線虫の大規模栽培のプレート ・ ベース: 糖尿病の代謝変化に関する研究のための試料作製

要約

このプロトコルは固体媒体で線虫の大規模栽培の方法をについて説明します。液体培養する代わりに、このプロトコルは、栽培プレート ベースの異なるスケールのパラメーターを取得できます。これは、液体と固体のメディア文化の形態と代謝の違いを省略することで結果の比較可能性を向上します。

要約

線虫(C. elegans) を寒天に大規模な方法で養殖は時間がかかり、困難にすることができます。このプロトコルでは、西部のしみ、質量分析法、またはさらにプロテオミクス解析を続行する蛋白質の分離のための動物の大規模な番号を取得する簡単で安価な方法について説明します。さらに、immunostainings の線虫の数の増加と同じ培養条件下で複数の解析の統合容易に達成します。さらに、異なる実験条件とプレート間の移動が促進されます。平板培養における一般的な技法白金線を使用して 1 つのc. の elegansの転送と住まれた寒天の転送チャンク メスします。ただし、線虫数増加に伴い、これらの技術に過度に時間がかかる。このプロトコルはc. の elegans多数の手順を含むワームの生理学的試料の影響を最小限に抑えるための大規模な文化をについて説明します。流体および剪断応力の寿命や線虫、こうして信頼性と再現性のある結果を取得するために重要な手順の詳細な説明を必要とする代謝過程を変更できます。線虫は最大 1/3 の神経細胞から成るが血管に欠けている、従って神経変化のみ血管制御の独立を検討する可能性を提供するモデル生物であります。最近では、早期の神経変性糖尿病網膜症は血管病変の前に発見されました。したがって、 c. の elegansは糖尿病合併症の一般的なメカニズムを研究するための特別な関心です。たとえばの高められた形成高度糖化最終製品 (年齢)、線虫に見られる再現性をもって、活性酸素種 (ROS) を観察しました。調査のより広いスペクトルのための適切なサイズのサンプルを処理するプロトコルは、糖尿病による生化学的変化の研究に代表されるここで、掲載されています。一般に、このプロトコルは大規模な線虫を必要とする研究に有用することができます番号とどの液体培養は適していません。

概要

西部のしみや質量分析法などのタンパク質解析タンパク質のミリグラムが必要です。この収量の線虫、洗濯によって液体培養または線虫を転送する固体メディア上を達成することができます何百もの大規模な養殖が必要です。流体とせん断応力は、ナトリウム、線虫の寿命を変えることと代謝解析^{1 に影響を与える可能性があるの増加の取り込みによる浸透圧ストレスを高めることができる上皮性ナトリウム チャネル (ENaC) の発現を誘導します。}.したがって、プレート ベースのアプローチのこのプロトコルのいくつかの重要なステップは、アカウントに実験的変動に影響を与えるストレスの軽減を取る。液体培養は、他の一方で、線虫の表現型に影響を与えるし、文化と線虫²の正確な数のコレクションが複雑になります。さらに、反応生成物は、メディア コンポーネントによって変更することができ、線虫に達する前に均等に分散可能性があります。液体文化の制限については、このプロトコルはc. の elegansの大規模なサンプルを培養する方法を提供します。

線虫は 302 の神経細胞の異なるネットワークのモデル生物すべてのセル³の 3 分の 1 を構成します。多くの相同科学への導入以来オーソログ遺伝子の説明、医学研究のためのモデルとしてその値を増幅されています。最近では、糖尿病性網膜症、血管の損傷の前の神経学的な減損の証拠は⁴を提示されています。線虫は血管が欠けているが、血管のものから離れて神経の変化を調査するための適切なモデルを作るそれ異なる神経ネットワークが含まれています。したがって、 c. の elegansは糖尿病合併症の一般的なメカニズムを研究するための特別な関心です。糖尿病合併症の生化学的変化は、さらに高血糖⁵に応えて ROS の生成に及ぼす年齢の形成を含みます。年齢は線虫で発見され、神経損傷⁶に貢献。慢性疾患は、糖尿病合併症の評価をここで例示としてしばしば、メカニズムの評価のための多重アプローチを必要とする複雑なポリジーンのプロセスによって引き起こされます。このプロトコルは、だけでなく、その後複数のパラメーターを同時に、取得のための使用することができます。増加の比較と多重手法の再現性は、液体と固体のメディア文化の形態と代謝の違いを省略することで実現できます。

