基于板块的秀丽线虫规模化栽培: 糖尿病代谢变化研究的样品制备

摘要

本协议描述了一种在固体培养基上大规模培养秀丽线虫的方法。作为液体培养的替代品, 该协议允许在板基培养条件下获得不同尺度的参数。这增加了结果的可比性通过省略液体和固体媒介文化之间的形态学和新陈代谢的区别。

摘要

在琼脂盘子上以大规模的方式培养秀丽线虫(线虫) 是费时费力的。该协议描述了一个简单而廉价的方法, 以获得大量的动物, 以分离蛋白质, 进行了西方印迹, 质谱, 或进一步蛋白质组学分析。此外, 在相同的培养条件下, immunostainings 线虫数量的增加和多种分析的整合也很容易实现。另外, 在不同实验条件下的板材之间的转移是方便的。在板块文化中常见的技术是用一根铂丝和用手术刀转移填充的琼脂块来转移单一的线虫.然而, 随着线虫数量的增加, 这些技术变得过于耗时。该协议描述了大规模的C 线虫文化, 包括许多步骤, 以尽量减少样本准备对蠕虫的生理影响。液体和剪切应力可以改变线虫的寿命和代谢过程, 因此需要详细描述关键步骤, 以检索可靠和可重现的结果。线虫是一种模型有机体, 由神经细胞组成, 可达 1/3, 但缺乏血管, 从而提供了单独研究独立于血管控制的神经元改变的可能性。最近, 在血管改变之前发现早期变性糖尿病视网膜病变。因此, 对于研究糖尿病并发症的一般机制,线虫有特殊的兴趣。例如, 在重现性中发现了晚期糖基化终产物 (年龄) 和活性氧 (ROS) 的增加形成. 通过对糖尿病引起的生化变化的研究, 本文介绍了处理足够大小样本以进行更广泛调查的协议。一般而言, 此协议对于需要大的C 线虫数和液体培养不合适的研究是有用的。

引言

蛋白质分析, 如西方的印迹或质谱, 需要蛋白质的毫克。这种产量需要大规模培养数以百计的线虫, 这可以通过液体培养或固体介质通过洗涤转移线虫。流体和剪切应力诱导上皮钠通道 (ENaC) 的表达, 通过增加钠的吸收增加渗透应力, 可能改变线虫的寿命, 影响代谢分析¹.因此, 该协议中的一些关键步骤, 以板块为基础的方法采取减少应力影响实验的变异性考虑。另一方面, 液体培养影响了线虫的表型, 复杂了²线虫的培养和准确数量的收集。此外, 活性物质可以改变的媒介成分, 并可能分布不均匀, 然后到达线虫。关于液体培养的局限性, 本议定书提供了一种新的方法来培养大规模的线虫样本。

线虫是一个模型有机体, 具有独特的网络302神经细胞, 占其所有细胞的 1/3³。自引入科学以来, 许多同源和同源基因被描述, 放大它作为医学研究模型的价值。最近, 糖尿病视网膜病变 (前血管损伤) 的神经功能损害的证据已经提出⁴。线虫缺乏血管, 但包含一个独特的神经网络, 这使得它成为一个合适的模型来调查神经元的变化, 除了血管的。因此, 对于研究糖尿病并发症的一般机制,线虫有特殊的兴趣。糖尿病并发症的生化变化涉及年龄的形成, 这进一步影响了 ROS 的形成, 以应对高血糖⁵。年龄被发现在C. 线虫和贡献神经损伤⁶。慢性疾病通常是由复杂的多基因过程引起的, 需要多参数方法来评估其基本机制, 这里举例说明糖尿病并发症的评估。该协议可用于同时获取多个参数, 以及随后使用。通过省略液体与固体培养基之间的形态和代谢差异, 可以提高多参数方法的可比性和重现度。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

注: 本协议分为五节。在1–3节中, 提出了大规模养殖C 型线虫的主要协议。4和5节为评估糖尿病代谢产物中出现的代谢产物提供了附加的协议。详细来说, 第1节描述了一个普通的大范围的板块文化。2节重点介绍了大量的C 线虫的转移, 而3节则解释了大规模样品的收获。4节解释了从样品中分离出的蛋白质, 5 节描述了随后的液相色谱-串联质谱 (LC-ms) 分析的样品制备方法。

