JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

תפזורת ג'ין ביטוי מדידות ענן תא בודד הבדלים באוכלוסיות הטרוגניות תא. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור ביטוי מפענוח ואינדקס איך החד-תאיים מיון על-ידי Florescence מופעל התא מיון (FACS) יכול להיות משולב על הטרוגניות, immunophenotypically מאפיינות אוכלוסיות תאים נפרדים מולקולרי.

Abstract

Immunophenotypic אפיון וניתוח מולקולרית זמן רב השתמשו ניסחו הטרוגניות ולהגדיר אוכלוסיות תאים נפרדים. FACS הוא מיסודו assay מתא בודד, אולם לפני ניתוח מולקולרית, תאי היעד מבודדים לעיתים קרובות פרוספקטיבי בצובר, ובכך לאבד רזולוציה תא בודד. תא בודד מפענוח ביטוי מספק אמצעים כדי להבין את ההבדלים מולקולרי בין תאים בודדים באוכלוסיות הטרוגניות תא. בניתוח תא בכמות גדולה overrepresentation מסוג תאים נפרדים התוצאה הטיות occlusions של אותות מתאי נדיר עם חשיבות ביולוגית. על ידי ניצול FACS אינדקס מיון מצמידים ניתוח ביטוי גנטי מתא בודד, אוכלוסיות יכול ייחקרו ללא האובדן של תא בודד רזולוציה בזמן תאים עם ביטוי סמן משטח תאים ביניים גם נלכדים, המאפשרת הערכת הרלוונטיות של הביטוי סמן משטח רציף. כאן, אנו מתארים גישה המשלבת שעתוק במהופך תא בודד PCR (RT-qPCR) וסטטיסטי FACS אינדקס מיון במקביל לאפיין את מולקולרית והטרוגניות immunophenotypic בתוך התא אוכלוסיות.

לעומת שיטות רצף של RNA מתא בודד, השימוש qPCR עם הגברה ביעד מסוים מאפשר למדידות חזקים של הפרוטוקולים נמוך-שפע עם פחות תקלות, בזמן זה הוא לא מבולבל על ידי נושאים הקשורים לתא וריאציות בלקריאה עומק. יתר על כן, על-ידי ישירות מיון אינדקס חד-תאים לתוך פירוק מאגר בשיטה זו, מאפשר cDNA סינתזה הגברה קדם ביעד מסוים שיש לבצע צעד גם לגבי המתאם של חתימות מולקולרית נגזר לאחר מכן עם משטח תא סמן ביטוי. הגישה המתוארת פותחה כדי לחקור hematopoietic חד-תאים, אך גם שימשו בהצלחה על סוגי תאים אחרים.

לסיכום, הגישה המתוארים בזאת מאפשרת מדידה רגיש של mRNA הביטוי של הגנים שנבחרו מראש עם האפשרות על פאנל לפתח פרוטוקולים עבור בידוד פוטנציאליים עוקבות של subpopulations מולקולרי ייחודי.

Introduction

כל תא דם בודדים הוא האמין להתגורר בהיררכיה של הסלולר, שבו תאי גזע טופס השיא על סדרת מחויב יותר ויותר אבות ביניים, כי בסופו של דבר סופני להבדיל לתוך התאים אפקטור הסופי נושא ספציפי תפקודים ביולוגיים1. רוב הידע על איך תא גזע מערכות מאורגנות נוצר במערכת hematopoietic, בעיקר בגלל היכולת לבודד פרוספקטיבי אוכלוסיות hematopoietic ברורים מאוד מועשר בתאי גזע או אבות שונים2 על-ידי מיון FACS. זו אפשרה עבור רבים של אוכלוסיות אלה כדי להיות מנותח באופן פונקציונלי או מולקולרי, בעיקר דרך ביטוי גנים פרופילים3,4. אולם כאשר ניתוח ביטוי גנים של צובר אוכלוסיות הבדלים אינדיבידואליים בין התאים שהגוף, איבדתי5. לפיכך, חוסר היכולת לזהות וריאציות לתא בתוך התא הטרוגנית שברים עשויים לבלבל את ההבנה שלנו של תהליכים ביולוגיים קריטי אם קבוצות משנה קטנה של תאים חשבון עבור הפונקציה הנגזרת הביולוגי של האוכלוסייה הזאת6, 7. לעומת זאת, החקירה של ג'ין חתימות ביטוי ברזולוציה תא בודד מציעים אפשרות ניסחו הטרוגניות, לעקוף מאפילה השפעות של קבוצות משנה overrepresented של תאים8.

