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摘要

在此, 我们描述了一种从犬卵巢组织中分离、扩张和分化间充质干细胞的方法。

摘要

在过去的十年里, 人们对间充质干细胞 (mscs) 的兴趣增加了, 因为它们易于分离、扩张和培养。最近, 研究表明, 这些细胞具有广泛的分化能力。卵巢是细胞疗法的一个有希望的候选, 因为它富含骨髓间充质干细胞, 并经常在卵巢切除术后作为生物废物丢弃。本文介绍了从犬卵巢中提取的骨髓间充质干细胞的分离、扩展和分化过程, 而无需细胞分选技术。该方案是再生医学的重要工具, 因为这些高度可微化的细胞在临床试验和治疗用途中具有广泛的适用性。

引言

在过去的十年里, 以干细胞为重点的已发表的研究数量大幅增加, 这一研究工作是由发现强大的再生医学疗法的集体目标推动的。干细胞有两个主要的定义标记: 自我更新和分化。与胚胎干细胞1相比, 间充质干细胞负责正常的组织周转, 分化能力更加有限.最近, 许多研究表明骨髓间充质干细胞有广泛的分化, 目前正在讨论的一个话题是胚胎干细胞和成人干细胞之间的差异是否存在。

卵巢表面上皮是未承诺的细胞层, 分化相对较少, 表达上皮和间充质标记 3, 保留分化为不同类型细胞的能力.环境信号4。干细胞在卵巢中的确切位置尚不清楚;然而, 有人提出, 在中的生物祖细胞会产生生殖细胞5。免疫学研究假设这些细胞的基质起源为 6或位于或接近卵巢表面7。由于间充质干细胞表达了在细胞粘附中发挥重要作用的众多受体, 因此设计了一项实验来检验选择具有快速粘附的细胞群可以清楚地分离出大量细胞的假设在本质上可以被描述为间充质。最近, 我们的小组报告了 mscs 的来源, 基于他们的粘附能力的培养前3小时培养培养培养皿的塑料表面, 以获得纯化的细胞群表现出快速粘附 9.在这里, 我们描述了从卵巢组织中分离间充质干细胞的方法。

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研究方案

本实验是在犬类绝育手术中 , 用 4 个母狗的卵巢进行的。这项试验得到了教科文组织-fcav 动物使用道德委员会的批准 (第026995号议定书)。

1. 实验准备

  1. 准备或购买500毫升无菌的杜尔贝克的磷酸盐缓冲盐水 (dpbs), 不含钙或镁。
  2. 通过将40μg 的酶混合在 dpbs 的1毫升中, 制备胶原酶 i 库存溶液。使用0.2μm 注射器过滤器进行过滤, 并在-20°c 时存储2毫升。
  3. 用10% 的胎儿血清和1% 的抗生素从 dulbecco 的改良鹰培养基 (dmem) 低血糖中制备培养基。
  4. 收集无菌材料: 剪刀和钳子、组织培养瓶、盘子、管道、10毫升和5毫升移液器。
  5. 使用标准的细胞培养实验室设备: 生物安全柜 (bsc)、5% co 2 和38°c 的细胞培养孵化器和离心机。
  6. 用戴手套的手清洁 bsc: 用 70% etoh 用紫外线灯对其进行消毒。

2. 从卵巢中分离间充质干细胞

  1. 手术后, 将 pbs 中的卵巢放在锥形管的冰上, 直到它们到达实验室。
  2. 用10毫升的 pbs 填充两个100毫米 petri 菜。
  3. 从试管中取出卵巢, 并将其转移到第一个与 pbs 的培养皿中。用混合运动清洗它们。
  4. 轻轻地拿回卵巢, 把它放到另一道菜里。用无菌的推拿器和剪刀, 将组织切成非常小的碎片, 大约1毫米大小。
  5. 将卵巢组织转移到35毫米的培养皿中, 加入2毫升的胶原酶。把纸巾再切一点。
  6. 将培养皿放在38°c 的孵化器中 3小时, 每20分钟以圆周运动轻轻摇晃培养皿。
  7. 3小时后, 从孵化器中取出培养皿。
  8. 将菜的内容物转移到15毫升管中。添加5毫升的扩展介质。
  9. 离心前轻轻倒置管。在 2100 x g 的时间内离心管 7分钟, 取出上清液, 用3毫升膨胀介质重新悬浮颗粒。
  10. 将颗粒转移到 t25 瓶中。在38°c 的情况下, 将瓶放入 5% co2 的孵化器中3小时。
    注: 该程序最重要的部分是在孵育3小时后更换介质。
  11. 从孵化器中取出瓶子, 取出含有剩余组织的介质。在瓶中加入3毫升新鲜的膨胀介质。
  12. 每48小时更换一次介质, 观察瓶子的细胞融合。
    注: 该过程的主要步骤可以在图 1中观察到。

