古树康 (GSK) 颗粒的制备,用于 Vivo 和体外实验

摘要

本文为制备古树康颗粒的工作溶液和用于体外实验的含有血清的GSK颗粒提供了详细的方案。该协议可应用于草药的药理学研究以及体内和体外实验的处方。

摘要

中草药在治疗许多疾病(如绝经后骨质疏松症)方面起着替代作用。古树康(GSK)颗粒,在中国销售的处方,在治疗POP具有骨保护作用。在给药到身体之前,通常需要一个标准的制备程序,其目的是促进从生草药中释放活性成分,增强药理作用以及治疗效果。本研究提出了在体内和体外实验测定中使用葛兰素素梅粒的详细方案。作者首先提供了一个详细的协议,以计算动物适合剂量的颗粒进行体内调查:称重,溶解,储存和给药。其次,本文介绍了微CT扫描和骨骼参数测量方案。评估了样品制备、运行微CT机的规程和骨参数的定量。第三,制备含血清的GSK颗粒,提取含药物血清进行体外骨细胞生成和骨细胞生成。葛兰素史克颗粒连续三天每天对大鼠进行两次胃内施用。然后收集血液,离心,灭活,并过滤。最后,对血清进行稀释,用于实施骨细胞生成和骨细胞生成。此处描述的协议可被视为草药处方药(如颗粒)的药理学研究的参考。

引言

中医是治疗骨质疏松症的重要补充和替代方法之^一。水净化是^公式3的基本和最常用的形式。然而,缺点也存在:味道不好,运输不便,保质期短,协议不一致,限制了使用以及治疗效果。为了避免上述缺点,以及追求更好的效果,颗粒被开发,并已被广泛应用4。虽然许多研究已经探索了一个或多个有效成分的药理机制从颗粒5,6,7,确切的机制和潜在的药理过程仍然是难以识别。这是因为一个颗粒中过多的有效成分可能同时产生类似或相反的效果4。因此,开发一个标准方案,在输送到人体之前制备颗粒,不仅对治疗效果有很大的影响,而且对体内和体外检测也是必需的。

此外,在临床颗粒的疗效难以确认和准确识别使用体外或体外研究,这带来了挑战,因为药理机制过于复杂。为了解决这个问题,Tashino于20世纪80年代首次提出制备含药物血清。从那时起,许多研究人员将含药物血清应用于草药,包括颗粒9,10,11。目前,选择含药物血清进行体外调查被认为是一种与生理条件密切相关的策略。

根据中医理论,在临床实践的基础上,研制出用于治疗绝经后骨质疏松症(POP)的古树康(GSK)颗粒。葛兰素史克颗粒可防止体内卵泡(OVX)小鼠的骨质流失,抑制骨细胞骨吸收,刺激成骨骨形成4。因此,Li^等人12日发现,GSK颗粒通过增强钙受体的活性来刺激骨骼形成,对OVX小鼠具有骨保护作用。为了确认GSK颗粒的骨保护作用和药理作用,作者在这里提供了一个详细的程序,用于制备工作溶液和含有药物(GSK颗粒)的血清。此外,本文还介绍了GSK颗粒在OVX诱导的骨化小鼠模型和GSK含颗粒血清中的应用,用于体外骨细胞形成/骨细胞发生。

GSK颗粒由几种草药13、14组成,很容易完全溶解在盐水中。因此,盐水作为车辆。沙姆操作小鼠(Sham)和OVX小鼠施用的盐水量与颗粒施用小鼠相同。根据Meeh-Rubner^方程15计算了小鼠的葛兰素史克颗粒的等效剂量。该方程不仅具有获得安全剂量的优点,而且保证了药理^作用15。葛兰素史克颗粒的三种剂量如下: (1) GSKL: OVX = 低剂量葛兰素史克颗粒, 2 g/kg/天.(2) GSKM:OVX = 中剂量葛兰素史克颗粒,4 克/千克/天。(3) GSKH:OVX = 高剂量葛兰素史克颗粒,8克/千克/天。GSKL、GSKM和GSKH组的小鼠是胃内管理的葛兰素史克颗粒。碳酸钙(600毫克/片)与维生素D3(125国际单位/片剂),例如,在成熟和上市的产品(例如,钙酸盐[CAL])用于治疗和预防骨质疏松症,被用作积极的控制。

