
2. הכנת הדוגמא קאמרית עבור smFISH
   1. לחילופין (לשלב 7.1) הכין דוגמיות הדמיה על ידי שיתק את שטף תאים חיידקיים (ראה 6.5) על פולי-D-ליזין-מצופה זכוכית תחתון חד פעמיות מפלסטיק צלחות פטרי.
   2. דגירה בדגימות בחושך, בטמפרטורת החדר, בין לילה לפני להדמיה כדי לאפשר הדבקה של תאי השטח. לפני ויזואליזציה לשטוף פעם עם שטיפת מאגר (. 5); שמור את הדגימה רטוב עם שטיפת מאגר buffer(2.5) או הדמיה עבור smFISH (2.6).
3. תא הדגימה לקראת סופה
   1. להכין דגימות סערה עבור הדמיה על פולי-D-ליזין-מצופה זכוכית תחתון חד פעמיות מפלסטיק צלחות פטרי.
   2. דגירה בדגימות בחושך, ב RT, בן לילה. לפני ויזואליזציה לשטוף פעם עם שטיפת המאגר עבור smFISH (2.5); ולהוסיף מאגר הדמיה עבור סערה (2.7.5).

8.התעתיק ויזואליזציה

1. תמונה תאים עם מיקרוסקופ שדה רחב פלורסצנטיות מצויד שלב ממונע (ראה טבלה של חומרים).
   הערה: עבור השינוי סערה, השתמש תאים עם תוויות עם צבע מסוגל מספר מחזורים של פליטת קרינה פלואורסצנטית. תמונת מדגם באמצעות מערכת הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה סופר (למשל, עיין בטבלה של חומרים).
2. שימוש (מומלץ) 60-100 x N.A > 1.3 שמן טבילה שלב ניגודיות המטרה עדשה עם מקור אור חזק, כגון כספית או מטאל-הליד; מקורות אור מבוססי LED גם הם מומלצים.
3. שימוש רגיל מקורר מצלמת CCD, אידיאלי אופטימיזציה עבור הדמיה ברמה נמוכה-אור יותר מאשר מהירות (אנו משתמשים מצלמה עם 16 גודל פיקסלים מיקרומטר) (ראה טבלה של חומרים).
   הערה: השימוש של EMCCD מקורר (אלקטרון הכפלת חיוב מצמידים התקן) מצלמה CCD מצלמה יש צורך להפחית את הרעש תרמית המונעת זיהוי, במיוחד של מולקולות יחיד.
4. שימוש במסנן מגדיר מתאים fluorophores שבחרת.
5. כדי לקבוע כראוי תא לגבולות התא, לרכוש תמונות של שדות מבט שונות בכל מדגם עם אופטיקה חדות שלב, או על-ידי תיוג fluorescently קרום התא החיצוני. לרכוש תמונות-מטוסים מוקד שונים (z-מחסנית) עבור כל הערוצים (בדרך כלל הפרוסות 13 מופרדים 250 ננומטר נלקחים).
   הערה: השלב ממונע של המיקרוסקופ, מערכות סינון של צריכה להיות נשלטת על ידי מסחרי (ראה טבלה של חומרים) או תוכנה שבאתר ניתן ללכוד ערימה של תמונות ברצף.

9. ניתוח נתונים

1. להמיר את אוספי תמונות לתבנית מתאימה לניתוח נתונים.
2. להעריך את עותק מספר היעד mRNA בעצימות הכולל של מוקדים פלורסנט בתא, ולא סופר דיסקרטית 'כתמים' כמו פרוטוקולים אחרים הזמינים כרגע.
3. לבצע ניתוח תמונות עם תוכנת קוד פתוח¹⁸ או עם תוכנית לפי הזמנה. לפרטים על נתונים הדמיה וניתוח ראו סקינר. et al. ⁷

תוצאות

אנחנו ביצעו smFISH מדידות של הפרוטוקולים galK ו- sodB בתאים e. coli . התמלילים היו hybridized עם סט של רצפים ספציפיים משלים הרצף היעד, כל בדיקה להיות מצומדת כדי פלורסנט מולקולה בודדת (ראה טבלה של חומרים). קרינה פלואורסצנטית ושלב חדות תמונות של MG1655 פראי-סוג e. coli זן (WT) או JW0740 (אוסף ק...

