Múltiplex análisis farmacológico por la dilusión del isótopo HPLC-MS/MS de los antibióticos en enfermedades graves

Resumen

Aquí presentamos un protocolo de masa basado en la espectrometría de tándem para la cuantificación de los antibióticos utilizados en unidades de cuidados intensivos, es decir, cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid y piperacilina.

Resumen

Hay una demanda creciente para el monitoreo de drogas terapéuticas de antibióticos en muchas instalaciones clínicas, particularmente con respecto a la implementación de programas de administración de antibióticos del hospital.

En el presente trabajo, presentamos un protocolo multiplex alto rendimiento líquido cromatografía-espectrometría total en tándem (HPLC-MS/MS) para la cuantificación de cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid y piperacilina, utilizados antibióticos en unidades de cuidados intensivos. El método comprensivo anteriormente se validó según la pauta de la Agencia Europea de medicamentos.

Después de una limpieza rápida de la muestra, los analitos son separados en una columna HPLC de fase reversa C8 dentro de 4 minutos y cuantificados con el correspondientes estables isótopo-etiquetada estándares internos en espectrometría de masas por electrospray ionización (ESI +) en reacción de múltiples tiempo control (MRM). El método presentado utiliza una instrumentación simple ajuste con condiciones cromatográficas uniforme, lo que permite el seguimiento diario y robusto antibiótico terapéutico en los laboratorios clínicos. La curva de calibración extiende el rango de concentración farmacocinética, así como antibióticos cantidades cerca de la concentración inhibitoria mínima (CIM) de las bacterias susceptibles y las concentraciones máximas (C_max) que se obtienen con bolo regímenes de administración. Sin la necesidad de la dilución de suero antes de la limpieza de la muestra, puede obtenerse el área bajo la curva para un antibiótico administrado a través de mediciones múltiples.

Introducción

Aunque los antibióticos han revolucionado la práctica de la medicina, graves infecciones bacterianas siguen siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en enfermedades graves¹. En este sentido, la administración pronta de un antiinfeccioso adecuado en una dosis adecuada es de importancia superior para el control de la enfermedad².

Un creciente cuerpo de evidencia demuestra que el tratamiento empírico con antibióticos de amplio espectro se está convirtiendo en cada vez más problemático con la complejidad de las poblaciones de pacientes. Esto es especialmente cierto para unidades de cuidados intensivos (UCI), donde una enorme variabilidad interindividual de los parámetros farmacocinéticos claves del (PK) con frecuencia se observa^3,4. En consecuencia, pacientes de la UCI están en riesgo inminente de niveles sub-terapéuticos con el peligro de un escaso éxito terapéutico^5,6. Por otra parte, pacientes exponen innecesariamente a excesivamente altas concentraciones de antibióticos que pueden resultar en eventos adversos graves con ningún beneficios clínicos⁷. El mal uso de antibióticos y la dosificación insuficiente también han impulsado la difusión de la resistencia a los antibióticos, que se está convirtiendo en una amenaza creciente para la salud pública⁸.

Para mejorar el uso de antibióticos y para preservar su effectivenessas tiempo como sea posible, la Organización Mundial de la salud ha puesto en marcha un plan de acción global sobre resistencia a los antimicrobianos en 2015⁹. Los programas de administración de antibióticos constituyen una piedra angular esencial de uso prudente de antimicrobiano en la salud pública nacional estrategias¹⁰, ayudando a los médicos a mejorar significativamente la calidad de atención del paciente¹¹ y, al mismo tiempo, la reducción de la resistencia a los antibióticos¹². Antimicrobiano dosis en pacientes individuales a través de la aplicación de drogas terapéuticas (TDM) el monitoreo es un instrumento clave en este contexto¹³.