עד כה פותחו פרוטוקולים רבים לניתוח ביטוי גנים מתא בודד; עם כל גישה יש אזהרות משלו. השיטה המוקדמת ביותר היה RNA פלורסנט בחיי עיר הכלאה (RNA-דג), אשר מודד את מספר מוגבל של הפרוטוקולים בכל פעם אבל הוא ייחודי בכך שהוא מאפשר לחקירה של RNA לוקליזציה9,11. שיטות מוקדמות באמצעות PCR qPCR כדי לזהות שיחיד או תעתיקים מעטים מאוד היו גם פיתח12. עם זאת, אלה לאחרונה הוחלפו על-ידי שיטות מבוססות מיקרופלואידיקה אשר ניתן בו זמנית לנתח את הביטוי של מאות תעתיקים בכל תא מאות תאים דרך qPCR, ובכך לאפשר הטרוגניות גבוהה-ממדי באמצעות ניתוח מראש נקבע ג'ין לוחות10,13. לאחרונה טכנולוגיות מבוססות רצפי RNA יש להיות בשימוש נרחב עבור ניתוח תא בודד, ככל אלה תיאורטית יכול למדוד את כל transcriptome של התא ובכך להוסיף מימד גישוש הטרוגניות ניתוח10, 14. ניתוח qPCR Multiplexed ורצף RNA בתא יחיד יש תכונות שונות, ובכך הרציונל לשימוש באחת מהשיטות תלוי השאלה כמו גם מספר התאים באוכלוסיית היעד. תפוקה גבוהה ועלות נמוכה בכל תא יחד עם מאפיינים לא משוחד, גישוש של רצפי RNA בתא יחיד בעת רצוי התא לא ידוע או אוכלוסיות גדולות נחקרות. עם זאת, רצפי RNA בתא יחיד גם מוטה לטובת קביעת רצף תעתיקים שופע גבוהה בתדירות גבוהה יותר, בעוד תעתיקים עם שפע נמוכה נוטים נשירה. זה יכול להוביל נתונים מורכבים במידה ניכרת שמעבירות גבוהה-דרישות על ניתוח bioinformatic לגלות אותות מולקולריים חשוב כי הם לעיתים קרובות עדינים או מוסתרים רעש טכני15. לכן, בשביל לרקמות מאופיין היטב, qPCR תא בודד באמצעות ניתוח שנקבע מראש לוחות פריימר שנבחר עבור גנים חשיבות תפקודית או סמנים מולקולריים יכול לשמש גישה רגיש פשוטה כדי לקבוע את הטרוגניות של אוכלוסייה. עם זאת, יצוין כי לעומת העלות לכל תא RNA בתא יחיד-seq, הוא בדרך כלל גבוה יותר עבור שיטות qPCR תא בודד. כאן, אנו מתארים גישה המשלבת תא בודד RT-qPCR (שונה Teles ג'יי. et al. 16), לאינדקס FACS מיון במקביל17 ו ביואינפורמטיקה ניתוח18 על מנת לאפיין את הטרוגניות המולקולריים immunophenotypic בתוך אוכלוסיות.

בגישה זו, האוכלוסייה תא עניין היא מוכתמת, חד-תאים ממוינים על-ידי FACS ישירות לתוך מאגר פירוק ב 96-ובכן PCR צלחות. בו זמנית, רמות הביטוי של קבוצה נוספת של התא-פני סמני נרשמים לכל תא יחיד במהלך FACS-מיון, שיטה שבה מתייחסים כאל מיון אינדקס. החומר תא lysed לאחר מכן מוגבר וניתח בביטוי הגן של קבוצת גנים שנבחרו עם RT-qPCR, באמצעות פלטפורמה microfluidic. אסטרטגיה זו מאפשרת ניתוח מולקולרית של מיון מתא בודד, כמו גם בו זמנית האפיון תא-פני סמן ביטוי של תא בודד כל. על-ידי ישירות מיפוי מולקולרי ייחודי קבוצות משנה של תאים לביטוי סמני אינדקס ממוינים, subpopulations יכולים להיות מקושרים כדי immunophenotype ספציפי שיכול לשמש לבידוד פוטנציאליים שלהם. השיטה המותווה צעד אחר צעד באיור1. פאנל ג'ין שנקבע מראש עוד תורמת רזולוציה גבוהה יותר של ביטוי גנים יישוב, מאז זה עוקף מדידה של הגנים שופע לא רלוונטי יכול אחרת occlude אותות ביטוי הגן מעודן. יתר על כן, הגברה יעד ספציפיות, שעתוק במהופך צעד אחד, הגברה מאפשרת מדידה חזקים של תעתיקים ביטוי נמוך, כמו גורמי שעתוק או הלא-פולי-adenylated RNAs. חשוב לציין, שיטות qPCR מאפשרים מדידה של mRNA של פיוז'ן חלבונים, אשר חשובים כאשר חוקרים מסוימים במחלות ממאירות19. בסופו של דבר, המספר ממוקד של גנים חקרו, שיעורי הנשירה נמוך, ולא מוגבל הבדלים טכניים בין תאים להפוך שיטה זו נותחו בקלות לעומת שיטות מימד גבוה יותר, כגון RNA בתא יחיד-תת סעיף לפי הפרוטוקול, ניסוי כולו יכול להתבצע, מיון תאי לתוצאות שנותחה, בתוך שלושה ימים, ממציא זה שיטה מסובכת ומהיר עבור ניתוח ביטוי גנטי תא בודד רגיש, תפוקה גבוהה.

