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  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
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  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在此, 我们提出了一种基于串联质谱的协议, 用于定量治疗重症监护病房中的常用抗生素, 即头孢吡肟、美罗培南、环丙沙星、莫西沙星、利奈和哌拉西林。

摘要

许多临床设施对抗生素的治疗药物的需求不断增加, 特别是在实施医院抗生素管理计划方面。

在目前的工作中, 我们提出了一个多用途的高效液相色谱-串联质谱 (HPCL ms/ms) 协议, 以量化的头孢吡肟, 美罗培南, 环丙沙星, 莫西沙星, 利奈, 和哌拉西林, 常用重症监护病房的抗生素。该方法以前是根据欧洲药物管理局的指导方针进行全面验证的。

经过快速的样品清理, 在4分钟内将分析物分离在 C8 反相色谱柱上, 用电喷雾电离 (ESI +) 质谱中相应的稳定同位素标记的内部标准进行多重反应。时间监视 (MRM)。所提出的方法采用简单的仪器设置, 色谱条件均匀, 可用于临床实验室的日常和强健的抗生素治疗药物监测。校准曲线横跨药代动力学的浓度范围, 从而包括抗生素量接近最小抑制浓度 (MIC) 的敏感细菌和峰值浓度 (C最大), 得到的丸管理方案。如果不需要在样品清理前进行血清稀释, 则可以通过多种测量方法获得被管理的抗生素曲线下的区域。

引言

尽管抗生素已经彻底改变了医学的实践, 但严重的细菌感染仍然是导致严重疾病发病率和死亡率的主要原因1。在这方面, 迅速管理适当剂量的适当抗感染, 对疾病控制2至关重要。

越来越多的证据表明, 用广谱抗生素进行的经验治疗随着患者数量的复杂性越来越成问题。对于重症监护病房 (ICU) 尤其如此, 在这种情况下, 关键药动学 (PK) 参数的巨大的个体间变异性经常被观察到3,4。因此, ICU 患者即将面临亚治疗水平的危险, 治疗成功率不足5,6。再次, 患者不必要地暴露在过高的抗生素浓度, 可能导致严重的不良事件, 没有临床好处7。抗生素滥用和剂量不足也助长了抗生素耐药性的传播, 这正日益成为对公共卫生8的威胁。

为了改进抗生素的使用, 并尽可能长时间地保存 effectivenessas, 世界卫生组织于2015年发起了一项关于抗菌素耐药性的全球行动计划.抗生素管理计划是10国家公共卫生战略中谨慎使用抗菌药物的一个重要基石, 帮助临床医生提高患者护理质量11 , 同时显著降低抗生素耐药性12。通过应用治疗药物监测 (TDM) 在个别患者中的抗生素剂量是这方面的一个关键工具13。

到目前为止, 商业上可用的 TDM 化验仅可用于糖肽类抗生素和氨基糖苷类。对其他类中的物质进行量化通常需要内部方法开发或验证, 这可能很麻烦。因此, 我们详细介绍了一种基于稳健质谱分析的协议, 该方法可用于在其临床相关浓度范围内对 ICU 中最相关的抗生素进行量化14。该方法最近在我们的质谱仪中建立, 并已被应用于 ICU 的常规 TDM 从那以后。该程序使用一个简单的分析设置和统一的样本清理, 允许快速实施抗生素 TDM 在许多设施的质谱能力。

本文所描述的协议是针对人血清中头孢吡肟、美罗培南、环丙沙星、莫西沙星、利奈和哌拉西林的定量化而优化的, 采用同位素稀释液相色谱 (LC) 与串联质量光谱 (ms/毫秒)。对于同位素稀释 LC-ms/毫秒方法, 稳定的同位素标记化合物添加到一个特定的矩阵 (如血清) 感兴趣的样本。同位素标记的标准可以区别于它们未标记的对应物, 即由于天然分子的不同分子量和它们的破碎产物, 而被称为母体离子对女儿离子的转变。由于同位素标记化合物与未标记的对应物具有几乎相同的整体物理化学行为, 因此它们是 ms/ms 的理想内部标准, 允许近基质独立的分析物质量化, 具有高度的精确度15。目前, 许多可用于小分子量化的稳定同位素标记内部标准, 包括抗菌素的 TDM, 都是商业上可用的。

用分析 C8 烷基链长度反相柱 (100 毫米 x 2.1 毫米, 3 µm 粒度), 对所述协议中的抗生素分析仪进行了色谱分离。在方法开发过程中, 所有分析物的内部标准归一化矩阵因子介于94.6% 和105.4% 之间, ≤8.3% 的变化系数为14。

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研究方案

注: 建议在处理有机溶剂时, 如甲醇, 在通风罩工作。准备所有的缓冲和移动阶段的容积烧瓶。如未另行规定, 溶液可在室温下贮存1月。

1. 校准仪和质量控制样品的编制

注: 在补充文件中给出了用于准备库存和穗状溶液的相应数据分析表。出于可追溯性的原因, 请在相应的列中插入制造商、目录编号和每种抗生素的大量数量。将所有抗生素溶解在4摄氏度的冷藏库中, 尽量缩短工作时间。

  1. 在水中准备100毫升25% 甲醇: 预先填充100毫升容积烧瓶, 含25毫升的绝对甲醇, 用蒸馏水将其填满100毫升。
  2. 在水中准备10毫升200毫米醋酸: 预先填充10毫升容积烧瓶, 含9毫升的 HPLC 级水, 加入115µL 的冰乙酸 (99.5% 纯度, 17.4 米), 并加蒸馏水高达10毫升。
  3. 在水中准备25毫升的25% 甲醇, 用20毫米醋酸: 预先填充一个25毫升容积烧瓶, 含2.5 毫升的水200毫米醋酸溶液, 加入6.25 毫升的绝对甲醇, 用蒸馏水填满瓶子到25毫升。
  4. 使用精确刻度来衡量15毫升锥形管中适当数量的抗生素, 如列初始重量中补充文件所述。
  5. 在25% 甲醇水中制备氟喹诺酮类、环丙沙星和莫西沙星的库存溶液, 包括20毫米醋酸。为此, 请将相应的卷添加到加权数量中, 如 "最终卷" 列中的补充文件所述。在超声浴中迅速溶解喹诺酮抗生素2分钟, 并通过强烈的涡流。
  6. 在25% 甲醇水中制备头孢吡肟、美罗培南、利奈和哌拉西林的库存溶液。为此, 将相应的卷添加到列最终卷中的补充文件中所述的加权数量, 并通过强烈的涡流快速溶解抗生素。将美罗培南溶解为最后一种物质。
  7. 将所述补充文件中相应的库存溶液图中所描述的所有抗生素的库存解决方案组合在一起, 以产生多峰集中的穗型溶液。
  8. 穗九卷无药血清与一卷的0–7浓缩穗解决方案, 以获得血清校准和质量控制 (QC) A–D。例如, 在10毫升的聚丙烯管中加入0.5 毫升的穗溶液, 在4.5 毫升的血清中, 在 4 rpm 的滚筒搅拌机上, 在50摄氏度的冷库中孵化15分钟。
  9. 使用重复的吸管产生100µL 整除数的校准和 QCs 在1.5 毫升聚丙烯管。
  10. 将校准、质量控制和抗生素库存解决方案存储在摄氏-80 摄氏度, 长达六月。
  11. 对于每种抗生素, 也准备一个整洁的解决方案, 含有1000毫克/升的单一抗生素。用适当的稀释剂稀释相应的库存溶液 (例如, 对环丙沙星, 使用25% 甲醇水, 包括20毫米醋酸)。
    注意: 只有在仪器调谐时才需要整洁的抗生素解决方案。

2. 内部标准组合的编制

注: 内部标准是在样品清理过程中添加到样品中的感兴趣分析物的同位素标记对应物。由于内部标准与未标记的对应物具有几乎相同的整体物理化学性质, 它们补偿了给定样本的矩阵效应。

  1. 10毫升50% 甲醇在水中添加5毫升的绝对甲醇到10毫升摇瓶, 并填补它高达10毫升与蒸馏水。
  2. 在水中制备10毫升50% 甲醇, 包括20毫米醋酸。要做到这一点, 添加1毫升的200毫米醋酸到10毫升瓶, 添加5毫升的绝对甲醇, 并填补它高达10毫升与蒸馏水。
  3. 用1000毫克/升直接在制造商提供的瓶子中生成内部标准的库存解决方案。溶解头孢吡肟-13C12d-3硫酸盐在蒸馏水, 美罗培南 d6, 利奈 d3, 和哌拉西林 d5在50% 甲醇水解答。将环丙沙星8在50% 甲醇水中溶解, 20 毫米醋酸盐和盐酸莫西沙星-13C1D3在蒸馏水与20毫米醋酸盐。
  4. 结合的是在1.5 毫升聚丙烯管的库存解决方案, 以产生一个高浓度的内部标准混合。添加10µL 头孢吡肟-13C12D3, 10 µL 的美罗培南 d 6, 1 µL 的环丙沙星 d8, 2 µL 盐酸莫西沙星-13C1D3, 2 µL 利奈 D3, 10 µL 哌拉西林-D5到965µL 25% 甲醇水。
  5. 存储内部标准库存解决方案, 并将其浓缩为-80 摄氏度。

3. 病人样本储存

注: 确保血清获得尽可能快, 冷冻样品的冷链保持。

  1. 收集血清收集管中的全血。
  2. 在室温下让血凝块20–30分钟。
  3. 将血清从血液中分离出来, 离心 2000 x克, 10 分钟。
  4. 将上清液转移到干净的聚丙烯管上。
  5. 将血清贮存六月至-80 摄氏度, 直至化验。或者, 将样品储存在-20 摄氏度3天。

4. 色谱缓冲剂的制备

  1. 在水中制备1米甲酸铵, 用100毫升的摇瓶将甲酸铵的6.306 克溶解于100毫升的 HPLC 级水中。将解决方案存储在4摄氏度的1月。
  2. 准备移动相 A [10 毫米甲酸铵在水甲酸 (99.9: 0.1 伏/五)]。预先填充1000毫升容积烧瓶, 约500毫升的 HPLC 级水, 添加1毫升甲酸和10毫升的1米甲酸铵溶液, 并填充到1000毫升的 hplc 级水。将移动相 a 转移到干净的玻璃瓶上, 并将其连接到高效液相色谱系统。在室温下存储移动相2周。
  3. 准备移动阶段 b. 将 HPLC 级绝对甲醇转化为清洁玻璃瓶, 并将其与 hplc 系统连接。
  4. 使用绝对甲醇作为洗针溶剂, 并将相应的管连接到含有移动相 B 的玻璃瓶中。
  5. 生成甲醇-水甲酸 (7:92.9: 0.1, v/v/v) 的密封和净化溶剂。预先填充1000毫升容积烧瓶约500毫升蒸馏水, 添加70毫升的绝对甲醇, 1 毫升甲酸, 并添加蒸馏水到1000毫升。将溶剂转移到干净的玻璃瓶上, 并将其与高效液相色谱系统连接。
    注: 各种 autosampler 系统使用强和弱针洗溶剂。在这种情况下, 根据制造商的建议准备洗涤解决方案。例如, 用甲醇-水-isopropylic 酒精 (70:20:10, v/v/v) 和弱洗涤与水-甲醇 (95:5, v/v) 进行强洗涤。

5. 仪器调谐

注意: 此步骤是为在特定质谱仪上的方法的设置而执行的。

  1. 稀释1000毫克/升分析物和内部标准溶液1:10 或1:100 在混合的移动相 a 和 B (50:50, v/v), 取决于探测器信号强度。用 autotune 函数调整质谱仪或对以下父-子离子转换进行手动调整14: 头孢吡肟 (481.0 > 167.0/395.7), 头孢肟-13C12D3 (485.1 > 167.1/400.0), 美罗培南 (384.1 > 114.0/141.0), 美罗培南 D6 (390.1 > 114.0/147.2), 环丙沙星 (332.0 > 231.0/245.0), 环丙沙星 D8 (340.1 > 235.1/249.3), 莫西沙星 (402.0 > 261.0/383.9), 莫西沙星-13C1D3 (406.1 > 265.1/388.0), 利奈 (338.0 > 235.0/296.0), 利奈 D3 (341.1 > 235.1/297.1), 哌拉西林 (518.0 > 143.0/358.9), 和哌拉西林 D5 (523.1 > 142.8/364.1)。
  2. 对于具有自动调谐的仪器, 使用 autotune 函数通过探测器自动调整 MS 进气口的电压和设置。
  3. 对于具有手动调谐的仪器, 请调整设置 (例如, 碰撞电压和碰撞能量), 直到在探测器上为每个母和子离子获得最佳 (通常为最大) 信号强度。例如, 插入混合三通, 将移动相 a 和 B (50:50, v/v) 放在0.5 毫升/分钟, 并持续注入整齐的抗生素或内部标准, 流速为0.1 毫升/分钟。

6. 高效液相色谱-ms/ms 设置

注: 质谱仪、HPLC 系统 (包括 autosampler) 的特点, 以及相应的软件依赖于制造商。根据制造商的建议, 调整质量光谱仪参数和洗涤程序。

  1. 将质谱仪参数存储在相应的 "MS 调谐文件"中。使用电喷雾电离在正模式 (ESI +) 为所有的方法。调整所用仪器的离子源设置 (例如, 毛细管电压为1.5 伏, 源温度为120摄氏度, desolvation 温度为400摄氏度, desolvation 气体流速为600升/小时, 射频透镜电压为 0.1 V, 停留时间为80毫秒)。
  2. 在 "MS 文件"中指定分析物和内部标准调谐参数 (如毛细管电压、碰撞能量)。
  3. 在 "入口文件"中设置以下 autosampler 条件: 样品温度在10°c 以5°c 的极限;洗涤顺序在1x 清洗-洗涤-清洗与600µL 清除容量替换。
  4. 在上述 '入口文件 ', 设置流量为0.4 或0.5 毫升/分钟, 运行时间为4分钟, 压力高限制到345条, 和柱温度到30°c 与极限的 @ 5 °c。添加流动相 A 和 B 的溶剂名称, 分别设置为 7% B/93%a。
  5. 程序在 '入口文件 '的色谱梯度如下: 0.00–0.10 min 与7% 流动相 B/93%a, 0.11–0.60 min 与65% 流动相 B/35%a, 0.61–2.10 分钟以95% 个移动的阶段 B/5%a, 2.11–4.00 min 以7% 个移动的阶段 B/93%a。
    注: 计算额外列容积、仪器平台的容纳量以及 USP < 621 > 色谱准则16所述的分析物保留因子。

7. 样本测量主文件

注: 在 "样本测量主文件"中, 指定患者样本, 并启动 HPLC-质谱/ms 分析, 并进行数据评估。生成两个独立的模板文件, 包括低质量和高质量的控制对;其中一个模板包括 qc 配对 A 和 C, 另一个是 qc 副 B 和 D。

  1. 创建新的 "示例测量主文件"。选择上面提到的 "ms 调谐文件"、"ms 文件"和"入口文件" (第6节), 将它们插入到每个示例行中, 并指定具有15µL 的注入量。
  2. 按升序排列, 添加校准0–7和质量控制 (qc) 对 a/C 或 qc 对 B/D 的 "示例文本"。
  3. 指定示例类型。为质量控制对选择校准和 "QC" 的示例类型 "标准"。
  4. 指定相应校准和质量控制的每种抗生素物质的浓度 (见电子表格, 浓度 [µg/毫升] Cal 7–Cal 0, QC A/C 或 B/D,)。
  5. 程序的 "数据评估方法"。使用在仪器优化过程中优化的转换 (第5节)。将每种抗生素与相应的同位素标的标准 (如美罗培南6) 相匹配。

8. 样品清理和高效液相色谱-ms/毫秒分析

注: 对于每个样品批次, 处理和分析一组具有低和高抗生素浓度的配对质量控制 (qc a/C 或 qc B/D)。在不同批次之间, 配对 QC 样品用在一个备用序列 (例如, 在1天, 选择 '样品测量主文件 '包括 qc 对 A/C; 在2天, 选择一个包括 qc 对 B/D。血清样品的处理如图 1所示。

  1. 准备沉淀剂10% 甲基叔丁基醚在甲醇 (10:90, v/v) (例如, 预先填充一个25毫升容积瓶与2.5 毫升的甲基叔丁基醚和填充它到25毫升与绝对甲醇)。
  2. 将 C8 反转相置于柱腔内。将其连接到液相色谱和质谱仪的流向。
  3. 生成示例列表。打开相应的 "样本测量主文件"模板, 并将要处理的病人样本添加到列表中。生成多达20个患者样本的组, 并向他们提供相应的质量控制对。
  4. HPCL 系统使用 "入口文件"控制软件: 将 "湿素数" 功能设置为50% 个移动相 A/50%b, 湿素数为2分钟, 流速为1毫升/分钟。
  5. 刷新注射器。为此, 在控制软件中执行6冲程600µL。
  6. 平衡 C8 反相柱。使用该软件, 打开 "输入文件"中的流, 并将其与7% 移动相 B/93%a 进行冲洗, 最小为5分钟, 使用流速为0.5 毫升/分钟. 验证柱温30°c。
  7. 解冻患者样品, 一整除校准 0–7, 和质量控制对 (即 a/B 或 C/D)。
  8. 用重复的吸管, 添加25µL 的内部标准混合到100µL 校验仪, QC 样品, 或患者血清在1.5 毫升聚丙烯管, 并涡管几秒钟。
  9. 在台式振动筛的室温下孵育5分钟的混合物 (例如, 在1200转每分钟)。
  10. 用重复的吸管, 添加150µL 的沉淀试剂的样本内部标准混合。
  11. 再次, 涡管几秒钟, 并孵化它在室温下的台式振动筛 (例如, 在 1200 rpm) 5 分钟。
  12. 离心机悬浮在 2万 x g在桌上离心机为10分钟在4°c。
  13. 用高效液相色谱法稀释上清 1:3, 用微插入玻璃瓶, 将其作为加工样品装入 autosampler。
  14. 在 "样本测量控制文件"中手动启动高效液相色谱-ms/毫秒分析。
    注: 对于长时间存储, 请根据制造商的建议彻底冲洗分析柱 [例如, 0.5 毫升/分甲醇-水 (50:50, v/v)] 以防止相崩。

figure-protocol-7093
图 1: 示例清理的示意图表示形式.高离心力下的蛋白质沉淀给出致密颗粒和清液, 表明蛋白质沉淀是完全的。整个处理时间约为30分钟, 包括样品清理、色谱分离和 ms/毫秒分析。请单击此处查看此图的较大版本.

9. 质量评估和量化

  1. 要处理样本, 请打开相应的 "样本测量控制文件", 选择校准程序、质量控制和患者样本, 并用 "抗生素量化方法"对其进行评估。
  2. 检查特定分析物的峰值是否正确集成。检查每个校准器、QC 和病人样本的峰值, 并在必要时手动将其重新整合到基线。
  3. 研究校准曲线并检查它是否满足以下质量标准: a) 线性度在整个校准范围内, b) 校准系数 r2 > 0.995, c) 每一个校准标准的偏差在15% 的标称值, 除了量化下限 (LLOQ), 其中20% 是必需的。
  4. 拒绝符合上述标准的校准标准, 并重新评估校准曲线, 包括回归分析。
  5. 研究质量控制, 检查偏差是否在标称值的15% 以内。
  6. 如果病人的浓度超过最高校验仪的浓度, 稀释样品与蒸馏水, 高达 1:5 (例如, 100 µL 的血清加400µL 蒸馏水) 在样品清理之前。Reperform 步骤8.8–8.14 该特定的示例并重新处理它。

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结果

使用描述的协议, 在图 2中描述了一个典型的色谱。根据美国药典 (USP) 色谱准则16, 目前系统中的柱死体积是用 ~ 0.22 毫升和额外柱容积 (包括喷油器、油管和连接器) 确定的, 其数量为0.08 毫升, 给0.30 毫升的容纳量。计算出的所有分析物的保留因子为 2.8 (用于头孢吡肟)-4.2 (用于哌拉西林)。

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讨论

在本手稿中, 我们报告了一个简单和稳健的串联质谱法的方法, 以量化的常用抗生素在 ICU19, 即头孢吡肟, 美罗培南, 环丙沙星, 莫西沙星, 利奈, 和哌拉西林14。电子表格伴随着编写抗生素库存解决方案、校准仪和质量控制的手稿, 同时考虑到抗生素的纯度和 counterions 的分子量。鉴于抗生素浓度相当高, 从分析的角度来看, 它们的量化应该不是特别的挑战。因此, 我?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

作者感谢 Schütze 博士为他的帮助建立了提出的方法和博士 Zoller 为有价值的输入有关正确的校准范围。作者还认识到质谱设备的技术人员。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
cefepime hydrochlorideSigma-Aldrich1097636USP Reference Standard
meropenem trihydrateSigma-AldrichY0001252EP Reference Standard
ciprofloxacinSigma-Aldrich17850
moxifloxacin hydrochlorideSigma-AldrichSML1581
linezolidToronto Research ChemicalsL466500
piperacillin sodium saltSigma-Aldrich93129
cefepime-13C12D3 sulfateAlsachimC1297Isotope labelled internal standard for cefepime
meropenem-D6Toronto Research ChemicalsM225617Isotope labelled internal standard for meropenem
ciprofloxacin-D8Toronto Research ChemicalsC482501Isotope labelled internal standard for ciprofloxacin
moxifloxacin-13C1D3 hydrochlorideToronto Research ChemicalsM745003Isotope labelled internal standard for moxifloxacin
linezolid-D3Toronto Research ChemicalsL466502Isotope labelled internal standard for linezolid
piperacillin-D5Toronto Research ChemicalsP479952Isotope labelled internal standard for piperacillin
methanolJT Baker8402
HPLC grade waterJT Baker4218
formic acidBiosolve6914132
acetic acidBiosolve1070501
ammonium formateSigma-Aldrich70221-25G-F
tert-Butyl methyl etherMerck101845
Fortis 3 μm C8 100 * 2.1 mmFortisF08-020503
Ti-PEEK-encased Prifilter (2 μm)Chromsystems15011
2795 Alliance HPLC systemWaters176000491
Quattro micro API Tandem Quadrupole SystemWaters720000338
QuanLynx 4.1 softwareWaters/Data evaluation software provided by the mass spectrometer manufacturer
Supplemental FileStock Solutions

参考文献

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  23. Moxifloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information. , Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2010/021277s038lbl.pdf (2010).
  24. Linezolid: Highlights of prescribing information. , Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2012/021130s028lbl.pdf (2011).
  25. Piperacillin and Tazobactam: Highlighs of prescribing information. , Available from: https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2017/050684s88s89s90_050750s37s38s39lbl.pdf (2017).
  26. Zander, J., et al. Effects of biobanking conditions on six antibiotic substances in human serum assessed by a novel evaluation protocol. Clinical Chemistry and Laboratory. 54 (2), 265-274 (2016).
  27. Zander, J., et al. Quantification of piperacillin, tazobactam, cefepime, meropenem, ciprofloxacin and linezolid in serum using an isotope dilution UHPLC-MS/MS method with semi-automated sample preparation. Clinical Chemistry and Laboratory. 53 (5), 781-791 (2015).

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