1. 板材上的大范围文化

1. 一般情况下, 工作在无菌罩下或在明火旁边以避免污染。
2. 要培养蠕虫直到它们到达年轻的成人阶段, 请按照以前发布的⁷号协议进行以下修改。
   1. 使用活大肠杆菌 OP50 细菌喂养线虫, 并准备400µM fluorodeoxyuridine 琼脂 (不氨苄西林/FUdR) 进行实验。
   2. 为同步人群的准备, 使用非浓缩 OP50, 并为成功的实验与成人, 使用3.3x 浓缩 OP50 通过去除70% 的上清。
   3. 建议每日喂食间隔。在评估氧化应激时, 不同的进食间隔和容积可能会影响结果。
   4. 为接种, 采取一个板材与几个线虫并且切开它成片断大约 0.5 x 1 cm²与手术刀。将两到三块转移到线虫生长介质 (NGM) 板上, 直径为60毫米, 含非浓缩 OP50。
   5. 在适宜于应变的温度下孵化板材 (野生型 N2 应在20摄氏度培养), 直到鸡蛋在盘子上可见。
   6. 用2毫升的 M9 缓冲液冲洗掉大部分的卵和成年动物, 并在15毫升管中收集它们。离心机悬浮在 800 x g为2分钟。同时, 开始准备漂白液。
   7. 取出离心管, 用10毫升吸管取出 M9 缓冲器。添加10毫升的漂白溶液和混合在漩涡, 直到成人线虫裂解。这通常采取大约 5–7 min, 但不应该花费超过15分钟或蛋不会完全地以后开发在实验中。
   8. 离心机悬浮在 800 x g为2分钟, 洗3次与10毫升 M9 缓冲, 以清除鸡蛋从漂白溶液。
   9. 现在添加150µL 的蛋悬浮在 OP50 板上。每个盘子上都要有200–300xg 蛋的密度。等到线虫到达成年阶段。
      注: 所述实验所用的 M9 缓冲器 (pH 7.0) 由以下物质组成:22 毫米,₂PO₄, 42 毫米 Na₂HPO₄, 和86毫米氯化钠。热处理后加入1毫米 MgSO4。漂白溶液含有0.5 米氢氧化钠, 2.3 毫米 NaOCl 在蒸馏水中解决。
   10. 准备无菌 M9 缓冲剂, 不育的吸管提示用切尖冲洗蠕虫, 和15毫升管收集他们在。
   11. 在盘子上涂上大约1毫升的 M9 缓冲器, 轻轻地将吸管的线虫放在盘子上, 轻柔地散发缓冲器。
   12. 现在, 收集管中的线虫。直接应用150µL 悬浮在板材 (种子与 OP50) 与切开的吸管提示, 并且显微镜下评估线虫的密度 (推荐: 50–100线虫每60毫米板材)。
   13. 如果它们过于致密, 稀释悬浮与 M9 缓冲, 并评估它在显微镜下, 直到达到预期的密度。如果产量太少, 让蠕虫安定下来或离心机悬浮十年代在 800 x g去除液体。
       注: 一个充分的密度的例子在图 1A (宏观) 和1B (微观) 在20X 增量给。按照所描述的经验进行。
   14. 请记住, 蠕虫很快就会安定下来。为了保证板材之间的均匀分布, 在每叠板 (第4-5 板) 后反转管。
       注: 切割吸管尖端, 以及温和摆动和洗涤的盘子, 减少剪应力。

2.大量秀丽线虫的转移

1. 用大约500µL 的 M9 缓冲剂洗涤线虫, 这取决于盘子的年龄和干燥程度。使用相同的缓冲, 重复分离线虫, 直到大多数动物被收集在悬浮。
2. 慢慢地用割下的吸管把线虫带上, 并将它们转移到 OP50 准备好的盘子上。让盘子干。
   注意: 注意不要比推荐的卷应用得多。特别是在长期的实验中, 板块可能无法耐受, 琼脂也会断裂, 使线虫爬入裂缝中。