研究方案

所有实验程序均经上海中医药大学动物护理与使用委员会(SZY201604005)批准。

1. 葛兰素史克工作解决方案的准备和管理

1. 计算小鼠的葛兰素史克颗粒的等效剂量。
   1. 基于 Meeh-Rubner 方程¹⁵计算身体表面 :身体表面 = K x (体重^2/3) /1000,其中 K 值为 10.6,用于人类,9.1 表示鼠标。假设人体重量为70公斤,则人体表面(m 2)= 10.6 x (70^2/3)/1000 = 1.8 m²。假设小鼠体重为 20 g(0.02 千克;例如,1 个月大、雌性、C57/BL6),则小鼠身体表面 (m²⁾= 9.1 x (0.02 2/3)/1000 = 0.0067 m²。
   2. 根据计算出的体面,计算人和小鼠的体变换比。人:70公斤/1.8米2×39。鼠标: 0.02 kg/0.0067 m² = 3。GSK 颗粒 = 20 g/70 kg x 39/3 = 3.72 g/kg = 4 g/kg。
   3. 根据每只小鼠20克的体重,计算小鼠的等效剂量:4克/千克x0.02千克=0.08克。
   4. 根据每组20只小鼠和持续3个月(90天)的干预措施计算三个等效剂量的葛兰素史克颗粒:(1) GSKL(OVX = 低剂量葛兰素克颗粒[2克/千克/天]):0.04克小鼠/天x20只小鼠=90天=72克(2)GSKM(OVX = 中剂量葛兰克斯颗粒=4克/千克/日数:0.08克鼠标/天 x 20只小鼠x90天= 144克(3)GSKH(OVX = 高剂量葛兰素克药颗粒[8克/千克/天]):0.12克小鼠/天x20只小鼠x90天=216克。
      注:在实践中准备另外20%的GSK颗粒,以抵消损失。
2. 根据^体重15计算每只小鼠的GSK颗粒体积:例如,体积(V)= 0.24 mL/鼠标/天。
   注:小鼠胃内给塞的体积为0.12 mL/10 g。
3. 称量10天,三剂葛兰素史克颗粒。重量为 8 g、16 g 和 24 g GSK 颗粒,分别用作 GSKL、GSKM 和 GSKH。
4. 根据 Meeh-Rubner 方程^15,计算小鼠的碳酸钙与维生素 D3 (CAL) 的等效剂量,如步骤 1.1.1 和 1.1.2 中:CAL 剂量 = 2 片/70 千克 x 39/3 = 0.372 片/千克 = 0.4 片/千克。
5. 根据每只小鼠 20 g 的体重(例如,1 个月大、雌性、C57/BL6),计算小鼠 CAL 的等效剂量:0.4 片/千克 x 0.02 kg = 0.008 片。然后根据每组20只小鼠和持续3个月(90天)的干预计算CAL的等效剂量:0.008片x20 x 90 = 14.4片。称量 10 天的 CAL(1.6 片)。
6. 溶解
   1. 将 8 g gSK 颗粒放入 50 mL 管中。加入48 mL的盐水和摇管,完全溶解。
      注:完全溶解的标准是无沉积物。完全溶解可以进一步确认,如果一个加夫塔针可以绘制的工作解决方案,然后顺利驱逐它。
   2. 使用 16 g 和 24 g GSK 颗粒重复步骤 1.5.1。
   3. 将 1.6 片(10 天价值)CAL 放入 50 mL 管中。加入48 mL的盐水和摇管,完全溶解。
      注:工作溶液可储存在-4°C,每10天准备一次。
7. 胃内管理
   1. 抓住鼠标的背面(1 个月大,雌性,C57/BL6),鼠标朝前,确保它牢牢地停留在该位置。在给塞前保持鼠标平静 2⁄3 分钟。
      注:确保研究人员能够清楚地看到鼠标的前部。戴上手套,以防止老鼠叮咬,特别是对于新的研究人员。
   2. 将加维针(尺寸:#12,40 mm)放入 GSK 颗粒的工作溶液中,并绘制 0.24 mL 的工作溶液。
   3. 将加夫刺针通过嘴的一侧放入小鼠体内,直到加夫针到达胃部。
      注:要确认腹针已到达胃部:(1)加维针遇到阻力感。同时,小鼠在食道的肉体变窄之前显示吞咽的动作。(2) 将工作溶液的约 0.5 mL 注入鼠标,等待 1 分钟。如果小鼠没有溶液,这意味着胃部针头已经到达胃部。
   4. 将葛兰素史克颗粒(0.24 mL/鼠标)的工作溶液注射到胃中,然后抽出花管针。把鼠标送回笼子里。
   5. 使用 CAL 解决方案重复步骤 1.6.4,并每只鼠标注入 0.24 mL 的 CAL 溶液。
      注: CAL 解决方案的体积计算在步骤 1.2 中。

2. 微型CT扫描

1. T伊比亚收获和制备
   1. 在90天干预后的第二天用300mL/100g80mg/kg氯胺酮对小鼠进行腹内麻醉。使用针捏脚趾,以确认鼠标是否完全麻醉。没有反应表明麻醉成功。然后用宫颈脱位杀死老鼠。
   2. 用粘钉将鼠标用胳膊和腿固定在泡沫上。
   3. 用剪刀(大小:8.5 厘米)和钳子(大小:10 厘米)从近端到远端切断皮肤,然后收获 tibias。
   4. 立即将 tibias 放入 70% 乙醇中,并洗涤 3 次。
2. 用海绵泡沫包裹鼠标的左肋骨,并将其放入样品管(直径35毫米,长度140毫米)。
   注:试样的长轴应与样品管的长轴一样。确保 tibia 的近端向上。
3. 运行微型CT 80扫描机
   1. 在室温下启动微型CT 80扫描机。
   2. 将样品管设置为 micro-CT 80,并基于以下扫描参数开始横截面扫描:像素大小 15.6 μm、管电压 55 kV、管电流 72 μA、集成时间 200 ms、空间分辨率 15.6 μm、像素分辨率 15.6 μm 和图像矩阵2048 x 2048。
      注: 通过预扫描,可区分取消骨骼与皮质骨骼。tibia 的扫描区域定义为从头骨高原以下 5 mm 到远端的取消骨区域。
4. 骨参数的定量
   1. 完成横截面扫描后,获取左斜面的图像。
   2. 将密度阈值设置为 245×1000。使用微CT评估程序V6.6测量以下骨骼参数:骨矿物密度(BMD)、总体积以上的骨量(BV/电视)、骨质骨数(Tb.N)、骨骼厚度(Tb.Th)以及骨骨分离(骨骼分离)Tb.Sp)。

3. 用于体外实验的血清制备

1. 计算
   1. 根据0.2公斤的大鼠体重(1个月大,雌性,斯普拉格-道利),计算葛兰素史克颗粒的剂量:人剂量/天x人x K/体重的老鼠=20克/70公斤/天x70公斤xK(K = 0.018)/0.2千克=2克/千克/天。
      注:K是人与^小鼠15之间的药理转化系数(K = 0.018)。
   2. 重复步骤 3.1.1 并计算以下剂量。
      1. 计算GSKL的用量:10克/70公斤/天x70公斤xK/0.2 kg = 1克/千克/天。
      2. 计算GSKM的用量:20克/70公斤/天x70公斤xK/0.2 kg = 2克/千克/天。
      3. 计算GSKL的用量:40克/70公斤/天x70公斤xK/0.2 kg = 4克/千克/天。
      4. 计算CAL的用量:2片/70公斤/天x70公斤xK/0.2 kg = 0.2片/公斤/天。
   3. 计算葛兰素史克颗粒和CAL的总剂量。
      1. 计算GSKL的总剂量:1克/千克/天x0.2千克x6只大鼠x3天=3.6克。
      2. 计算GSKM的总剂量:2克/千克/天x0.2公斤x6只大鼠x3天=7.2克。
      3. 计算GSKH的总剂量:4克/千克/天x0.2公斤x6只大鼠x3天= 14.4克。
      4. 计算 CAL 剂量 = 0.2 片/千克/天 x 0.2 千克 x 6 只大鼠 x 3 天 = 0.72 片。
         注:制备100 mL培养基(20%GSK含颗粒血清)需要10mL含GSK颗粒血清。离心后,每只大鼠(6只大鼠/组)可提供1.5~2 mL的GSK含颗粒血清。
   4. 根据^体重15计算每只大鼠的GSK颗粒体积:例如,体积(V)= 2 mL/大鼠/天。
      注:大鼠胃内给给剂的体积为0.1 mL/10 g。
2. 称量3天,三剂葛兰素史克颗粒。重量为 3.6 g、7.2 g 和 14.4 g GSK 颗粒,分别用作 GSKL、GSKM 和 GSKH。CAL 组的重量为 0.72 片。
3. 将 7.2 g GSK 颗粒放入 50 mL 管中。加入36 mL的盐水和摇管,完全溶解。用 3.6 g 和 14.4 g GSK 颗粒重复此操作。
4. 重复第 1.6 节,使用 2 mL 的 GSK 工作解决方案进行胃内管理。
   注:施用相同体积的盐水(每只大鼠2 mL)制备血清,并作为体外测定的空白对照组。
5. 含有葛兰素史克的血清的制备
   1. 上次使用GSK颗粒后,用300mL/100g80mg/kg氯胺酮1小时对大鼠进行腹内麻醉。用针捏脚趾,以确认老鼠是否完全麻醉。没有反应表明麻醉成功。
   2. 在切开皮肤和腹膜后,用直手术剪刀将腹部暴露在大鼠胸部的底部。
      注:手术器械在使用前必须在高温高压下消毒。在采血过程中,手术区域必须用70%乙醇进行消毒。
   3. 用纸巾取出腹部主塔的结缔组织,以清晰暴露血管。
   4. 使用 10 mL、22 G 注射器从腹部主主塔中抽取血液。然后取出针头,将血液转移到15 mL无菌管中。通常,6~8 mL的血液可以从一只大鼠获得。
      注:每只老鼠在抽血时必须保持生命。一个指标是,当大鼠活着时,腹部主数脉动。老鼠抽血后死了。
   5. 在室温下保持管子直立30-60分钟,直到血液在管中凝固。然后,在500~600 x g下离心管20分钟,将所有上清液(血清)从一组(6只大鼠)转移到一个50 mL无菌管中,然后摇动混合。
   6. 在56°C水浴中孵育血清30分钟,使血清失去活性。 使用0.22μm-孔径亲水型聚硫酮注射器过滤器过滤血清。储存在-80°C供长期使用(少于1年)。
      注:过滤血清可用于体外骨细胞生成和骨细胞生成。
6. 应用
   1. 体外骨细胞生成
      1. 以1:4的比例稀释三剂含葛兰素的血清(GSKL、GSKM、GSKH),用含有L-谷氨酰胺、核苷和脱氧核苷的最小Eagle介质(β-MEM)。
         注:确保体外成骨细胞生成和骨细胞生成中含GSK血清的最终浓度为20%。
      2. 将步骤 3.6.1.1 的稀释 GSK 血清 (200 μL/油井) 添加到骨髓巨噬细胞 (BMM), 从 4-6 周大 C57BL/6 小鼠进行骨细胞形成,并刺激具有巨噬细胞位动因子 (M-CSF, 10 ng/mL) 和受体活化剂的 BMM用于核因子-βB配体(RANKL,100纳克/千米),如前所述2。
   2. 体外骨细胞生成
      1. 重复步骤 3.6.1.1。
      2. 将稀释的GSK血清(2 mL/井)加入4~6周大C57BL/6小鼠的骨质等位干细胞(BMCs),以产生如前^所述16的成骨细胞。

结果

微CT扫描结果表明,与盐水对照小鼠相比,OVX小鼠骨质流失显著(图1A)。葛兰素史克颗粒的介入(90天)大大提高了BMD,特别是在GSKM组(图1B)。骨骼结构参数(如 BMD、BV/TV、Tb.N 和Tb.Th)进行了量化。GSK颗粒处理导致BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th增加,但Tb.Sp(图1C)减少。

与对照小鼠相?...

讨论

中药制剂的颗粒已成为配方或处方的常见选择之一。葛兰素史克颗粒由几种基于临床经验或中医理论的草药组成,具有较好的疗效,副作用少4。与水解相比,颗粒具有以下优点:口感好、交货方便、长期储存、标准方案、疗效一致、生产效率高。目前,颗粒是中医中最常用的药学形态之一。然而,药理作用的基本机制仍然很少被研究。有必要确定制备颗粒的关键步骤,以研究潜在的药理?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-MEM	Hyclone laboratories	SH30265.018	For cell culture
β-Glycerophosphate	Sigma	G5422	Osteoblastogenesis
Caltrate (CAL)	Wyeth	L96625	Animal interventation
C57BL/6 mice	SLAC Laboratory Animal Co. Ltd.	Random	Ainimal preparation
Dexamethsome	Sigma	D4902
Dimethyl sulfoxide	Sigma	D2438	Cell frozen
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Sangon Biotech	60-00-4	Samples treatmnet
Fetal bovine serum	Gibco	FL-24562	For cell culture
Gushukang granules	kangcheng companyin china	Z20003255	Herbal prescription
Light microscope	Olympus BX50	Olympus BX50	Images for osteoclastogenesis
L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate	Sigma	A8960-5G	Osteoblastogenesis
Microscope	Leica	DMI300B	Osteocast and osteoblast imagine
M-CSF	Peprotech	AF-300-25-10	Osteoclastogenesis
Μicro-CT	Scanco Medical AG	μCT80 radiograph microtomograph	Bone Structural analsysis
RANKL	Peprotech	11682-HNCHF	Osteoclastogenesis
Sprague Dawley	SLAC Laboratory Animal Co. Ltd.	Random	Blood serum collection
Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT	TRAP staining