Protocol

1. הכנת פירוק לוחות

  1. באמצעות ספסל חינם RNA/DNA, להכין מאגר מספיק פירוק וולס 96, עם 10% נוספים, על ידי ערבוב מים חינם נוקלאז µL 390, 17 µL של 10% NP-40, 2.8 dNTP 10 מ מ µL, µL 10 0.1 M DTT, 5.3 µL RNAse מעכב (ראה טבלה של חומרים). מערבולת, ספין מטה.
  2. פזר µL 4 פירוק המאגר כדי כל טוב של צלחת PCR טוב 96, לאטום את הצלחות עם סרט דביק. ספין למטה צינורות לאיסוף נוזלים בתחתית של הלוחות. לשמור על צלחות על הקרח עד התא מיון (מקסימום 24 שעות).

2. הכנה של תאים מיון תא

  1. להפשיר מספר מתאים של תאים (כאן, גזע hematopoietic מועשר CD34 ו ובתאים) לניסוי. עונה 1 פרק 106 תאים מתאימים לצורך מיון כ שלושה 96-ובכן צלחות חד-תאים עם פקדים.
  2. להעביר תאים המופשרים צינור חרוטי 15 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל FBS כל 30 s עד הנפח הכולל של 8 מ ל. לסובב תאים ומפרידה ב x 350 גר' 10 דקות ב 4 ° C ולהסיר תגובת שיקוע.
  3. Resuspend התאים ב- mL 8 מכתים מאגר (PBS עם 2% FBS), צנטריפוגה ב x 350 גר' 10 דקות ב 4 ° C, להסיר את תגובת שיקוע.
  4. תאים resuspend מכתים µL 200 מאגר ולהסיר תאים עבור פקד כתמים.
  5. להפוך פלורסצנטיות מינוס אחד פקדים (FMOs) עבור כל fluorophore, על-ידי מכתימה שבריר של תאים ב- 50 µL מכתים מאגר. בדוגמה זו, צינורות microcentrifuge 6 עם 20,000 תאים משמשים FMOSs. שימו לב כי מספר התאים צריך להיות מותאם בהתאם האוכלוסייה חקר. להוסיף לכל הנוגדנים ריכוז זהה כמו הכתם מדגם חוץ מאחד את כל שפופרת.
  6. הפוך כתמי יחיד עבור כל fluorophore על ידי צביעת שבריר של תאים במאגר µL 50 עבור כל fluorophore בשימוש. בדוגמה זו נעשה שימוש 6 צינורות microcentrifuge עם תאים 20,000. שימו לב כי היעד עבור כל נוגדן צריך לבוא לידי ביטוי על ידי התאים המשמש עבור פקדים. להוסיף כל נוגדן ריכוז זהה כמו הכתם מדגם צינורות בודדים. בנוסף לשמור תאים וללא רבב 20,000 50 µL כפקד של וללא רבב.
  7. לדגימת תא, להוסיף נוגדנים שלהם הריכוז המתאים. בשימוש להלן CD34-FITC-ריכוז 1/100, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50, שושלת היוחסין מיקס: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, ו CD235a-PECy5 1/1000.
  8. דגירה תאים עם נוגדנים במשך 30 דקות על קרח בחושך.
  9. לשטוף תאים עם 3 מ"ל מכתים מאגר. צנטריפוגה תאים ב x 350 גר' 10 דקות ב 4 ° C, להסיר את תגובת שיקוע.
  10. Resuspend תאים וחזור על שלב 2.9.
  11. Resuspend מדגם 500 µL ו- FMOs 100 µL מכתים מאגר עם תאים 7AAD ומסנן 1/100 דרך מסנן 50 מיקרומטר לקבל השעיה תא בודד.