3. 卵巢间充质干细胞的扩张

  1. 细胞通道
    1. 当细胞到达汇合处时, 从瓶子中取出介质。
    2. 用3毫升的 pbs 清洗瓶子。删除 pbs。
    3. 加入1.5 毫升的胰蛋白酶, 在38°c 的孵化器中放入孵化器 3分钟, 轻轻轻拍瓶子, 帮助细胞分离。
      注: 细胞应在初始电镀后达到大约5-7天的融合。
    4. 加入3毫升的膨胀介质, 并将内容物转移到锥形管。
    5. 在 2100 x g的时间内离心管 7分钟, 取出上清液, 加入1毫升的膨胀介质。
    6. 轻轻均匀的管的内容。
    7. 取10μl 的样本进行细胞计数, 并将细胞的管放回孵化器。
    8. 将混合物的10μl 放入血细胞计中。
  2. 对细胞进行计数
    1. 使用显微镜的10倍目标, 并专注于血细胞仪的网格线。
    2. 将单元格数到五个小方块中 (图 2)。
    3. 将计数数乘以 50, 000 以估计每毫升的细胞数。

4. 骨髓间充质干细胞从卵巢的分化

注: 差异化检测是根据 hill 等人制定的准则进行的.9个。

  1. 种子 1.0 x10 4 细胞每口井, 一式三份, 使用4井培养皿。
  2. 添加1毫升的扩展介质。
  3. 用圆周运动轻轻搅拌盘子。
  4. 24小时后, 用理想的分化媒体取代培养基。
  5. 对于成骨、脂质和软骨原分化, 用诱导培养基孵育细胞, 每 3 d 更换一次, 每 3 d 一次, 每项检测都使用特定的分化试剂盒。
  6. 对于神经源性谱系分化, 在诱导培养基中孵育细胞 10 d, 每 3 d 更换一次培养基。这里使用的培养基含有 dmem 低葡萄糖、2 mm 丙戊酸、1μm 氢化可的松、10μm 福斯科林、5mm 氯化钾、5μgml 胰岛素和200μm 丁基羟基烟唑。
  7. 对于内胚层前体, 按照试剂制造商的说明在内皮介质中孵育5d。
  8. 对于原始生殖细胞谱系分化, 在诱导培养基中孵育细胞 14d, 每 3 d 更换一次培养基。这里使用的介质含有 dmem、10% fbs、1 mm 丙酮酸钠、10 ngml lif、1 mm 非必要氨基酸, 2 mm l-谷氨酰胺, 5μg/ml 胰岛素, 0.1 mm β-硫醇, 60μm 酯烷, 20μgml 转铁蛋白, 10ngml 小鼠表皮生长因子, 1 ng/ml 人碱性成纤维细胞生长因子, 40 ngml 人胶质细胞系源性神经营养因子, 青霉素 15 mgl。

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结果

犬卵巢间充质干细胞分离:

图 1总结了卵巢 msc 隔离过程。手术后, 组织切碎, 胶原酶消化, 和培养基改变3小时后的培养, 假定 msc 群体具有快速的塑料粘附性能, 成功地从犬卵巢组织中分离出来。收获的细胞迅速粘附在培养皿的塑料表面, 并成长为形态均匀的单层培养, 具有典型的 ms...

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讨论

在此, 我们提供的证据表明, 骨髓间充质干细胞可以从犬卵巢组织中分离出来, 这被认为是卵巢切除术后的生物废物。由于在卵巢中可以找到许多细胞类型, 我们提出了一种协议, 选择骨髓间充质干细胞的基础上, 他们的快速坚持塑料, 成功地选择细胞生长在单层生长与成纤维细胞样的形态。

第一次从骨髓中提取骨髓间充质干细胞的报告是根据骨髓间充质干细胞在培...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

作者承认联合国教科文组织-fcav 的犬类绝育计划为提供卵巢而提供的。这项工作得到了 fapesp (第2012号进程编号----14293-0) 和 capes 的赠款。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
DPBS Thermo Fisher14190144
Collagenase IThermo Fisher17100017
Tissue flaskCorningCLS3056
DMEM low glucoseThermo Fisher11054020
FBSThermo Fisher12484-010
TrypLE expressThermo Fisher12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation KitThermo FisherA1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation KitThermo FisherA1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation KitThermo FisherA1007201
STEMdiff Definitive Endoderm KitStemCell5110
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher15070063
CD45AbD SerotecMCA 2035S
CD34AbD SerotecMCA 2411GA
CD90AbD SerotecMCA 1036G
CD44AbD SerotecMCA 1041
NestinMiliporeMAB353
β-Tubulin MiliporeMAB1637
DDX4InvitrogenPA5 -23378
IgG- FITCAbD SerotecSTAR80F
IgG- FITCAbD SerotecSTAR120F

参考文献

  1. Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). Atala, A., Lanza, R. , Academic Press. 513-527 (2013).
  2. Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).
  3. Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).
  4. Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).
  5. Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17(2005).
  6. Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).
  7. Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428 (6979), 145(2004).
  8. Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).
  9. Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50 (6), 12391(2017).
  10. Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
  11. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16 (3), 381-390 (1966).
  12. Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).

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