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プロトコル

注: このプロトコルは、5 つのセクションに分かれています。セクション 1-3 大規模な線虫を培養する主なプロトコルが表示されます。セクション 4 と 5 は、糖尿病代謝で発生する例示代謝物の評価の追加のプロトコルを提供します。詳しくは、セクション 1 は板の一般的な大規模な文化について説明します。セクション 2 はc. の elegansの大量の転送に焦点を当てて説明 3 は、大規模なサンプルの収穫に対し。セクション 4 のサンプルの蛋白質の隔離およびセクション 5 以降の液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析 (MS/LCMS) 分析のための試料の前処理をについて説明します。

1. 大量培養プレート上

1. 一般に、機能無菌フードの下にまたは汚染を避けるために開いた炎の横にあります。
2. 文化にワーム若い大人の段階に達するまで次の適応を持つこの以前に発行された議定書⁷に従ってください。
   1. 生菌大腸菌OP50 を使用して線虫をフィードし、実験のため 400 μ M フルオロデオキシウリジン寒天 (アンピシリン/FUdR ではない) を準備します。
   2. 同期の人口の準備、未濃縮 OP50 を使用し、大人の実験が成功、上澄みの 70% を除去することによって集中 OP50 x 3.3 を使用します。
   3. 毎日の給餌間隔をお勧めします。酸化ストレスの評価、さまざまな間隔と授乳のためボリュームが結果と競合します。
   4. 接種、いくつか線虫とプレートを取り、メスで約 0.5 x 1 cm²の断片に切断します。未濃縮 OP50 を含む、直径 60 mm の線虫成長メディア (NGM) プレートの上に 2、3 個セットを転送します。
   5. ひずみ (野生型 N2 は 20 ° C で培養する必要があります) に適した温度で版を孵化させなさい卵が皿の上に表示されるまで。
   6. M9 バッファーの 2 mL で卵と大人の動物のほとんどを洗って 15 mL チューブでそれらを収集します。2 分間 800 x gの懸濁液を遠心します。一方、漂白液の準備を開始します。
   7. 遠心管を取り出すし、10 mL のピペットを使い、M9 バッファーを削除します。大人の線虫を分離まで渦の漂白のソリューションとミックスの 10 mL を追加します。これは通常約 5-7 分がかかりますが、15 分よりも長くしてはならない、または卵は実験後に完全に開発することはしません。
   8. 800 x gで 2 分間洗浄ソリューションを漂白から卵をクリアする 10 mL M9 バッファーで 3 回の懸濁液を遠心します。
   9. 今 OP50 プレートに卵の懸濁液の 150 μ L を追加します。200-300 卵の密度は各プレート上に達します。線虫大人の段階に達するまで待機します。
      注: 描かれた実験用 M9 バッファー (pH 7.0) 以下の物質で構成されています: 22 ミリメートル KH₂PO₄、42 mM ナ₂HPO₄、および 86 mM の NaCl。オートクレーブ混合物後、1 mM MgSO4 を追加します。漂白液には 0.5 M NaOH、2.3 mM NaOCl を蒸留水で解決が含まれます。
   10. ワーム、およびそれらを収集するために 15 mL チューブを洗浄するカットと滅菌ピペット チップ先端不稔の M9 バッファーを準備します。
   11. プレートに約 1 mL の M9 バッファーを適用、プレートから線虫を振るとゆっくりピペットでバッファーを優しく配布。
   12. 今、管内線虫を収集します。カット ピペット チップで (OP50 でシード) プレートに直接サスペンションの 150 μ L を適用し、線虫の密度を病理組織学的評価 (推奨: 60 mm プレートごとの 50-100 線虫)。
   13. 密度が高すぎる場合は、目的の密度に達するまで顕微鏡で評価して M9 バッファーと懸濁液を希釈します。収量が少なすぎる場合、落ち着くか、遠心分離機の流体を削除する 800 x gで懸濁液 10 のワームをしましょう。
       注: 十分な密度の例は、図 1 a (マクロスコ ピック) と 20 X 増強で (微視的) 1 bで与えられます。実証的に従って進んでください。
   14. ワームがすぐに落ち着くことを覚えてをおいてください。プレート間の等しい配分を確保するため、すべてのスタック プレート (4-5 版) の後チューブを反転します。
       注: カット ピペットのチップとして穏やかな揺れと剪断応力を低減プレートの洗浄します。

2。転送の大量の線虫

1. 年齢や板の乾燥によって、M9 はバッファーの約 500 μ L で線虫を洗浄します。同じバッファーを使用して、動物のほとんどが懸濁液で収集されるまで、線虫をデタッチを繰り返します。
2. ゆっくりカット ピペット チップで線虫を取るし、OP50 でプレートに転送します。ドライ プレートができます。
   注: 推奨される量よりはるかに多くを適用するないように気をつけてください。特に長期的な実験は、プレートがそれを許さない、亀裂にクロールする線虫をできるように、寒天が破ることができます。