3. 大秀丽线虫样品的收获

1. 根据所选的方法, 开始实验, 有足够数量的C. 线虫。对于 LC-质谱/ms 分析, 每组20板 (60 毫米 x 15 毫米), 每片约100个线虫, 以确保每样蛋白质至少有200µg 的产量。
   注: 本议定书的这一部分不再需要在无菌条件下工作, 因为线虫将被收集和冻结。
2. 在样品收集的当天, 准备液氮以对收集的样品进行冻结。在冰上保持无菌 M9 缓冲, 以减缓线虫的新陈代谢。
3. 用1毫升的 M9 缓冲器, 轻轻地旋转盘子, 从盘子里洗去线虫。这避免收集已故的线虫和多数蛋, 如果有任何礼物, 因为他们坚持细菌和琼脂。
4. 把音量调到15毫升管上。
5. 收集完样品后, 等待线虫在 800 x g处简单地沉降或离心管, 并取出大部分 M9 缓冲器。用大约10毫升的 M9 (10x 样本量) 冲洗样品3x 以除去任何细菌。
   注: 为确保所有已死亡的线虫被除去, 蔗糖浮选是另一种选择。然而, 这是不适合的显示实验¹⁵。蔗糖是水解葡萄糖和果糖。在所描述的实验中, 评价葡萄糖的作用, 以促进慢性糖尿病的生化变化。因此, 蔗糖浮选可能会混淆结果。
6. 准备一个1.5 毫升管与1毫升的 M9 缓冲器和一个空1.5 毫升管每样。将球团与玻璃吸管从15毫升管转移到空1.5 毫升管。这一步骤对于确保定量转移至关重要。
   注意: 不像以前的步骤, 这里的线虫更集中。由于可能坚持塑料吸管的提示, 损失的大部分样品是预期的。因此, 用玻璃吸管代替。
7. 转移后, 使用玻璃吸管从第二个1.5 毫升管中拿起1毫升的 M9 缓冲器, 从吸管壁上冲洗线虫。另外, 从15毫升管中清洗剩余的线虫, 并将其转移到样品管。
8. 离心样品管在 1.9万 x g 1 分钟, 然后删除尽可能多的上清。
9. 用 Parafilm 封住管子, 并立即将其冻结在液氮中。贮存管在-80 摄氏度, 直到裂解制剂。

4. 质谱分离蛋白

注意: 这里描述的蛋白质分离也可以用于其他化验 (例如, 西方印迹)。

1. 对冷冻样品, 添加相同数量的0.5 毫米氧化锆珠和至少2x 的裂解液容量含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒。
   注: 用100µL 缓冲剂进行了描述的线虫-蛋白质相关分析。裂解200µL 的缓冲液。
2. 在速度9上启动1分钟的均质机。确保样品完全裂解。如果没有完全裂解, 请重复此步骤。
3. 离心样品30分钟在4°c 在 1.9万 x g。将上清液转移到冰上的新管上, 将其储存在-80 摄氏度, 直到进一步测量。
   注: 所述实验所用的非变性缓冲器由以下物质组成:20 毫米三盐酸 (pH 8)、137毫米氯化钠、1% 海卫 x 和2毫米 EDTA。
   注: 遵循本议定书的步骤, 并应用了建议的规模, 蛋白质颗粒从大约1000线虫的产量应约500µg。有关更多比较, 请参阅图 2和代表结果。