Hasta la fecha, disponible en el mercado TDM ensayos sólo están disponibles para los antibióticos glucopéptidos y aminoglucósidos. La cuantificación de sustancias de otras clases comúnmente requiere un desarrollo interno o validación que puede resultar engorroso. Por lo tanto, presentamos en detalle el protocolo para un ensayo basada en espectrometría de masa sólido que puede ser utilizado para la cuantificación de los principales antibióticos en UCI dentro de sus rangos de concentración relevante clínica¹⁴. El método fue establecido recientemente en nuestro centro de espectrometría de masas y se ha aplicado para la rutina de TDM en UCI desde entonces. El procedimiento utiliza un marco analítico sencillo y simple con una limpieza uniforme de la muestra, lo que permite la rápida aplicación de antibiótico TDM en muchas instalaciones con capacidades de espectrometría de masas.

El protocolo descrito aquí fue optimizado para la cuantificación de cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid y piperacilina en suero humano, usando la cromatografía de líquidos de dilución isotópica (LC) en combinación con un tándem masa Espectrometría (MS/MS). Para la dilución del isótopo metodología LC-MS/MS, compuestos marcados con isótopos estables se añaden a una muestra de interés con una matriz específica (p. ej., suero). Normas de marcado con el isótopo pueden distinguirse de sus contrapartes sin etiqueta, es decir el analito de interés, debido a distintos pesos moleculares de la molécula natural y sus productos de fragmentación, como una transición de padres-ion a hija-ion. Compuestos marcados con isótopos tienen un comportamiento general fisicoquímico idéntico en comparación con su contraparte sin etiqueta, son normas internas ideal para MS/MS, lo que permite una cuantificación del analito casi independiente de la matriz con un alto grado de precisión¹⁵. Hoy en día, muchos estables isótopo-etiquetada estándares internos que pueden utilizarse para la cuantificación de moléculas pequeñas, como el TDM de antimicrobianos, están disponibles en el mercado.

La separación cromatográfica de los analitos antibióticos en el protocolo descrito se realiza con una columna de fase inversa de longitud de la cadena alquil C8 analítica (100 mm x 2,1 mm, 3 μm tamaño de las partículas). Durante el desarrollo del método, los factores internos estándar matriz normalizada para todos los analitos fue entre 94,6% y 105,4%, con un coeficiente de variación de ≤8.3%¹⁴.

Protocolo

Nota: Se recomienda para trabajar en una campana de humos al manipular disolventes orgánicos, como el metanol. Preparar todos los búferes y fases móviles en matraces aforados. Si no indique lo contrario, las soluciones se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta 1 mes después de la preparación.

1. preparación de los calibradores y las muestras de Control de calidad

Nota: Una hoja de análisis de datos correspondientes para la preparación de soluciones stock y spike se da en el Archivo suplementario. Por razones de trazabilidad, inserte el fabricante, número de catálogo y mucho número de cada antibiótico en las columnas correspondientes. Disolver todos los antibióticos en una cámara frigorífica a 4 ° C y mantener el tiempo de trabajo tan corto como sea posible.