Discussion

לנו יש למדוד במעבדה שלנו המספר תעתיק של גנים שונים ב e. coli תאים באמצעות שיטת smFISH². בקצרה, ההליך מורכב מהשלבים הבאים: תא קיבעון, permeabilization של ממברנות כדי לאפשר חדירה בדיקה, בדיקה הכלאה, וטעמו הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה. נוהל זה מבוסס על אלה שפורסמו בעבר ע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran sulfate sodium salt	Sigma-Aldrich	D8906
Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute	Mallinckrodt Baker - Avantor	8025.25
Diethylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758
RNase-free 20X SSC	Life Technologies/Ambion	AM9763
RNase-free 10X PBS	Life Technologies/Ambion	AM9625
TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology	Sigma-Aldrich	93283
nuclease-free water	Thermo Fisher Scientific	10977035
Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water	Sigma-Aldrich	F8775
Deionized formamide, nuclease free	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM9342
E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia)	Sigma-Aldrich	R1753-500UN
UltraPure BSA (50mg/ml)	Thermo Fisher Scientific/Ambion	AM2616
Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM	New England Biolab	S1402S
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707
Cysteamine and oxygen	Sigma-Aldrich	30070
Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU	Sigma-Aldrich	G2133
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
D-fucose	Sigma-Aldrich	F8150
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution	Life Technologies	V2286
Agarose,low melting reagent	Sigma-Aldrich	A9414
Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0	Grace Bio-Labs	JTR24R-A2-2.0 666208
poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes	MatTek Corporation	P35GC-1.5-14-C
Super life nitrile powder free examination gloves	Supermax	TC-N-9889
Brand sterilization incubator tape	Sigma-Aldrich	BR61750
Microcentrifuge tubes (1.8 ml)	Axygen - Corning Life Sciences	MCT-175C
Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml)	BD Biosciences	352059
Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml)	Corning	430828
Serological pipettes (Corning 5 ml)	Corning Life Sciences	4051
Serological pipettes (Corning 10 ml)	Corning Life Sciences	4488
Serological pipettes (Corning 25 ml)	Corning Life Sciences	4251
Spectrophotometer cuvettes	Sarstedt	67.742
RNase-free pipette tips 0.2 - 20 μl	FroggaBio	FT20
RNase-free pipette tips 10 - 200 μl	Axigene/corning	TF-200
RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl	FroggaBio	FT1000
RNase-free pipette tips 100 - 1000 μl	Sorenson	14200
Syringe disposile 10 mL needle G-21	Becton Dickinson, Biosciences	BD-309643
Minisart 0.2 um Syringe Filter	Sartorius	16534 K
Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc	Nikon	MXA20233
Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm	Thermo Fisher Scientific	421-004ET
#0 coverslip slide 24x60	Thermo Fisher Scientific/Menzel	BNBB024060A0
Orbital shaker	M.R.C	TOU-50
Hot block	M.R.C
Vortex	Fried Electric Company	G-560-E
Microcentrifuge	Eppendorf	5427R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller	Drummond Scientific Company	4-000-501-I
OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer	Midsci	OD600-10
iXon X3 EMCCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV
Eclipse Ti microscope	Nikon	MEA53100
CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13	Nikon	MRD31905
Filter set (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP	Nikon	49005
Filter set (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P	Nikon	49009
Nis-elements AR auto reaserch software	Nikon	MQS31000
STORM microscope	Vutara	SR-200
NA 1.2 water immersion objective	Olympus
SRX image acquisition and analysis software	Vutara
Evolve 512 EMCCD camera	Photometrics
Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye	Biosearch Technologies Inc	SMF-1083-5
Probe Sequence for galK mRNA:
gtgttttttctttcagactc
tagccaaatgcgttggcaaa
ctgaatggtgtgagtggcag
caccaatcaaattcacgcgg
acgaaaccgtcgttgtagtc
tgataatcaatcgcgcaggg
gtggtgcacaactgatcacg
acgcgaactttacggtcatc
gctgattttcataatcggct
gcatcgagggaaaactcgtc
gttttcatgtgcgacaatgg
cacgccacgaacgtagttag
ttacgcagttgcagatgttt
tccagtgaagcggaagaact
tgctgcaatacggttccgac
gtccagcggcagatgataaa
tgaccgttaagcgcgatttg
agcctacaaactggttttct
gcggaaattagctgatccat
aaggcatgatctttcttgcc
cagtgagcggcaatcgatca
tgggcatggaaactgctttg
gatgatgacgacagccacac
gggtacgtttgaagttactg
gtgttgtattcgctgccaac
ggtttcgcactgttcacgac
tggctgctggaagaaacgcg
ttcaatggtgacatcacgca
catgcgcaacagcgttgaac
ggcgttttcagtcagtatat
atacgtttcaggtcgccttg
tgagactccgccatcaactc
gaaatcatcgcgcatagagg
caatttgcggcacggtgatt
ttgacgatttctaccagagt
acctttgtcgccaatcacag
ggatcagcgcgacgatacag
atattgttcagcgacagctt
gtctctttaatacctgtttt
ctccttgtgatggtttacaa
Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye	Biosearch Technologies Inc	SMF-1083-5
Probe Sequence for sodB mRNA:
gtgttttttctttcagactc
tagccaaatgcgttggcaaa
ctgaatggtgtgagtggcag
caccaatcaaattcacgcgg
acgaaaccgtcgttgtagtc
tgataatcaatcgcgcaggg
gtggtgcacaactgatcacg
acgcgaactttacggtcatc
gctgattttcataatcggct
gcatcgagggaaaactcgtc
gttttcatgtgcgacaatgg
cacgccacgaacgtagttag
ttacgcagttgcagatgttt
tccagtgaagcggaagaact
tgctgcaatacggttccgac
gtccagcggcagatgataaa
tgaccgttaagcgcgatttg
agcctacaaactggttttct
gcggaaattagctgatccat
aaggcatgatctttcttgcc
cagtgagcggcaatcgatca
tgggcatggaaactgctttg
gatgatgacgacagccacac
gggtacgtttgaagttactg
gtgttgtattcgctgccaac
ggtttcgcactgttcacgac
tggctgctggaagaaacgcg
ttcaatggtgacatcacgca
catgcgcaacagcgttgaac
ggcgttttcagtcagtatat
atacgtttcaggtcgccttg
tgagactccgccatcaactc
gaaatcatcgcgcatagagg
caatttgcggcacggtgatt
ttgacgatttctaccagagt
acctttgtcgccaatcacag
ggatcagcgcgacgatacag
atattgttcagcgacagctt
gtctctttaatacctgtttt
ctccttgtgatggtttacaa