3. 収穫大の線虫サンプル

1. 選択した方法によってはc. の elegansの十分な量の実験を始めます。クロマトグラフィー-タンデム質量分析のサンプルあたり蛋白質の少なくとも 200 μ g の収量を確保するためプレートごと約 100 線虫を持つグループあたり 20 プレート (60 mm × 15 mm) を準備します。
   注: プロトコルのこの部分は、線虫が収集され凍結としてはもう、無菌条件下で動作を必要ありません。
2. サンプル コレクションの日に収集されたサンプルのスナップ-凍結液体窒素を準備します。マツ材線虫病の代謝を遅く氷の上の非滅菌の M9 バッファーを保持します。
3. 1 mL の M9 バッファーを適用しプレートを軽く旋回プレートから線虫を洗浄します。ある場合、現在細菌や寒天を守るため故人線虫とほとんどの卵の収集を回避できます。
4. ボリュームを取るし、15 の mL の管にそれを転送します。
5. 完全なサンプルのコレクションの後、解決または 800 x gで簡単にチューブを遠心し、M9 バッファーの大部分を除去する線虫を待ちます。サンプル 3 を洗って約 10 ml の M9 の x (サンプル ボリューム x 10) 細菌を除去します。
   注: すべての故人線虫が削除されていることを確認するには、ショ糖浮遊は別オプションです。ただし、これは表示されている実験¹⁵不向きでした。ショ糖はブドウ糖と果糖に加水分解します。描かれた実験でグルコースの役割は、持病の糖尿病の生化学的変化を促進するために評価されました。したがって、ショ糖浮遊可能性のある結果を混同できます。
6. すべてのサンプルの 1 mL の M9 バッファーと 1 つの 1.5 mL チューブと 1 つの空の 1.5 mL チューブを準備します。空の 1.5 mL のチューブに 15 mL チューブからガラス ピペットを使い、ペレットを転送します。この手順は、定量的な伝達を確保することが重要です。
   注: とは異なり、以前のステップの間にここで線虫より集中しています。プラスチック ピペット先端への可能な付着、によりサンプルの大きい部分の損失が予想されます。したがって、ガラス ピペットを代わりに使用します。
7. 転送後、ピペットの壁から線虫をリンスに 1 mL の 2 番目の 1.5 mL のチューブから M9 バッファーを取るガラス ピペットを使用します。また、15 mL チューブから残りの線虫を洗って、サンプル チューブに転送します。
8. 19,000 × gで 1 分でサンプル チューブを遠心分離機、可能な限りの上澄みを取り外します。
9. パラフィルムでチューブをシールとすぐに液体窒素でスナップ-凍結するそれ。ライセート作製まで-80 ° c チューブを格納します。

4. 質量分析のため蛋白質の隔離

注: ここで説明した蛋白質の隔離を (例えば、西部のしみ) 他のアッセイに使用もできます。

1. 凍結サンプル 0.5 mm ジルコニア ビーズ、少なくとも 2 倍のプロテアーゼ阻害剤のカクテルを含む溶解バッファーのボリュームの同じボリュームを追加します。
   注: 描かれている線虫蛋白質に相関分析を行ったバッファーの 100 μ L を使用します。LC ・ MS/MS サンプル バッファーの 200 μ L に溶解し。
2. 9 の速度で 1 分間ホモジナイザーを開始します。サンプルが完全に分離することを確認します。彼らは完全に分離していない場合は、この手順を繰り返します。
3. 19,000 x gで 4 ° C で 30 分間試料を遠心します。氷の上清を新しいチューブに転送、測定をとるつもりがさらにまで-80 ° C で保存できます。
   注: 描かれた実験用非変性バッファーは以下の物質で構成されています: 20 mM トリス塩酸 (pH 8)、137 mM NaCl、1% トリトン X、2 ミリメートルの EDTA。
   注: は、このプロトコルの推奨スケールを適用した手順に従ったこと、約 1,000 の線虫から蛋白ペレットの収量は約 500 μ g をする必要があります。多くの比較図 2および代表の結果を参照してください。