1. Preparar 100 mL de metanol al 25% en agua: rellenar previamente un matraz aforado de 100 mL con 25 mL de metanol absoluto y completar hasta 100 mL con agua destilada.
2. Preparar 10 mL de ácido acético de 200 mM en agua: rellenar previamente un matraz aforado de 10 mL con 9 mL de agua de calidad HPLC, agregar 115 μl de ácido acético glacial (99.5% de pureza, 17,4 M) y agregar agua destilada hasta 10 mL.
3. Preparar 25 mL de metanol al 25% en agua con ácido acético al 20 mM: rellenar previamente un matraz aforado de 25 mL con 2,5 mL de la solución de ácido acético acuoso 200 mM, añadir 6,25 mL de metanol absoluto y llenar el matraz de 25 mL con agua destilada.
4. Utilice una balanza de precisión para pesar la cantidad adecuada de antibióticos en tubos cónicos de 15 mL como se describe en el Archivo suplementario en el peso inicialde la columna.
5. Preparar las soluciones madre de las fluoroquinolonas, ciprofloxacino y moxifloxacina en el 25% metanol-agua, incluidas 20 mM acético ácido. Para ello, agregue el volumen correspondiente a las cantidades ponderadas como se describe en el Archivo suplementario en la columna "volumen final". Disolver rápidamente los antibióticos de fluoroquinolona en un baño de ultrasonido por 2 min y todo con un vórtex intenso.
6. Preparar soluciones de cefepima, linezolid, meropenem y piperacilina en el 25% de metanol-agua. Para ello, agregue el volumen correspondiente a las cantidades ponderadas como se describe en el Archivo adicional en el volumen final de la columna y disolver rápidamente los antibióticos con un vórtex intenso. Meropenem se disuelven como la última sustancia.
7. Combinar las soluciones stock de los antibióticos como se describe en la tabla de volumen correspondiente de solución madre en el Archivo suplementario para rendimiento de espiga-soluciones concentradas diez veces.
8. Punto nueve volúmenes de suero libre de drogas con un volumen de las soluciones de punto concentrada diez veces para obtener los calibradores de suero 0 – 7 y los controles de calidad (QC) un-D. Por ejemplo, Añadir 0,5 mL de solución de punto a 4,5 mL de suero en un tubo de polipropileno de 10 mL e incubar durante 15 min en el almacenamiento en frío a 4 ° C en un mezclador de rodillos a 50 rpm.
9. Utilizar una pipeta repetitiva para generar 100 alícuotas de μl de los calibradores y QCs en tubos de polipropileno de 1.5 mL.
10. Almacenar los calibradores, controles de calidad y soluciones antibióticas a-80 ° C hasta por seis meses.
11. Para cada antibiótico, también preparar una solución limpia que contiene 1.000 mg/L de un antibiótico único. Diluir la solución correspondiente con un diluyente apropiado (por ejemplo, para ciprofloxacin, use 25% metanol-agua 20 mM acético).
    Nota: Las soluciones de antibióticas aseadas son necesarias para la afinación de instrumento sólo.

2. preparación de la mezcla de estándares internos

Nota: Los estándares internos son contrapartes marcada con isótopo de los analitos de interés que se añaden a una muestra durante la limpieza de la muestra. Como las normas internas tienen casi idénticas propiedades físico-químicas en general a sus homólogos sin etiqueta, compensan los efectos de la matriz de una muestra determinada.

1. Preparar 10 mL de metanol al 50% en agua añadiendo 5 mL de metanol absoluto a un matraz de 10 mL agitar y completar a 10 mL con agua destilada.
2. Preparar 10 mL de metanol 50% en agua, incluyendo el ácido acético 20 mM. Para ello, añada 1 mL de ácido acético de 200 mM a un matraz de 10 mL, agregar 5 mL de metanol absoluto y completar hasta 10 mL con agua destilada.
3. Generar soluciones de estándares internos (si) con 1.000 mg/L en los frascos de proporcionado por el fabricante. Disolver el cefepime -¹³C₁²D₃ sulfato en agua destilada, meropenem-D₆, linezolid-D₃y piperacilina-D₅ en una solución de metanol-agua 50%. Ciprofloxacina-D₈ en 50% de metanol-agua con 20 mM acetato y moxifloxacina clorhidrato -¹³C₁D₃ en agua destilada con acetato de 20 mM se disuelven.
4. Combinar las soluciones stock es en un tubo de polipropileno de 1.5 mL para producir una mezcla estándar interna concentrada por cinco veces. Añadir 10 μl de cefepime -¹³C₁²D₃, 10 μl de meropenem-D₆, 1 μl de ciprofloxacina-D₈, 2 μl de moxifloxacina clorhidrato -¹³C₁D₃, 2 μl de linezolid-D ₃y 10 μl de piperacilina-D₅ a 965 μl de metanol-agua de 25%.
5. Almacenar las soluciones stock estándar internas y la quíntuple mezcla concentrada es a-80 ° C.

