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摘要

大体积基因表达测量在异构细胞种群中云个体细胞差异。在这里, 我们描述了一个关于如何通过花期活化细胞分类 (immunophenotypically) 的单细胞基因表达分析和指数排序的协议, 以描绘异质性和分子不同细胞种群的特征。

摘要

免疫表型表征和分子分析长期以来被用来描绘异质性和定义不同的细胞种群。流式细胞法本质上是单细胞检测, 但在分子分析之前, 靶细胞通常是预先分离的, 从而失去单细胞分辨率。单细胞基因表达分析提供了一种方法来了解异质细胞种群中单个细胞之间的分子差异。在大容量细胞分析中, 不同细胞类型的过多会导致稀有细胞的信号偏倚和闭塞, 具有生物学重要性。利用流化指数分选与单细胞基因表达分析相结合, 可以在不损失单细胞分辨率的情况下研究种群, 同时捕获具有中间细胞表面标记表达的细胞, 从而使评估连续曲面标记表达式的相关性。在这里, 我们描述了一种方法, 结合单细胞逆转录定量 PCR (rt-pcr) 和流化酶指数排序, 同时表征细胞种群内的分子和免疫表型异质性。

与单细胞 RNA 测序方法不同的是, 使用具有特定靶向扩增的 qPCR, 可以对低丰度的转录物进行稳健的测量, 减少辍学量, 同时不混淆读深度。此外, 通过直接将单细胞分选成裂解缓冲液, 这种方法可以在一步内进行 cDNA 合成和特定靶向扩增, 以及随后的分子特征与细胞表面的相关性标记表达式。所描述的方法是研究造血单细胞, 但也被成功地用于其他细胞类型。

总之, 本文所述的方法允许对预先选择的基因组进行 mRNA 表达的敏感测量, 并有可能开发用于随后的分子不同亚群的未来分离的协议。

引言

每个单独的血细胞被认为驻留在细胞的层次结构中, 其中干细胞形成了一系列日益承诺的中间祖细胞顶部的顶点, 最终分化成具有特定的最终效应细胞生物功能1。许多关于干细胞系统是如何组织的知识是在造血系统中产生的, 这主要是因为能够前瞻性地隔离高浓度的干细胞或各种祖细胞的不同造血种群2的排序。这允许许多这些人口被分析功能或分子, 主要通过基因表达分析3,4。然而, 当分析大体积种群的基因表达时, 细胞间的个体差异平均为5, 损失较大。因此, 如果细胞的小子集占该种群6的推断生物学功能, 那么无法检测异质细胞分数内的细胞对细胞的变化可能会混淆我们对关键生物过程的理解, 7。相反, 在单细胞分辨率的基因表达特征的研究提供了一种可能性, 描绘异质性和规避遮蔽影响从8个以上的单元格子集。

迄今已开发出许多单细胞基因表达分析的协议;每种方法都有自己的注意事项。最早的方法是 rna 荧光原位杂交 (rna-鱼), 它一次测量有限数量的转录, 但它是唯一的, 它允许调查 RNA 本地化9,11。早期的方法使用 PCR 和 qPCR 检测单个或很少的转录, 也开发了12。然而, 这些最近被取代了基于微流体的方法, 可以同时分析数以百计的每细胞在数以百计的细胞通过 qPCR 的表达, 从而允许高维异质性分析使用预先确定的基因面板10,13。最近, 基于 RNA 测序技术已广泛用于单细胞分析, 因为这些理论可以测量细胞的整个转录组, 从而为异质性分析10添加探索维度, 14. 复用的 qPCR 分析和单细胞 RNA 测序具有不同的特征, 因此使用这两种方法的基本原理取决于所问的问题以及目标种群中的细胞数量。当未知细胞或大种群被调查时, 每个细胞的高通量和低成本以及无偏的、探索性的单细胞 RNA 测序特性是可取的。然而, 单细胞 RNA 测序也偏向于更频繁地测序高丰富的转录, 而低丰度的成绩单容易辍学。这可能导致相当复杂的数据, 使高要求的生物信息学分析, 以揭示重要的分子信号, 往往微妙或隐藏在技术噪声15。因此, 对于特征良好的组织, 使用预先确定的底漆面板选择用于功能重要基因或分子标记的单细胞 qPCR 分析可以作为一种敏感、直接的方法来确定人口。然而, 应该指出的是, 与单细胞 RNA 序列相比, 单细胞的 qPCR 方法的每个细胞的成本通常更高。在这里, 我们描述了一种结合单细胞 rt-pcr 的方法 (从 Teles J. 16), 将指数排序17和生物信息学分析18 , 以同时表征种群内的分子和免疫表型异质性。