3. מיון תא

  1. ודא כי המכשיר FACS מוגדר עד כראוי עם טיפה עיכוב ו cytometer ההתקנה ומעקב (CST) שבוצעו לאחרונה על פי הוראות היצרן, כדי להבטיח כי התאים המתאים ממוינים. עבור תאים hematopoietic, מומלץ השימוש של מיקרון 85 זרבובית, מקסימום מהירות 4, בעוד שיעור אירוע האופטימלי הוא בין 800 ל- 2000 אירועים/s.
  2. ולתיקון ספקטרלי חפיפה על-ידי ביצוע קרינה פלואורסצנטית פיצויים וקבע השערים על-פי FMO בפקדי או פנימי שלילי.
  3. לבצע בצמחייה של אוכלוסיית היעד על-ידי מיון תאי היעד לפחות 100 לתוך צינור microcentrifuge עם 100 µL הכתם המאגר. FACS לנתח את התאים ממוינות על ידי רישום המדגם ממוינים ולוודא כי הם מסיימים השער מיון.
  4. הגדרת תא הלוח היחיד מיון לפי מרכוז ירידה A1 טוב בצלחת טוב 96. כאשר, ממורכזת לסווג חלקיקים מיקרומטר 50 – 100 6 לתוך כל הבארות שמסביב לקצה צלחת ריקה טוב 96 להבטיח כי כל בארות יקבלו תא במרכז של כל טוב.
  5. במידת האפשר, ניתן להוסיף פקד נוספים כדי להבטיח כי התאים קיימא ממוינים על-ידי מיון חד-תאים לצמיחה במבחנה . יכול להיות גדל התאים Haematopoietic U-התחתון 96 הצלחות טוב 100 µl SFEM עם 1% פניצילין סטרפטומיצין, 100 ננוגרם למ"ל FLT3L, TPO ו- SCF. לנתח כל טוב אחרי 3 ימים בתרבות על מושבות תאים באמצעות מיקרוסקופ.
  6. הסר את סרט דביק של צלחות. סוג הריבית (כאן לין-CD34 + CD38-תאים) לתוך 92 מתוך הבארות 96, תא בודד להפעיל אינדקס-מיון FACS מיון תוכנה לשמירת הפרופיל immunophenotypic עבור סמנים אחרים עניין (כאן CD45RA, CD49f ו CD90) עבור כל תא יחיד.
  7. למיין שתי בארות עם תאים 10 ל- 20 בהתאמה עבור פקדים ליניאריות הגברה PCR. וולס H1 ו- H2 משמשים בדרך כלל.
  8. שמרו שתי בארות ללא תאים לא-תבנית שולט, בדרך כלל בארות H3 ו- H4.
  9. לאטום את הצלחות עם סרט דביק ברור ולסובב את הצלחות ב x 300 גרם במשך 1 דקה לפני snap קפוא בקרח יבש.
  10. חנות צלחות קפוא ב-80 מעלות צלזיוס.
    הערה: לנקודת עצירה בטוח. ניתן לשמור תאים ממוינים ו lysed ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.

4. הפוך שעתוק ו ביעד מסוים הגברה

  1. להכין את תערובת פריימר כל המטרות גנים 96 על-ידי הוספת 2 µL של כל זוג פריימר, כולל ניקיון הגן תחל ותחל לבקרת עלה ב- RNA, 1.5 מ ל RNAse צינור חינם על ספסל חינם RNA/DNA. אם משתמש תחל פחות מ 96, להוסיף אמצעי מקביל של נוקלאז מים חינם עבור תחל החסר. תחל מסודרים בנפרד כדי להתאים את לוח הגן הרצוי.
  2. להפוך את שעתוק במהופך הגברה ביעד מסוים לערבב על-ידי הוספת 632.5 µL 2 x תערובת התגובה, 101.2 µL Taq/SuperscriptIII, 151.8 מיקס פריימר µL ו- 0.7 µL עלה בפקד ה-RNA. Preform שלב זה על ספסל ללא ה-DNA. מיקס על ידי vortexing ו ספין למטה כדי לאסוף הנוזל בתחתית של הצינור. לשמור בקירור עד בנוסף הדגימה.
  3. להפוך ללא היפוך שעתוק שליטה מיקס עבור מארבע בארות על ידי ערבוב 27.5 µL של 2 x תערובת התגובה, 1.76 µL של האנזים Taq, µL 6.6 של פריימר מיקס µL 2.64 נוקלאז מים חינם. ספייק בפקד ה-RNA. יש לבצע פעולה זו על ספסל ללא ה-DNA. מערבולת, ספין למטה כדי לאסוף הנוזל בתחתית של התחתית, לשמור על הקרח עד תוספת מדגם.
  4. הפשרת צלחות lysate על הקרח. להוסיף µL 8.75 של שעתוק במהופך בעבר מוכן, יעד ספציפיות הגברה מיקס וולס 92, כולל את הפקדים ליניאריות, לא-תבנית. להוסיף µL 8.75 של מיקס בקרת שעתוק ללא היפוך הבארות ארבעת הנותרים. חותם צלחות עם סרט דביק ברורה ו ספין למטה כדי לאסוף נוזלים בתחתית של הלוחות.
  5. Preform שעתוק במהופך, הגברה ביעד מסוים על-ידי הפעלת המשטח במכונת ה-PCR על-פי התוכנית preamp; שלב 1:50 ° C עבור 60 דקות, שלב 2: 95 ° C למשך 2 דקות, צעד 3: 95 ° C 15 s, שלב 4: 60 ° C למשך 4 דקות, חזור על שלבים 3-4 24 פעמים, ולבסוף שלב 5: 8 ° C לנצח.
  6. בתום ה-PCR, לקחת את הצלחת ב 8 ° C לאחסון לטווח הקצר ו-20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
    הערה: לנקודת עצירה בטוח. ניתן לשמור חומר מוגבר 8 מעלות לאחסון לטווח קצר וכן ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך.