3. paciente almacenamiento

Nota: Asegúrese de que el suero se obtiene tan rápido como sea posible y que se mantenga la cadena de frío de las muestras congeladas.

1. Recoger la sangre en los tubos de suero.
2. Deje que el coágulo de sangre de 20-30 min a temperatura ambiente.
3. Separar el suero de la sangre por centrifugación a 2.000 x g por 10 min.
4. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio de polipropileno.
5. Almacenar el suero hasta seis meses a-80 ° C hasta que se ensayaron. También puede almacenar las muestras hasta 3 días a-20 ° C.

4. preparación tampón para cromatografía

1. Para preparar 1 M formiato de amonio en agua, disolver 6,306 g de formiato de amonio en 100 mL de agua de calidad HPLC utilizando un matraz de 100 mL batido. Almacenar la solución hasta 1 mes a 4 ° C.
2. Preparar el móvil un [formiato de amonio 10 mM en ácido fórmico-agua (99.9:0.1 v/v)] de la fase. Rellenar previamente un matraz aforado de 1.000 mL con 500 mL de agua de calidad HPLC, añadir 1 mL de ácido fórmico y 10 mL de la solución de formiato de amonio de 1 M y completar hasta 1.000 mL con agua de calidad HPLC. Fase móvil A la transferencia a un frasco de vidrio limpio y conectar al sistema de HPLC. Fase móvil de la tienda hasta 2 semanas a temperatura ambiente.
3. Preparar la fase móvil metanol absoluto B. transferencia grado HPLC en un frasco de vidrio limpio y conectar al sistema de HPLC.
4. Utilizar metanol absoluto como disolvente de lavado de la aguja y conecte el tubo correspondiente a la botella de vidrio que contiene la fase móvil B.
5. Generar el sello y purgación solvente de ácido fórmico de metanol-agua (7:92.9:0.1, v/v/v). Rellenar previamente un matraz aforado de 1.000 mL con 500 mL de agua destilada, agregar 70 mL de metanol absoluto, 1 mL de ácido fórmico y añadir agua destilada a 1000 mL. Transferir el solvente a un frasco de vidrio limpio y conectar con el sistema HPLC.
   Nota: Varios sistemas de muestreadores utilizan un fuerte y un solvente de lavado de aguja débil. En tal caso, preparar las soluciones de lavado según las recomendaciones del fabricante. Por ejemplo, el lavado fuerte con alcohol metanol-agua-isopropylic (70:20:10, v/v/v) y los débiles lavar con agua-metanol (95: 5, v/v).

5. instrumento Tuning

Nota: Este paso se realiza para el establecimiento del método en un espectrómetro de masas específico.

1. Diluir el analito aseado 1.000 mg/L y soluciones estándar interno 1:10 o 1: 100 en una mezcla de la fase móvil A y B (50: 50, v/v), dependiendo de la intensidad de señal de detector. Sintonizar el espectrómetro de masas con la función autotune o hacer un ajuste manual para los siguientes iones de padre a hija transiciones¹⁴: cefepime (481.0 > 167.0/395.7), cefepime -¹³C₁²D₃ (485.1 > 167,1 / 400.0), meropenem (384.1 > 114.0/141.0), meropenem-D₆ (390.1 > 114.0/147.2), ciprofloxacina (332.0 > 231.0/245.0), ciprofloxacina-D₈ (340.1 > 235.1/249.3), moxifloxacina (402.0 > 261.0/383.9), moxifloxacina-¹³ C₁D₃ (406.1 > 265.1/388.0), linezolid (338.0 > 235.0/296.0), linezolid-D₃ (341.1 > 235.1/297.1), piperacilina (518.0 > 143.0/358.9) y piperacilina-D₅ (523.1 > 142.8/364.1).
2. Para instrumentos con autotuning, utilice la función autotune para ajustar automáticamente el voltaje y la configuración de la entrada de MS a través de los detectores.
3. Para instrumentos con sintonización manual, ajustar los parámetros (por ejemplo, voltaje de choque y energía de la colisión) hasta el óptimo (generalmente el máximo) intensidad de la señal se obtiene en el detector para cada ion de padre e hija. Por ejemplo, una mezcla t del enchufe, entregar la fase móvil A y B (50: 50, v/v) a 0,5 mL/min e infundir continuamente el estándar de antibiótico o interno aseado con un caudal de 0,1 mL/min.

6. configuración HPLC-MS/MS

Nota: Cuenta del espectrómetro de masas, HPLC sistema (incluyendo el inyector automático) y el software correspondiente dependen del fabricante. Adaptar los parámetros del espectrómetro de masas y el procedimiento de lavado según las recomendaciones del fabricante.

1. Almacenar los parámetros de espectrómetro de masas en un correspondiente 'MS tune archivo '. Uso de ionización por electrospray en modo positivo (ESI +) para todos los analitos. Adaptar la configuración de fuente de iones para el instrumento utilizado (por ejemplo, una tensión capilar de 1.5 kV, una temperatura de fuente de 120 ° C, una temperatura de 400 ° C de desolvation, un desolvation gas caudal 600 L/h, un voltaje de RF lente de 0.1 V y un tiempo de permanencia de 80 ms).
2. Especificar el analito y estándares internos ajustar parámetros (por ejemplo, la tensión capilar, energía de la colisión) en un 'MS archivo de '.
3. Establecer las condiciones de muestreadores como sigue en la 'archivo de entrada ': la temperatura de la muestra a 10 ° C con un límite de ± 5 ° C; la secuencia de lavado en x 1 purga-lavado-purga con 600 μl de purga reemplazo de volumen.
4. En la mencionada 'archivo de entrada ', establecer el caudal de 0,4 o 0,5 mL/min, el tiempo de ejecución a 4 minutos, el límite superior de presión de 345 bar y la temperatura de la columna a 30 ° C con un límite de ± 5 ° C. Agregue el nombre solvente de fases móviles A y B y les B/93% al 7%, respectivamente.
5. Programa el gradiente cromatográfico en el 'archivo de entrada ' como sigue: 0.00 – 0.10 min con fase móvil de 7% B/93% A, 0,11 – 0,60 min con fase móvil 65% B/35% A, 0,61 – 2.10 min con la fase móvil 95% B/5% A, 2.11 – 4.00 min con fase móvil de 7% B/93% A.
   Nota: Calcular el volumen de la columna extra, el volumen de retención para la plataforma instrumental y los factores de retención del analito según lo descrito en la USP < 621 > cromatografía pauta¹⁶.

7. muestra medición Master File

Nota: Con el 'ejemplo de archivo de medición principal ', se especifican las muestras de pacientes, el análisis de HPLC-MS/MS se inicia y se realiza la evaluación de datos. Se generan dos archivos de plantilla separados, incluyendo un par de control de baja y alta calidad; una plantilla incluye control de calidad par A y C, el otro un par de control de calidad B y D.

1. Crear una nueva 'ejemplo medición principal de archivo '. Seleccione la mencionada 'MS tune archivo ', 'MS archivo de 'y 'archivo de entrada' (sección 6), en cada línea de muestra y se especifica el volumen de inyección con 15 μl.
2. En orden ascendente, añadir el "texto de ejemplo" para calibradores 0 – 7 y control de calidad (QC) par aire acondicionado o control de calidad par B/D.
3. Especificar el tipo de muestra. Seleccione el tipo de muestra "estándar" para los calibradores y "Control de calidad" para los pares de control de calidad.
4. Especificar la concentración de cada sustancia antibiótica para los correspondientes calibradores y controles de calidad (ver la hoja de cálculo, concentración [μg/mL] Cal 7 – Cal 0, control de calidad del aire/acondicionado o B/D,).
5. Programa de la 'método de evaluación de datos '. Utilizar las transiciones que fueron optimizadas en el instrumento de ajuste (artículo 5). Coincidir con cada antibiótico con el correspondiente marcado con el isótopo estándar (e.g., meropenem - meropenem-D₆).

8. limpieza y análisis de HPLC-MS/MS de la muestra

Nota: Por cada lote de muestras, un control de calidad vinculado con una concentración de antibiótica alta y baja (aire acondicionado de control de calidad o control de calidad B/D) es procesado y analizado. Entre diversas hornadas, las muestras pareadas de control de calidad se utilizan en una secuencia alternativa (p. ej., el día 1, seleccione el 'muestra medición maestra de archivos ' incluyendo control de calidad par aire acond., en el día 2, seleccionar el par de control de calidad incluyendo una B/D. El procesamiento de las muestras de suero se ilustra en la figura 1.

1. Preparar el agente de precipitación 10% metil -tert-éter butílico en metanol (10:90, v/v) (p. ej., matraz aforado de prellenado a 25 mL con 2,5 mL de metil -tert-éter butílico y completar a 25 mL con metanol absoluto).
2. Coloque la fase reversa C8 en la cámara de la columna. Conecte el HPLC y el espectrómetro de masas en la dirección del flujo.
3. Generar la lista de muestra. Abrir el correspondiente 'muestra medición maestra de archivos ' plantilla y agregar las muestras de pacientes para procesar a la lista. Generar grupos de hasta 20 muestras de pacientes y flanco con el par de control de calidad correspondiente.
4. Mojado-prime el sistema HPLC utilizando el 'archivo de entrada ' software de control: la función de "primer mojado" a 50% fase móvil B A/50% y mojado-prime por 2 min con un flujo de 1 mL/min.
5. Actualizar la jeringa. Para ello, ejecutar 6 trazos de 600 μL en el software de control.
6. Equilibrar la columna de fase reversa C8. El software, activar el flujo de la 'archivo de entrada ' y lavarlo con 7% móvil fase B/93% A un mínimo de 5 minutos, utilizando una tasa de flujo de 0,5 mL/min Verifique la temperatura de la columna de 30 ° C.
7. Descongelar las muestras de pacientes, una alícuota de calibradores 0 – 7 y un par de control de calidad (A / B o C/D).
8. Con una pipeta repetitiva, añada 25 μl de la mezcla estándar interna al calibrador μl 100, muestra del control de calidad o suero del paciente en un tubo de polipropileno de 1.5 mL y agitar el tubo durante unos segundos.
9. Incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de sobremesa (por ejemplo, a 1.200 rpm).
10. Con una pipeta repetitiva, añadir 150 μL de un reactivo de precipitación a la mezcla estándar interno a la muestra.
11. Otra vez, mezclar el tubo para unos pocos segundos e incubar 5 min a temperatura ambiente en un agitador de sobremesa (por ejemplo, a 1.200 rpm).
12. Centrifugar la suspensión a 20.000 x g en una centrífuga de mesa durante 10 min a 4 ° C.
13. Diluir el sobrenadante 1:3 con agua de calidad HPLC utilizando un frasco de vidrio con una inserción de micro y cargar muestras procesadas como para el inyector automático.
14. Iniciar el análisis de HPLC-MS/MS el 'ejemplo medición control de archivo '.
    Nota: Para un almacenamiento prolongado, deje correr la columna analítica según las recomendaciones del fabricante [p. ej., 0,5 mL/min metanol-agua (50: 50, v/v)] para evitar el colapso de la fase.

Figura 1: representación esquemática de la limpieza de la muestra. Precipitación de proteínas en la alta fuerza centrífuga da un pellet denso y claro sobrenadante, indicando eso precipitación de la proteína fue completa. Todo el tiempo de procesamiento es aproximadamente 30 minutos, incluyendo el análisis MS/MS, la limpieza de la muestra y la separación cromatográfica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

9. cuantificación y evaluación de la calidad

1. Para procesar las muestras, abrir el correspondiente 'archivo de control de medición muestra ', seleccione los calibradores, controles de calidad y muestras de pacientes y evaluarlos con el 'método de cuantificación de antibióticos '.
2. Verificar si los picos para un analito se integran correctamente. Inspeccione los picos para cada calibrador, control de calidad y muestra del paciente y reintegrarlos manualmente en la línea de base si es necesario.
3. Estudio de la curva de calibración y determinar si satisface los siguientes criterios de calidad: a) linealidad sobre el rango entero de calibración, b) un coeficiente de calibración r² > 0.995, c) la desviación de cada calibración estándar dentro de ± 15% de la valor nominal, excepto por el límite inferior de cuantificación (LLOQ), donde se requiere ± 20%.
4. Rechazar un estándar de calibración que no cumplan con los criterios antes mencionados y evaluar la curva de calibración, incluyendo el análisis de regresión.
5. Los controles de calidad de estudio y examinar si las desviaciones son dentro de ± 15% del valor nominal.
6. Si la concentración de una muestra del paciente excede la concentración del calibrador más alto, diluir la muestra con agua destilada, hasta 1:5 (p. ej., 100 μl de suero plus 400 μL de agua destilada) antes de la limpieza de la muestra. Reperform pasos 8.8 – 8.14 para muestra específica y reprocesarlo.

Resultados

Utilizando el protocolo descrito, un cromatograma típico se muestra en la figura 2. Según el United States Pharmacopeia (USP) cromatografía directrices¹⁶, se determinó el volumen muerto de la columna en el sistema actual con ~0.22 mL y el volumen de la columna extra (incluyendo los conectores, inyector y tubería) con ~0.08 mL, dando un volumen de retención de ~0.30 mL. Los factores de retención calculado para todos los analitos ...

Discusión

En este manuscrito, se presenta el protocolo para un método de masa basado en la espectrometría de tándem sencillo y robusto para la cuantificación de los antibióticos utilizados en el ICU¹⁹, es decir, cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid, y piperacilina¹⁴. Una hoja de cálculo acompaña el manuscrito para la preparación de soluciones stock de antibióticos, calibradores y controles de calidad, teniendo en cuenta la pureza de los antibióticos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
cefepime hydrochloride	Sigma-Aldrich	1097636	USP Reference Standard
meropenem trihydrate	Sigma-Aldrich	Y0001252	EP Reference Standard
ciprofloxacin	Sigma-Aldrich	17850
moxifloxacin hydrochloride	Sigma-Aldrich	SML1581
linezolid	Toronto Research Chemicals	L466500
piperacillin sodium salt	Sigma-Aldrich	93129
cefepime-13C12D3 sulfate	Alsachim	C1297	Isotope labelled internal standard for cefepime
meropenem-D6	Toronto Research Chemicals	M225617	Isotope labelled internal standard for meropenem
ciprofloxacin-D8	Toronto Research Chemicals	C482501	Isotope labelled internal standard for ciprofloxacin
moxifloxacin-13C1D3 hydrochloride	Toronto Research Chemicals	M745003	Isotope labelled internal standard for moxifloxacin
linezolid-D3	Toronto Research Chemicals	L466502	Isotope labelled internal standard for linezolid
piperacillin-D5	Toronto Research Chemicals	P479952	Isotope labelled internal standard for piperacillin
methanol	JT Baker	8402
HPLC grade water	JT Baker	4218
formic acid	Biosolve	6914132
acetic acid	Biosolve	1070501
ammonium formate	Sigma-Aldrich	70221-25G-F
tert-Butyl methyl ether	Merck	101845
Fortis 3 μm C8 100 * 2.1 mm	Fortis	F08-020503
Ti-PEEK-encased Prifilter (2 μm)	Chromsystems	15011
2795 Alliance HPLC system	Waters	176000491
Quattro micro API Tandem Quadrupole System	Waters	720000338
QuanLynx 4.1 software	Waters	/	Data evaluation software provided by the mass spectrometer manufacturer