在这种方法中, 细胞种群的兴趣被染色, 单细胞通过直接在96孔 PCR 板的裂解缓冲液中进行排序。同时, 在流式排序过程中, 为每个单个单元记录一组附加的单元表面标记的表达式级别, 该方法称为索引排序。随后用微流控平台对裂解细胞材料进行扩增, 并用 rt-pcr 分析了选定基因组的基因表达。该策略可对已排序的单细胞进行分子分析, 同时表征每个细胞的细胞表面标记表达。通过直接将分子不同的细胞子集映射到索引排序标记的表达式, 可以将亚群链接到可用于潜在隔离的特定免疫表型。图 1中逐步概述了该方法。预先确定的基因面板进一步有助于更高分辨率的靶向基因表达, 因为它绕过不相关的丰富的基因的测量, 否则可能咬合微妙的基因表达信号。此外, 具体的靶向放大、一步反转转录和扩增允许对低表达转录物 (如转录因子或非聚仍然 rna) 进行稳健测量。重要的是, qPCR 方法允许测量融合蛋白的 mRNA, 这在调查某些恶性疾病时非常重要19。最后, 被调查的基因的重点数量, 低辍学率, 和有限的技术差异的细胞使这种方法容易分析相比, 更高的维度方法, 如单细胞 RNA-通过遵循该协议, 可以在三天内完成整个实验, 从分拣细胞到分析结果, 使之成为敏感、高通量单细胞基因表达分析的一种简单而快速的方法。

研究方案

1. 裂解板的制备

  1. 使用 RNA/DNA 自由工作台, 准备足够的裂解缓冲液为96孔, 10% 额外, 通过混合390µL 核酸酶游离水, 17 µL 10% NP-40, 2.8 µL 10 毫米 dNTP, 10 µL 0.1 M DTT 和5.3 µL 核糖核酸酶抑制剂 (见材料表)。涡旋向下。
  2. 将4µL 裂解缓冲液分布到96孔 PCR 板的每个井中, 并用胶膜密封板。在盘子底部旋下管子以收集液体。保持板在冰上直到细胞分类 (最大24小时)。

2. 细胞分选用细胞的制备

  1. 解冻适当数量的细胞 (这里, CD34 丰富的造血干细胞和祖细胞) 为实验。1 x 106细胞适用于对大约三96孔板的单单元与控制进行排序。
  2. 将解冻的细胞转移到一个15毫升锥形管和添加1毫升 FBS 每年三十年代, 直到总体积8毫升达到。离心机中的旋转细胞在 350 x g , 10 分钟, 在4摄氏度和去除上清液。
  3. 在8毫升染色缓冲液中重悬细胞 (PBS 与 2% FBS) 和离心在 350 x g 10 分钟在4摄氏度和删除上清。
  4. 在200µL 染色缓冲液中重悬细胞, 去除细胞以控制污渍。
  5. 通过染色50µL 染色缓冲液中的一小部分细胞, 使荧光减去每个荧光基团的一个控制 (FMOs)。在本例中, 使用2万细胞的6微量离心管作为 FMOSs。请注意, 应根据调查的人口调整单元格的数量。添加所有抗体在相同浓度与样品染色除一到每个管。
  6. 为每个荧光染料染色一小部分细胞在50µL 缓冲液中使用的每一个荧光。在本例中, 使用了6微量离心管和2万细胞。请注意, 每个抗体的目标需要由用于控制的单元格表示。添加每个抗体在相同浓度, 如在单个管的样品染色。另外, 在50µL 中保持2万未染色细胞作为未染色控制。
  7. 对细胞样本, 添加抗体在其适当的浓度。在这里使用的是 CD34-FITC 在1/100 浓度, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 和血统混合: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, 和CD235a-PECy5 1/1000。
  8. 在黑暗中在冰上孵育30分钟的抗体细胞。
  9. 用3毫升染色缓冲液洗涤细胞。离心细胞在 350 x g 10 分钟在4摄氏度和删除上清。
  10. 重悬细胞并重复步骤2.9。
  11. 在500µL 和 FMOs 的100µL 染色缓冲液中重悬样品, 1/100 7AAD, 通过50µm 过滤器过滤细胞以获得单细胞悬浮液。