5. הכנה של הדגימה ואת וזמינותו צלחות ניתוח ביטוי גנטי Microfluidic מולטיפלקס

  1. להכין assay טעינת צלחת על ידי pipetting 3 µL Assay הטעינה מגיב על כל טוב של צלחת טוב 96. להוסיף 3 µL של פריימר כל בארות בודדים וזמינותו טעינת צלחת.
  2. חותם צלחת עם סרט דביק, ספין למטה כדי לאסוף נוזלים בתחתית של הלוחות.
  3. להכין צלחת דילול על ידי pipetting 8 µL של נוקלאז מים חינם לתוך בארות כל צלחת טוב 96. להוסיף 2 µL מדגם מוגבר לצלחת דילול, גורם לדילול הסופי של 1:5.
  4. לאטום את הצלחת עם סרט דביק, לערבב מאת vortexing צלחת 10 s, סוף סוף ספין למטה כדי לאסוף נוזלים בתחתית של הלוחות.
  5. הכן תערובת טעינה הדגימה על ידי ערבוב µL 352 של מיקס מאסטר עם 35.2 µL של ריאגנט טעינה הדגימה. להכין צלחת טעינה הדגימה על-ידי µL aliquoting 3.3 בטעינה שילוב כל טוב של צלחת טוב 96.
  6. להוסיף 2.7 µL מתוך המדגם מדולל לבאר כל המדגם טעינת צלחת.
  7. חותם צלחת עם סרט דביק, ספין למטה כדי לאסוף נוזלים בתחתית של הלוחות.

6. טעינה של שבב Microfluidic

  1. להוציא שבב microfluidic, 96x96 חדש. הכן אינלטס על ידי לדקור אותם בעזרת מזרק עם מכסה על כדי לוודא כי הם ניתנים להעברה.
  2. הסר בועות מזרקים. להוסיף נפח מלא של מזרקים כל שסתום תוך כדי הטיית השבב 45 מעלות, לוחץ השסתום. השבב העיקרי עם בקר IFC.
  3. לטעון כל כניסת assay עם 4.25 µL מכל הנוגע לבארות וזמינותו טעינת צלחת. להימנע בועות. אם שהבועות מופיעות הבאר, להסיר אותם עם טיפ פיפטה.
  4. להמשיך לטעון כל כניסה מדגם עם 4.25 µL מכל הבארות במדגם טעינת צלחת להימנע בועות, אם מופיעות בועות, להסיר אותם עם טיפ פיפטה.
  5. לטעון שבב עם בקר IFC.
  6. בדוק כי השבב נראה אפילו כי טעינת כל צ'יימברס. להסיר אבק מפני השטח שבב על ידי נגיעה בו עם קלטת. להפעיל את השבב פלטפורמת ביטוי של גנים מולטיפלקס microfluidic.

7. מפעיל את שבב על פלטפורמת ביטוי גנים Microfluidic מולטיפלקס

  1. לאחר טעינת השבב לתוך פלטפורמת ביטוי של גנים microfluidic מולטיפלקס, שם את הדגימה.
  2. הגדר רוקס לצבוע פסיבי. הגדר החללית יחיד ואת FAM-MGB זריחה. השתמש v2 סטנדרטי, 96x96 פרוטוקול. תתחיל לרוץ.
  3. הסר שבב בעת הפעלה הושלמה.