5. 液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法による測定の前処理

注: 興味のパラメーターに応じて、サンプル準備が異なります。このプロトコルは、メチルグリオキサールや年齢の決定に焦点を当てください。

1. 上記⁹として 1, 2-diaminobenzene (DB) 誘導体化による細胞内メチルグリオキサールを測定します。
   1. 冷たい 20% (重量/巻) トリクロロ酸塩化ナトリウム 0.9% (重量/巻) の 20 μ L と 1.5 mL チューブの水の 80 μ L 試料をホモジナイズしてください。
   2. スパイク内部標準の 5 μ L のサンプル (¹³C₃MG; 400 nM)、ボルテックス、それらをミックスし、4 ° C で 5 分間 21,000 × gで遠心分離
   3. 上澄みの 35 μ L を高速液体クロマトグラフィーのサンプルのバイアル 200 μ L ガラス挿入に転送します。
   4. 0.5 mM DB 200 mM HCl 含む 0.5 mM ジエチレントリアミン酸 (DETAPAC) の水の 10 μ L の順に各サンプルに 3% アジ化ナトリウム (wt/巻) の 5 μ L を追加します。
   5. 光から保護部屋の温度で 4 時間サンプルをインキュベートします。
   6. 上記⁹LC-MS/MS による試料を分析します。
      注: 年齢の測定プロトコルのセクション 4 で説明したよう、蛋白質を分離します。
2. ブラッドフォードの試金¹⁰を使用して (解凍) 溶解液のタンパク質濃度を測定します。
   1. ウシ血清アルブミン (BSA) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 以下の濃度の解決とスパイク標準曲線の 30 μ L の因数を準備: 0;0.1 となります。0.2;0.3;0.4;0.6;0.8;1.0 Mg/dl。
      注: 推奨されるサイズ サンプル調製した場合 (バッファーの 200 μ L でライセートの調製手順 4.1 を参照)、推定濃度は、およそ 2 – 7 mg/mL の範囲でする必要があります。この場合、希釈、サンプル 1:10 PBS で、測定前にします。
      注: このメソッドを使用して最初の実験は勧め異なる希釈率のサンプルを測定する (1、1:10 と 1: 100)。線虫の数の厳密な決定は、個々 の研究者間収量できます異なります。
   2. 透明の 96 ウェル プレート (ポリスチレン) を使用して、各標準濃度と井戸に重複で選ばれた希釈サンプルの 10 μ L をピペットします。
   3. 希釈、タンパク質アッセイ色素試薬の集中 1:5 蒸留水 (aq。dest)希釈の 200 μ L をプレート上のすべてのサンプルに追加します。板室温で 10 分間、インキュベートします。
   4. 595 で 30 分以内で吸光度を測定プレート リーダーの nm。サンプルは、計算された標準曲線から補間することができます。メソッドの詳細については、文献¹⁰に広く記載されています。
3. 前述^11,12として細胞年齢を測定します。
   1. 総蛋白抽出物 (約 200 μ g) を洗う遠心遠心ろ過単位 10 kDa によって水で 3 倍。
   2. 回復されたタンパク質 (約 100 μ L) を 10 μ L の 100 mM 塩酸、ペプシン (20 mM 塩酸で 2 mg/mL) の 10 μ L、チモール (2 mg/mL で 20 mM HCl) の 10 μ L を追加し、37 ° C 24 時間でサンプルをインキュベートします。
   3. 中和し、ph 7.4 0.5 M カリウム リン酸バッファー (pH 7.4) の 12.5 μ L を追加することによって、サンプルをバッファーと 260 mM コの 5 μ L。
   4. プロナーゼ E [10 mM カリウム リン酸バッファー (pH 7.4) に 2 mg/mL] の 10 μ L を追加し、ペニシリン ・ ストレプトマイシン液の 10 μ L 24 h 37 ° C でサンプルをインキュベートし、。
   5. アミノペプチダーゼ [10 mM カリウム リン酸バッファー (pH 7.4) に 2 mg/mL] の 10 μ L を追加し、プロリダーゼ [10 mM カリウム リン酸バッファー (pH 7.4) に 2 mg/mL] の 10 μ L 48 h の 37 ° C でサンプルをインキュベートし、。
   6. 上記¹²- MS LC/MS による、結果として得られる加水分解物を分析します。

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結果

ここで大規模な線虫の作成例文化の糖尿病研究のアプリケーションに渡されます。総蛋白濃度を正常化するのではなく、パラメーターを 1 つの動物に関連する関心のことです。線虫の数が少ないを必要とする試金、これ簡単に達成できます、線虫をカウントすることによって。大規模な線虫の実験グループごと線虫の数百人を文化、この方法は便利です?...

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ディスカッション

このプロトコルは、定量的な結果を得るためのc. の elegansの大規模養殖のための信頼性の高い方法を示します。文献からの知見は、代表の結果に示すように、レプリケート可能性があります。にもかかわらず、 c. の elegansの大規模なサンプルのコレクションのこのプロトコルはストレート フォワード法のように思える、考慮する点があります。線虫密度の同期に関?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
Petri dish, 60 mm x 15 mm	Greiner One	628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets	Roche	04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
Sodiumchloride (NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E5391
96-well plates, transparent bottom	Brand	781611
Infinite M200, plate reader	Tecan	30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm	Next advance	ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer	Next advance	BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P6887
Thymol	Sigma	T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P6911
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P43339
Prolidase from Porcine Kidney	Sigma	P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merckmillipore	UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.