3. 细胞分类

  1. 请确保在最近根据制造商的说明执行的丢弃延迟和细胞仪设置和跟踪 (CST) 正确设置了流式处理机, 以确保适当的单元格被排序。对于造血细胞, 建议使用85微米喷嘴和最大速度 4, 而最佳事件率介于800和2000事件/秒之间。
  2. 通过执行荧光补偿和根据 FMO 控制或内部负控制设置栅极来校正频谱重叠。
  3. 通过将至少100个靶细胞分为100µL 染色缓冲液的新微量离心管, 对目标种群进行重新分析。通过记录已排序的样本并确保它们最终出现在排序门中, 流对排序的单元格进行分析。
  4. 在96孔板中, 通过将井 A1 中的滴放在一起来设置单细胞板排序。当它居中, 排序 50–100 6 µm 颗粒到所有井周围的空96孔板的边缘, 以确保所有水井将得到一个细胞在每个井的中心。
  5. 如果可能的话, 可以通过对单细胞进行体外生长的分类来增加对存活细胞进行排序的额外控制。造血细胞可以生长在 U 底96孔板100µl 随机有限元1% 青霉素链霉素, 100 ng/毫升 FLT3L, TPO 和 SCF。使用显微镜对细胞菌落进行3天的培养, 分析每一个井。
  6. 从板上取下胶膜。将单个感兴趣的单元格 (这里的 Lin-CD34+CD38 单元) 排序为96个井中的 92, 在流式存储分类软件中激活索引排序, 以保存每个单个单元格的免疫表型配置文件 (这里 CD45RA、CD49f 和 CD90)。
  7. 在 PCR 扩增中, 分别对两个10和20单元的井进行线性控制。井 H1 和 H2 通常使用。
  8. 保持两个井没有任何细胞作为无模板控制, 通常井 H3 和 H4。
  9. 用透明的胶膜封住盘子, 在 300 x g处旋转板1分钟, 然后在干冰上结冰。
  10. 将冷冻板储存在-80 摄氏度。
    注意: 安全停止点。经过分类和裂解的细胞可以保持在-80 摄氏度的长期贮存。

4. 反转转录和特定目标放大

  1. 为所有96基因目标准备底漆组合, 添加2µL 每个引物对, 包括家政基因引体和引钉在控制 rna, 在一个1.5 毫升核糖核酸酶自由管在 RNA/DNA 自由工作台。如果使用少于96引物, 添加一个相同体积的核酸酶游离水为缺失的引物。引物单独订购, 以匹配所需的基因面板。
  2. 通过添加632.5 µL 2x 反应组合、101.2 µL Taq/SuperscriptIII、151.8 µL 引物组合和0.7 µL 在控制 RNA 中的刺入, 进行反转转录和特定靶放大混合。在无 DNA 的长凳上进行此步骤。混合通过涡旋和旋转向下收集液体在管的底部。继续冰, 直到样品添加。
  3. 通过混合27.5 µL 的2x 反应混合物、1.76 µL Taq 酶、6.6 µL 的引物混合物和2.64 µL 的游离酶, 对四孔进行无反转转录控制组合。控制 RNA 的峰值。在 DNA 自由工作台上执行此步骤。漩涡和旋转向下收集液体在管的底部, 并保持在冰, 直到添加到样品。
  4. 解冻冰上的裂解板。将先前准备好的反转转录和特定目标扩增组合的8.75 µL 添加到92个孔中, 包括线性和无模板控制。将8.75 µL 的无反转转录控制组合添加到剩余的四个井中。密封板用透明的胶膜和旋转向下收集液体在盘子的底部。
  5. 根据前置放大器程序在 PCR 机上运行板坯反转转录和特定靶放大;步骤 1:50 °c 60 分钟, 步骤 2:95 °c 2 分钟, 步骤 3:95 °c 十五年代, 步骤 4:60 °c 4 分钟, 重复步骤 3–4 24 次, 最后步骤 5: 8 °c 永远。
  6. PCR 完成后, 将板材保持在8摄氏度, 用于短期储存和-20 摄氏度的长期贮存。
    注意: 安全停止点。放大后的材料可以保持在8摄氏度的短期存储和-20 °c 长期存储。

5. 制备多孔微流控基因表达分析样品和试验板

  1. 在96孔板的每个井中, 通过移液3µL 测定加载试剂制备测定加载板。将每个底漆的3µL 添加到测定加载板中的单个井中。
  2. 密封板与胶膜和旋转向下收集液体在盘子的底部。
  3. 将8µL 核酸酶游离水移入96孔板的所有井中, 制备稀释板。将2µL 的放大样品加入稀释板, 最终稀释1:5。
  4. 密封板与胶膜, 混合涡旋板十年代, 最后旋转下来收集液体在盘子的底部。
  5. 通过仔细混合352µL 的主混合物和35.2 µL 样品加载试剂, 准备样品装载混合物。在96孔板的每孔中将3.3 µL, 准备样品加载板。
  6. 将稀释样品中的2.7 µL 添加到样品加载板的每个井中。
  7. 密封板与胶膜和旋转向下收集液体在盘子的底部。

6. 微流控芯片的加载

  1. 取出一个新的 96 x 96 微流控芯片。用带帽的注射器戳它们来准备进水口, 以确保它们可以移动。
  2. 从注射器中取出气泡。在每个阀门上加满容积的注射器, 同时将芯片倾斜45度并按下阀门。主芯片与 IFC 控制器。
  3. 在测定加载板的每个孔中加载每个检测入口, 每µL 4.25 个。避免气泡。如果气泡出现在井中, 请用移液头将其移除。
  4. 继续加载每个样品进口与4.25 µL 从每个井在样品加载板, 避免气泡, 如果气泡出现, 删除它们与移液头。
  5. 使用 IFC 控制器加载芯片。
  6. 检查芯片是否看起来均匀, 所有腔室是否已装入。用胶带接触, 去除芯片表面的灰尘。在多重微流控基因表达平台上运行芯片。

7. 在多路微流控基因表达平台上运行芯片

  1. 将芯片装入多重微流控基因表达平台后, 命名样品。
  2. 将火箭设置为无源染料。将单个探针和 MGB 设置为荧光。使用 96 x 96 标准 v2 作为协议。开始运行。
  3. 运行完成后删除芯片。

8. 芯片运行的初步分析

  1. 将数据加载到实时 PCR 分析软件中。
  2. 通过从制表符分隔的文件中粘贴单元格和基因布局来加载基因名称和细胞名称。
  3. 打开图像视图并选择 ROX 作为染料。检查所有油井是否有火箭被动染料。
  4. 调查所有放大图是否看起来正常, 与平滑放大曲线没有尖峰 (类似于图 3E)。
  5. 确保所有单细胞都有刺入控制 RNA 的表达式, 以确保所有的电池都已正确加载。
  6. 确保所有细胞都有家务基因表达, 因此已正确排序。
  7. 确保10和20单元线性度控制有大约 1 CT 差, 以验证线性放大。
  8. 检查 noRT 控件示例中是否存在表达式。如果在 noRT 中检测到表达式, 请考虑将探针更改为未检测到后续运行的基因组 DNA 的探针。
  9. 导出 csv 文件中的数据以供进一步分析。

9. 使用 SCExV 进行单细胞分析

注: 介绍本工具的介绍性薄膜为20 。本文介绍了如何使用协议中引入的控件进行分析的简短建议。

  1. 连接到 SCexV 网站20。
  2. 上载导出的 CSV 文件。
  3. 选择了刺入控制 RNA 作为阳性对照。移除任何有控制 RNA CT 25 以上的细胞。将数据规范化为控制 RNA 的中值表达式。
  4. 点击 "这里完成-> 分析"。在 "排除单元格" 选项中删除 noRT、notemplate、10和20单元格控件。
  5. 群集单元格的聚类方法选择具有预期的簇数。导出分析值。

10. 索引排序分析

  1. 打开流分析软件并加载索引样本。
  2. 打开脚本编辑器并运行由奎恩 J 提供的脚本. 21
  3. 现在, 数据流分析软件应该为每个单个单元格设置一个门, 打开布局编辑器, 并根据从 SCexV 的分组 (在名为 "Sample_complete_Data. xls" 的文件中可用) 对单元格进行着色。

结果

所描述的协议是快速、易于执行和高度可靠的。图 1给出了实验设置的概述。整个协议, 从单细胞的排序, 到特定的目标放大, 基因表达测量和初步分析可以在三天内进行。以热图的形式分析结果的一个例子, 它表示从单细胞基因表达分析中使用96引物和96个细胞从慢性髓性白血病 (CML) 患者或96细胞从老年匹配健康的初步分析数据控件如?...

讨论

近年来, 单细胞基因表达分析已成为定义不同细胞种群23的异质性的重要补充。RNA 测序技术的出现在理论上提供了测量细胞的整个转录组的可能性, 然而这些方法由于细胞到细胞测序深度和辍学的变化而变得复杂。单细胞的 qPCR 提供了对数以百计的关键基因的表达的灵敏和稳健的分析, 其中所有细胞的处理类似, 减少技术噪音。有限数量的成绩单的集中分析还允许简化分析, 而不会...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了瑞典癌症协会、瑞典研究委员会、瑞典医学研究协会、瑞典儿童癌症基金会、拉格纳 Söderberg 基金会以及克努特和爱丽丝基金会的资助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
CD14 PECY5eBioscience15-0149-42Clone: 61D3
CD16 PECY5Biolegend302010Clone: 3G8
CD56 PECY5Biolegend304608Clone: MEM-188
CD19 PECY5Biolegend302210Clone: HIB19
CD2 PECY5Biolegend300210Clone: RPA-2.10
CD3 PECY5Biolegend300310Clone: HIT3a
CD123 PECY5Biolegend306008Clone: 6H6
CD235A PECY5BD Pharma559944Clone GAR2
CD34 FITCBiolegend343604Clone: 561
CD38 APCBiolegend303510Clone: Hit2
CD90 PEBiolegend328110Clone: 5E10
CD45RA BV421BD bioscience560362Clone: HI100
CD49f Pecy7eBioscience25-0495-82Clone: eBioGOH3
FBSHyCloneSV30160.3
PBSHyCloneSH30028.02
96-well u-bottom PlateVWR10861-564
SFEMStem cell technologies9650
Penicillin streptomycinHyCloneSV30010
TPOPeprotech300-18
SCFPeprotech300-07
FLT3LPeprotech300-19
Falcon Tube 15 mLSarstedt62.554.502
Eppendorph tubeSarstedt72.690.001
CST beadsBD642412
Accudrop BeadsBD3452496 µm particles 
Adhesive film ClearThermo scientific AB-1170
Adhesive film FoilThermo scientific AB-0626
96 well PCR plateAxygenPCR-96M2-HS-C
PCR 1.5 mL tubeAxygenMCT-150-L-C
T100 PCR cyclerBioRad186-1096
10% NP40Thermo scientific 85124
10 mM dNTPTakara4030
0.1 M DTTInvitrogenP2325
RNAsoutInvitrogen10777-019RNAse inhibitor
CellsDirect One-Step qRT-PCR KitInvitrogen11753-100
Neuclease free waterInvitrogen11753-100from CellsDirect kit
2x Reaction MixInvitrogen11753-100from CellsDirect kit
SuperScript III RT/Platinum Taq MixInvitrogen11753-100from CellsDirect kit
Platinum Taq DNA PolymeraseInvitrogen10966026
TaqMan Cells-to-CT Control KitInvitrogen4386995
Xeno RNA ControlInvitrogen4386995From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression AssayInvitrogen4386995From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCsFluidigmBMK-M10-96.96
2x Assay Loading ReagentFluidigmFrom 96.96 Sample/Loading Kit
20x GE Sample Loading ReagentFluidigmFrom 96.96 Sample/Loading Kit
Control line fluid FluidigmFrom 96.96 Sample/Loading Kit
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystems4369016
BioMark HDFluidigmBMKHD-BMKHD
96.96 Dynamic Array IFCFluidigmBMK-M10-96.96GT
ExcelMicrosoftMicrosoft
FlowJo V10TreeStarTreeStar
Fluidigm real time PCR analysisFluidigmFluidigm
CD179a.VPREB1Thermofisher scientificHs00356766_g1
ACEThermofisher scientificHs00174179_m1
AHRThermofisher scientificHs00169233_m1
BCR_ABL.52Thermofisher scientificHs03043652_ft
BCR_ABL41Thermofisher scientificHs03024541_ft
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CCNB1Thermofisher scientificHs01030099_m1
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CCNCThermofisher scientificHs01029304_m1
CCNE1Thermofisher scientificHs01026535_g1
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CCR9Thermofisher scientificHs01890924_s1
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