8. ניתוח ראשוני של צ'יפ בניהול

  1. לטעון את הנתונים לתוך תוכנת ניתוח בזמן אמת PCR.
  2. לטעון ג'ין שמות ושמות תא על-ידי הדבקת התא ואת הגן פריסות מתוך קובץ מופרד באמצעות טאבים.
  3. פתח תצוגת תמונה ובחר רוקס כמו לצבוע. בדוק אם כל בארות יש לצבוע פסיבי רוקס.
  4. לחקור אם כל העלילות הגברה נראית בסדר, עם עקומה חלקה הגברה עם אין קוצים (בדומה איור 3E).
  5. ודא שכל יחיד-התאים שיש של שליטה עלה ב- RNA כדי לוודא כי כל מה יש נטען כראוי.
  6. ודא כי כל התאים יש ביטוי גנים משק הבית, ובכך מוינו כראוי.
  7. ודא 10 ל- 20 תא ליניאריות פקדים שיש כ CT 1 ההבדל לאימות הגברה ליניארי.
  8. בדוק אם יש ביטוי הדגימות שליטה צפונית. אם הביטוי הוא זוהה צפונית שקול לשנות הגששים הגששים אשר מזהה את ה-DNA גנומי של עוקבות.
  9. לייצא נתונים קבצי csv עבור ניתוח נוסף.

9. החד-תאיים ניתוח באמצעות SCExV

הערה: סרט מבוא הוא נוכח20 להציג את הכלי. כאן, מוצג מכתב המלצה קצרה של איך לעשות ניתוח באמצעות הפקדים הציג בפרוטוקול.

  1. לחבר האתר SCexV20.
  2. להעלות קבצי CSV המיוצא.
  3. בחר הפקד עלה ב- RNA בקרה חיובית. הסר תא כלשהו אשר פקד RNA CT מעל 25. לנרמל את הנתונים לביטוי החציוני של פקד ה-RNA.
  4. לחץ על "כאן -> ניתוח". הסר צפונית, notemplate, פקדים תא 10 ל- 20 האפשרות תא אל תכלול.
  5. אשכול תאים עם הגישה קיבוץ באשכולות הבחירה עם המספר הצפוי של אשכולות. ערכי ייצוא מנותח.

10. אינדקס-מיון ניתוח

  1. פתח את תוכנת ניתוח FACS וטען הדגימות באינדקס.
  2. לפתוח את עורך קובץ script ולהפעיל קובץ ה-script הזמינים מ. ג'יי קווין ואח 21
  3. זה התוכנה ניתוח FACS צריך לעשות שער לכל אחד התאים, לפתוח פריסה עורך וצבע את התאים לפי הקיבוץ מן SCexV (זמין בקובץ בשם "Sample_complete_Data.xls").

תוצאות

פרוטוקול המתואר הוא מהיר, שבוצעו בקלות ואמינים ביותר. סקירה כללית של הסידור ניסיוני מוצג באיור1. פרוטוקול כולו, ממיון של חד-תאים, הגברה יעד ספציפיות, מדידות ביטוי גנים, ניתוח ראשוני יכול להתבצע בשלושה ימים. דוגמה של תוצאות שנותחה בדמות מפת החום מייצג ראשונ?...

Discussion

בשנים האחרונות, תא בודד מפענוח הביטוי הפך תוספת רבת ערך כדי להגדיר את הטרוגניות של אוכלוסיות שונות תא23. כניסתו של טכנולוגיות רצף הרנ א תיאורטית מספק אפשרות למדוד את transcriptome שלם של תא, עם זאת, שיטות אלה הן מסובך וריאציות של רצף לתא לבין נשירה. QPCR תא בודד מציע ניתוח רגיש, איתנה של ה...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת מענקים השוודית החברה לסרטן, המועצה למחקר השבדי, החברה השוודית למחקר רפואי, קרן סרטן ילדות שוודית, קרן Söderberg רגנר, ו קנוט, אליס ולנברג קרן