5. 液相色谱-串联质谱测量样品的制备

注: 根据感兴趣的参数, 样品准备会有所不同。本议定书的重点是丙酮醛和年龄确定。

1. 用 12-diaminobenzene (DB) 的衍生化方法测量胞内丙酮醛, 如前所述⁹。
   1. 融汇样品与20µL 冰冷 20% (重量/卷) 乙酸酸在 0.9% (重量/卷) 氯化钠和80µL 水在1.5 毫升管子。
   2. 用内部标准 (¹³C₃毫克; 400 nM) 将5µL 的样品钉在一起, 然后用涡流将它们混合, 然后在 2.1万 x g处将其离心为5摄氏度。
   3. 将上清的35µL 转移到含有200µL 玻璃插入物的 HPLC 样品瓶中。
   4. 将5µL 3% 叠氮化钠 (重量/卷) 添加到每个样品, 后跟10µL 0.5 毫米 DB 在200毫米 HCl 中含有0.5 毫米 diethylenetriaminepentaacetic 酸 (DETAPAC) 在水中。
   5. 在室温下孵化4小时的样品, 免受光照。
   6. 如前文所述, 分析样品的 LC-ms/毫秒,⁹。
      注: 对于年龄的测量, 请将该协议第4节所述的蛋白质分离出来。
2. 用布拉德福德¹⁰测定 (解冻) 裂解物的蛋白质浓度。
   1. 在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中, 用牛血清白蛋白 (BSA) 解决的标准曲线整除数30µL 的含量: 0;0.1;0.2;0.3;0.4;0.6;0.8;和1.0 毫克/dL。
      注: 如果样品是按照建议的尺寸制备的 (见步骤 4.1, 用于制备具有200µL 缓冲液的裂解剂), 估计浓度应在大约2–7毫克/毫升范围内。在这种情况下, 在测量之前用 PBS 稀释样品1:10。
      注意: 对于第一个使用此方法的实验, 建议对不同稀释 (1、1:10 和 1:100) 中的样品进行测量。由于没有确切的确定线虫数量, 不同的研究人员的产量可能有所不同。
   2. 使用透明的96井板 (聚苯乙烯) 和吸管10µL 的每个标准浓度和样品在选定的稀释中重复的水井。
   3. 用蒸馏水 (蒽醌) 稀释蛋白质染料试剂浓缩1:5。工作台)并添加200µL 的稀释到每个样品上的盘子。在室温下孵育10分钟的盘子。
   4. 测量30分钟内的吸光度在595毫微米与一个板块阅读器。样品可以从计算的标准曲线中插值。该方法的详细资料在文献¹⁰中得到了广泛的描述。
3. 测量细胞内的年龄, 如前所述^11,12。
   1. 在 10 kDa 离心过滤装置中, 用离心清洗总蛋白提取物 (约200µg) 3x。
   2. 加入10µL 100 毫米盐酸, 10 µL 胃蛋白酶 (2 毫克/毫升在20毫米 hcl) 和10µL 麝香 (2 毫克/毫升在20毫米 hcl) 到恢复的蛋白质 (大约100µL) 和孵化样品在37°c 为 24 h。
   3. 通过添加12.5 µL 0.5 米磷酸钾缓冲液 (ph 7.4) 和5µL 260 毫米的 KOH, 中和并缓冲样品在 pH 值7.4。
   4. 添加10µL 链霉蛋白酶 E [2 毫克/毫升10毫米磷酸钾缓冲液 (pH 7.4)] 和10µL 青霉素-链霉素溶液, 并孵化样品在37°c 24 h。
   5. 添加10µL 的氨基 [2 毫克/毫升10毫米磷酸钾缓冲 (ph 7.4)] 和10µL 脯肽酶 [2 毫克/毫升在10毫米磷酸钾缓冲 (pH 7.4)], 并孵化样品在37°c 48 h。
   6. 分析所产生的水解物的 LC-ms/毫秒, 如前所述¹²。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

这里给出了创建大规模的C. 线虫文化在糖尿病研究中应用的例子。将参数与单个动物进行关联, 而不是将其规范化为总的蛋白质浓度是很有意义的。在需要少量线虫的化验中, 这可以很容易地通过计数线虫来完成。对于一个大规模的C. 线虫文化, 涉及数以百计的线虫每实验组, 这种方法是不方便的。在图 2中, 显示了线虫数量与蛋白?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

该协议为大型线虫的大规模培养提供了可靠的途径, 获得了定量的结果。文献的结果可以复制, 如代表性结果所示。尽管这个用于收集大型线虫样本的协议似乎是一种直截了当的方法, 但还是有一定的缺陷需要考虑。关于线虫种群的同步问题, 本议定书描述了一种方法, 即用次氯酸钠和氢氧化钠漂白种群, 以破坏线虫, 并完全收获卵子。必须考虑到这种方法可能不适合所有实...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
Petri dish, 60 mm x 15 mm	Greiner One	628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets	Roche	04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
Sodiumchloride (NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E5391
96-well plates, transparent bottom	Brand	781611
Infinite M200, plate reader	Tecan	30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm	Next advance	ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer	Next advance	BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P6887
Thymol	Sigma	T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P6911
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P43339
Prolidase from Porcine Kidney	Sigma	P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merckmillipore	UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.