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CD14 PECY5eBioscience15-0149-42Clone: 61D3
CD16 PECY5Biolegend302010Clone: 3G8
CD56 PECY5Biolegend304608Clone: MEM-188
CD19 PECY5Biolegend302210Clone: HIB19
CD2 PECY5Biolegend300210Clone: RPA-2.10
CD3 PECY5Biolegend300310Clone: HIT3a
CD123 PECY5Biolegend306008Clone: 6H6
CD235A PECY5BD Pharma559944Clone GAR2
CD34 FITCBiolegend343604Clone: 561
CD38 APCBiolegend303510Clone: Hit2
CD90 PEBiolegend328110Clone: 5E10
CD45RA BV421BD bioscience560362Clone: HI100
CD49f Pecy7eBioscience25-0495-82Clone: eBioGOH3
FBSHyCloneSV30160.3
PBSHyCloneSH30028.02
96-well u-bottom PlateVWR10861-564
SFEMStem cell technologies9650
Penicillin streptomycinHyCloneSV30010
TPOPeprotech300-18
SCFPeprotech300-07
FLT3LPeprotech300-19
Falcon Tube 15 mLSarstedt62.554.502
Eppendorph tubeSarstedt72.690.001
CST beadsBD642412
Accudrop BeadsBD3452496 µm particles 
Adhesive film ClearThermo scientific AB-1170
Adhesive film FoilThermo scientific AB-0626
96 well PCR plateAxygenPCR-96M2-HS-C
PCR 1.5 mL tubeAxygenMCT-150-L-C
T100 PCR cyclerBioRad186-1096
10% NP40Thermo scientific 85124
10 mM dNTPTakara4030
0.1 M DTTInvitrogenP2325
RNAsoutInvitrogen10777-019RNAse inhibitor
CellsDirect One-Step qRT-PCR KitInvitrogen11753-100
Neuclease free waterInvitrogen11753-100from CellsDirect kit
2x Reaction MixInvitrogen11753-100from CellsDirect kit
SuperScript III RT/Platinum Taq MixInvitrogen11753-100from CellsDirect kit
Platinum Taq DNA PolymeraseInvitrogen10966026
TaqMan Cells-to-CT Control KitInvitrogen4386995
Xeno RNA ControlInvitrogen4386995From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression AssayInvitrogen4386995From TaqMan Cells-to-CT Control Kit
96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCsFluidigmBMK-M10-96.96
2x Assay Loading ReagentFluidigmFrom 96.96 Sample/Loading Kit
20x GE Sample Loading ReagentFluidigmFrom 96.96 Sample/Loading Kit
Control line fluid FluidigmFrom 96.96 Sample/Loading Kit
TaqMan Gene Expression Master MixApplied Biosystems4369016
BioMark HDFluidigmBMKHD-BMKHD
96.96 Dynamic Array IFCFluidigmBMK-M10-96.96GT
ExcelMicrosoftMicrosoft
FlowJo V10TreeStarTreeStar
Fluidigm real time PCR analysisFluidigmFluidigm
CD179a.VPREB1Thermofisher scientificHs00356766_g1
ACEThermofisher scientificHs00174179_m1
AHRThermofisher scientificHs00169233_m1
BCR_ABL.52Thermofisher scientificHs03043652_ft
BCR_ABL41Thermofisher scientificHs03024541_ft
BMI1Thermofisher scientificHs00995536_m1
CCNA2Thermofisher scientificHs00996788_m1
CCNB1Thermofisher scientificHs01030099_m1
CCNB2Thermofisher scientificHs01084593_g1
CCNCThermofisher scientificHs01029304_m1
CCNE1Thermofisher scientificHs01026535_g1
CCNFThermofisher scientificHs00171049_m1
CCR9Thermofisher scientificHs01890924_s1
CD10.MMEThermofisher scientificHs00153510_m1
CD11aThermofisher scientificHs00158218_m1
CD11c.ITAXThermofisher scientificHs00174217_m1
CD123.IL3RAThermofisher scientificHs00608141_m1
CD133.PROM1Thermofisher scientificHs01009250_m1
CD151Thermofisher scientificHs00911635_g1
CD220.INSRThermofisher scientificHs00961554_m1
CD24.HSAThermofisher scientificHs03044178_g1
NCOR1Thermofisher scientificHs01094540_m1
CD26.DPP4Thermofisher scientificHs00175210_m1
CD274Thermofisher scientificHs01125301_m1
CD276Thermofisher scientificHs00987207_m1
CD32.FCGR2BThermofisher scientificHs01634996_s1
CD33Thermofisher scientificHs01076281_m1
CD34Thermofisher scientificHs00990732_m1
CD344.FZD4Thermofisher scientificHs00201853_m1
CD352.SLAMF6Thermofisher scientificHs01559920_m1
CD38Thermofisher scientificHs01120071_m1
CD4Thermofisher scientificHs01058407_m1
CD41.ITGA2BThermofisher scientificHs01116228_m1
CD49f.ITGA6Thermofisher scientificHs01041011_m1
CD56.NCAM1Thermofisher scientificHs00941830_m1
CD9Thermofisher scientificHs00233521_m1
CD97Thermofisher scientificHs00173542_m1
CD99Thermofisher scientificHs00908458_m1
CDK6Thermofisher scientificHs01026371_m1
CDKN1AThermofisher scientificHs00355782_m1
CDKN1BThermofisher scientificHs01597588_m1
CDKN1CThermofisher scientificHs00175938_m1
CEBPaThermofisher scientificHs00269972_s1
CSF1rThermofisher scientificHs00911250_m1
CSF2RAThermofisher scientificHs00531296_g1
CSF3RAThermofisher scientificHs01114427_m1
E2A.TCF3Thermofisher scientificHs00413032_m1
EBF1Thermofisher scientificHs01092694_m1
ENGThermofisher scientificHs00923996_m1
EPORThermofisher scientificHs00959427_m1
ERGThermofisher scientificHs01554629_m1
FLI1Thermofisher scientificHs00956711_m1
FLT3Thermofisher scientificHs00174690_m1
FOXO1Thermofisher scientificHs01054576_m1
GAPDHThermofisher scientificHs02758991_g1
GATA1Thermofisher scientificHs00231112_m1
GATA2Thermofisher scientificHs00231119_m1
GATA3Thermofisher scientificHs00231122_m1
GFI1Thermofisher scientificHs00382207_m1
HES1Thermofisher scientificHs01118947_g1
HLFThermofisher scientificHs00171406_m1
HMGA2Thermofisher scientificHs00171569_m1
HOXA5Thermofisher scientificHs00430330_m1
HOXB4Thermofisher scientificHs00256884_m1
ID2Thermofisher scientificHs04187239_m1
IGF2BP1Thermofisher scientificHs00198023_m1
IGF2BP2Thermofisher scientificHs01118009_m1
IKZF1Thermofisher scientificHs00172991_m1
IL1RAPThermofisher scientificHs00895050_m1
IL2RGThermofisher scientificHs00953624_m1
IRF8Thermofisher scientificHs00175238_m1
ITGB7Thermofisher scientificHs01565750_m1
KITThermofisher scientificHs00174029_m1
Lin28BThermofisher scientificHs01013729_m1
LMO2Thermofisher scientificHs00153473_m1
LYL1Thermofisher scientificHs01089802_g1
Meis1Thermofisher scientificHs01017441_m1
mKi67Thermofisher scientificHs01032443_m1
MPLThermofisher scientificHs00180489_m1
MPOThermofisher scientificHs00924296_m1
NFIBThermofisher scientificHs01029175_m1
Notch1Thermofisher scientificHs01062011_m1
PtenThermofisher scientificHs02621230_s1
RAG2Thermofisher scientificHs01851142_s1
RPS18Thermofisher scientificHs01375212_g1
RUNX1Thermofisher scientificHs00231079_m1
Shisa2Thermofisher scientificHs01590823_m1
Spi1Thermofisher scientificHs02786711_m1
Sterile.IgHThermofisher scientificHs00378435_m1
TAL1Thermofisher scientificHs01097987_m1
THY1Thermofisher scientificHs00264235_s1
Tim.3.HAVCR2Thermofisher scientificHs00958618_m1
VWFThermofisher scientificHs00169795_m1

References

  1. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  2. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  3. Ye, F., Huang, W., Guo, G. Studying hematopoiesis using single-cell technologies. Journal of Hematology & Oncology. 10, 27 (2017).
  4. Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).
  5. Wills, Q. F., et al. Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments. Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).
  6. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  7. Wilson, N. K., Nicola, K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  8. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
  9. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of Single RNA Transcripts in Situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  10. Kalisky, T., et al. A brief review of single-cell transcriptomic technologies. Briefings in Functional Genomics. , elx019 (2017).
  11. Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics. 16, 57 (2014).
  12. Bengtsson, M., Ståhlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).
  13. Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., Ståhlberg, A. Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise. BMC Molecular Biology. 9 (1), 63 (2008).
  14. Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, 1096 (2013).
  15. Tung, P. -. Y., et al. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies. Scientific Reports. 7, 39921 (2017).
  16. Teles, J., Enver, T., Pina, C. Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis. Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).
  17. Hayashi, T., et al. Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its "index sorting" function for stem cell research. Development, Growth, & Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).
  18. Lang, S., et al. SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data. BMC Bioinformatics. 16 (1), 320 (2015).
  19. de Klein, A., et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).
  20. . indexed-sorting Available from: https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting (2016)
  21. Warfvinge, R., et al. Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML. Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).
  22. Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
  23. Breton, G., et al. Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs. The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).
  24. Alberti-Servera, L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors. The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).
  25. Giustacchini, A., et al. Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia. Nature Medicine. 23, 692 (2017).
  26. Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow. Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).
  27. Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
  28. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140RT qPCRFACSimmunophenotypic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved