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Neste Artigo

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Resumo

Este artigo fornece um protocolo detalhado para preparar uma solução de trabalho de grânulos de Gushukang para estudos animais e o grânulo de GSK que contem o soro para in vitro experimenta. Este protocolo pode ser aplicado a investigações farmacológicas de fitoterápicos, bem como prescrições para experimentos in vivo e in vitro.

Resumo

A medicina erval chinesa tradicional joga um papel como um método alternativo em tratar muitas doenças, tais como a osteoporose na pós-menopausa (PNF). Os grânulos de gushukang (GSK), uma prescrição comercializada em China, têm efeitos osso-protetores em tratar o PNF. Antes da administração ao corpo, um procedimento padrão da preparação é exigido geralmente, que visa promover a liberação de constituintes ativos das ervas cruas e realçar os efeitos farmacológicos assim como resultados terapêuticos. Este estudo propõe um protocolo detalhado para o uso de grânulos de GSK em ensaios experimentais in vivo e in vitro. Os autores fornecem primeiramente um protocolo detalhado para calcular as dosagens animal-apropriadas dos grânulo para a investigação in vivo: pesando, dissolvendo, armazenamento, e administração. Em segundo lugar, este artigo descreve protocolos para a varredura do Micro-CT e a medida de parâmetros do osso. Foram avaliados a preparação da amostra, protocolos para a execução da máquina de microtomografia computadorizada e quantificação dos parâmetros ósseos. Em terceiro lugar, os grânulos GSK contendo soro são preparados, e o soro contendo medicamentos é extraído para osteoclastogênese in vitro e osteoblastogênese. Os grânulos de GSK foram administrados intragástrica duas vezes por o dia aos ratos por três dias consecutivos. O sangue foi então coletado, centrifugado, inativado e filtrado. Finalmente, o soro foi diluído e usado para executar o osteoclastogênese e o osteoblastogenesis. O protocolo descrito aqui pode ser considerado uma referência para investigações farmacológicas de medicamentos de prescrição de ervas, como grânulos.

Introdução

A medicina tradicional chinesa (TCM) é uma das importantes abordagens complementares e alternativas para o tratamento da osteoporose1,2. A decocção de água é a forma básica e mais comumente usada da fórmula3. No entanto, desvantagens também existem: mau gosto, inconveniente para o transporte, vida útil curta e protocolos inconsistentes, limitando os usos, bem como os efeitos curativos. Para evitar as desvantagens acima, bem como para perseguir melhores efeitos, os grânulos foram desenvolvidos e têm sido amplamente utilizados4. Embora muitos estudos tenham explorado os mecanismos farmacológicos de um ou mais componentes efetivos dos grânulos5,6,7, os mecanismos exatos e os processos farmacológicos subjacentes ainda são difícil de identificar. Isto é porque muitos componentes eficazes de um grânulo podem simultaneamente exercer efeitos semelhantes ou opostos4. Portanto, o desenvolvimento de um protocolo padrão para preparar os grânulos antes de entregar para o corpo não só teria um grande impacto sobre os resultados terapêuticos, mas também é necessária para ambos in vivo e in vitro ensaios.

Além disso, os efeitos curativos dos grânulos na clínica são difíceis de confirmar e identificam exatamente o uso de estudos in vitro ou ex vivo, o que cria um desafio porque os mecanismos farmacológicos são muito complexos. Para resolver isso, a preparação do soro contendo drogas foi proposta pela primeira vez por Tashino na década de 19808. A partir de então, numerosos pesquisadores aplicaram soro contendo medicamentos à fitoterapia,incluindo grânulos9,10,11. Atualmente, a escolha do soro contendo medicamentos para investigações in vitro é considerada como uma estratégia que imita de perto as condições fisiológicas.

Os grânulos de gushukang (GSK) foram desenvolvidos para tratar a osteoporose pós-menopausa (POP) com base na prática clínica à luz da teoria da TCM. Os grânulos de GSK impedem a perda óssea em camundongos ovariectomizados (OVX) in vivo, inibem a reabsorção óssea osteoclástica e estimulam a formação óssea osteoblástica4. Conseqüentemente, Li et al.12 descobriram que os grânulos GSK apresentam efeitos protetores ósseos em camundongos OVX, reforçando as atividades do receptor de cálcio para estimular a formação óssea. Para confirmar os efeitos protetores ósseos, bem como os efeitos farmacológicos de grânulos GSK, os autores aqui fornecem um procedimento detalhado para a preparação de soluções de trabalho e medicamentos (grânulo GSK)-contendo soro. Além disso, este artigo descreve a aplicação de grânulos de GSK em um modelo osteoporóticas OVX-induzido do rato e no soro Granule-contendo de GSK para in vitro osteoclastogenesis/osteoblastogenesis.

Os grânulos de GSK são compor de diversas ervas13,14 e podem completamente ser dissolvidos no soro fisiológico facilmente. Conseqüentemente, o soro fisiológico serve como o veículo. Camundongos Sham-operados (Sham) e camundongos OVX foram administrados o mesmo volume de soro fisiológico que os camundongos administrados por grânulos. As doses equivalentes de grânulos de GSK para o camundongo foram calculadas com base na equação de meeh-Rubner15. Esta equação não só tem a vantagem de obter dosagens seguras, mas também garante efeitos farmacológicos15. As três dosagens de grânulos de GSK foram geradas como a seguir: (1) GSKL: OVX + baixo-dose GSK grânulos, 2 g/kg/day. (2) GSKM: OVX + médio-dose GSK grânulos, 4 g/kg/dia. (3) GSKH: OVX + alta-dose GSK grânulos, 8 g/kg/dia. Camundongos nos grupos GSKL, GSKM e GSKH foram administrados em grânulos de GSK intragastricamente. O carbonato de cálcio (600 mg/comprimido) com vitamina D3 (125 unidade/comprimido internacional), por exemplo, em um produto maduro e comercializado (por exemplo, Caltrate [CAL]) para o tratamento e prevenção da osteoporose, foi usado como um controle positivo.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram realizados com a aprovação do Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Xangai do TCM (SZY201604005).

1. preparação e administração da solução de trabalho da GSK

  1. Calcule as doses equivalentes de grânulos GSK para o mouse.
    1. Calcule a superfície do corpo com base na equação de meeh-Rubner15: superfície corporal = k x (peso corporal2/3)/1000, onde os valores de k são 10,6 para humanos e 9,1 para o mouse. Assumindo um peso corporal humano de 70 kg, então a superfície do corpo humano (m2) = 10,6 x (702/3)/1000 = 1,8 m2. Assumindo um peso corporal de rato de 20 g (0, 2 kg; por exemplo, 1 mês de idade, fêmea, C57/BL6), em seguida, a superfície do corpo do mouse (m2) = 9,1 x (0, 22/3)/1000 = 0, 67 m2.
    2. Com base na superfície do corpo calculado, calcule a relação de transformação do corpo para humanos e mouse. Humano: 70 kg/1,8 m2 = 39. Rato: 0, 2 kg/0.0067 m2 = 3. Grânulo GSK = 20 g/70 kg x 39/3 = 3,72 g/kg ≈ 4 g/kg.
    3. Com base em um peso corporal de 20 g por rato, calcule a dosagem equivalente para o rato: 4 g/kg x 0, 2 kg = 0, 8 g.
    4. Calcule três doses equivalentes de grânulos de GSK com base em 20 camundongos por grupo e uma intervenção com duração de 3 meses (90 dias): (1) GSKL (OVX + baixo-dose GSK grânulos [2 g/kg/dia]): 0, 4 g mouse/dia x 20 camundongos x 90 dias = 72 g. (2) GSKM (OVX + médio-dose GSK grânulos [4 g/kg/ dia]): 0, 8 g mouse/dia x 20 camundongos x 90 dias = 144 g. (3) GSKH (OVX + alta-dose GSK grânulos [8 g/kg/dia]): 0,12 g mouse/dia x 20 camundongos x 90 dias = 216 g.
      Nota: Prepare um adicional de 20% de grânulos GSK na prática para compensar a perda.
  2. Calcule o volume de grânulo GSK por rato com base no peso corporal15: por exemplo, volume (V) = 0,24 ml/mouse/dia.
    Nota: o volume para a administração intragástrico para o rato é 0,12 ml/10 g.
  3. Pesar 10-dias ' valor de três doses de GSK grânulos. Pesar 8 g, 16 g, e 24 g de grânulos de GSK e servir como GSKL, GSKM, e GSKH, respectivamente.
  4. Calcule a dose equivalente de carbonato de cálcio com vitamina D3 (CAL) para o rato com base na equação de meeh-Rubner15 como nos passos 1.1.1 e 1.1.2: dosagem de Cal = 2 comprimidos/70 kg x 39/3 = 0,372 comprimido/kg ≈ 0,4 comprimido/kg.
  5. Com base em um peso corporal de 20 g por mouse (por exemplo, 1 mês de idade, feminino, C57/BL6), calcule a dosagem equivalente de CAL para mouse: 0,4 comprimido/kg x 0, 2 kg = 0, 8 comprimido. Em seguida, calcule a dose equivalente de CAL com base em 20 camundongos por grupo e uma intervenção com duração de 3 meses (90 dias): 0, 8 comprimido x 20 x 90 = 14,4 comprimidos. Pesar 10 dias de CAL (1,6 comprimidos).
  6. Dissolução
    1. Colocar 8 g de grânulos GSK num tubo de 50 mL. Adicionar 48 mL de soro fisiológico e agitar o tubo para dissolver completamente.
      Nota: o padrão para a dissolução completa é a ausência de sedimentos. A dissolução completa pode mais ser confirmada se uma agulha do gavagem puder elaborar a solução de trabalho e expeli-la então lisamente.
    2. Repita o passo 1.5.1 com 16 g e 24 g de grânulos GSK.
    3. Coloque 1,6 comprimidos (10 dias de valor) de CAL em um tubo de 50 mL. Adicionar 48 mL de soro fisiológico e agitar o tubo para dissolver completamente.
      Nota: as soluções de trabalho podem ser armazenadas a-4 ° c e preparadas a cada 10 dias.
  7. Administração intragastric
    1. Segure a parte de trás do mouse (1 mês de idade, fêmea, C57/BL6) com o mouse voltado para a frente e certifique-se de que ele permaneça firme nessa posição. Mantenha o rato calmo durante 2 − 3 minutos antes da administração.
      Nota: Certifique-se de que o pesquisador pode ver claramente a frente do mouse. Use luvas para evitar picadas de rato, especialmente para novos pesquisadores.
    2. Coloque a agulha de gavagem (tamanho: #12, 40 mm) na solução de trabalho de grânulos GSK e desenhe 0,24 mL da solução de trabalho.
    3. Põr a agulha do gavagem no rato através de um lado de sua boca até que a agulha do gavagem alcangue o estômago.
      Nota: para confirmar a agulha de gavagem atingiu o estômago: (1) a agulha de gavagem encontra a sensação de resistência. Enquanto isso, o mouse mostra a ação de engolir antes da agulha gavagem passa o estreitamento físico do esôfago. (2) injete aproximadamente 0,5 mL da solução de trabalho no rato e aguarde 1 min. Se não houver nenhuma solução saindo do mouse, isso significa que a agulha de gavagem atingiu o estômago.
    4. Injete a solução de trabalho do grânulo de GSK (0,24 mL/mouse) no estômago e extraia então a agulha do gavagem. Devolva o mouse para a gaiola.
    5. Repita o passo 1.6.4 com a solução CAL e injete 0,24 mL de solução de CAL por rato.
      Nota: o volume de solução CAL é calculado como no passo 1,2.

2. Micro-CT digitalização

  1. T Ibia colheita e preparação
    1. Intraperitoneally anestesiam o rato com 300 mL/100 g de 80 mg/kg de cetamina no dia seguinte à intervenção do dia 90. Use uma pitada de agulha dos dedos do pé para confirmar se o mouse está completamente anestesiado. Nenhuma resposta indica a anestesia bem sucedida. Em seguida, matar o mouse com luxação cervical.
    2. Fixe o rato com os braços e as pernas na espuma com tachas.
    3. Cortar a pele com tesouras (tamanho: 8,5 cm) e pinças (tamanho: 10 cm) das pernas da extremidade proximal para a distal e depois colher Tibias.
    4. Imediatamente colocar o tíbias em 70% álcool etílico e lavar por 3 vezes.
  2. Enrole a tíbia esquerda do mouse com espuma de esponja e colocá-lo em um tubo de amostra (35 mm de diâmetro, 140 mm de comprimento).
    Nota: o eixo longo da amostra deve ser junto com o do tubo de amostragem. Assegure a extremidade proximal dos pontos da tíbia para cima.
  3. Executando o micro-CT 80 Scan Machine
    1. Inicie a máquina de digitalização Micro-CT 80 à temperatura ambiente.
    2. Ajuste o tubo de amostra no micro-CT 80 e comece a varredura da seção transversal com os seguintes parâmetros da exploração: tamanho do pixel 15,6 μm, tensão 55 kV do tubo, corrente 72 μA do tubo, tempo da integração 200 MS, μm da definição espacial 15,6, μm da definição do pixel, e matriz da imagem 2048 x 2048.
      Nota: o osso esponjoso distingue-se do osso cortical através da pré-digitalização. A área de varredura da tíbia é definida como a área óssea esponjoso de 5 mm abaixo do planalto tibial até a extremidade distal.
  4. Quantificação do parâmetro ósseo
    1. Depois de concluir a digitalização de seção transversal, obtenha as imagens das tíbias esquerdas.
    2. Ajuste o limiar de densidade a 245 − 1000. Use o programa de avaliação micro-TC V 6.6 para medir os seguintes parâmetros ósseos: densidades minerais ósseas (DMO), volume ósseo sobre volume total (BV/TV), número ósseo trabecular (TB. N), espessura óssea trabecular (Tb.Th), bem como separação óssea trabecular óssea ( TB. SP).

3. preparação do soro sanguíneo para experimentos in vitro

  1. Cálculo
    1. Baseado em um peso de corpo do rato de 0,2 quilogramas (1 mês velho, fêmea, Sprague-Dawley), calcule a dosagem do grânulo de GSK: dosagem humana/dia x peso corporal do peso humano de x K/Body do rato = 20 g/70 quilogramas/dia x 70 quilogramas x K (K = 0, 18)/0,2 quilogramas = 2 g/kg/day
      Nota: K é o coeficiente de transformação farmacológica entre o humano e o rato15 (k = 0, 18).
    2. Repita a etapa 3.1.1 e calcule as seguintes dosagens.
      1. Calcule a dosagem de GSKL: 10 g/70 kg/dia x 70 kg x K/0.2 kg = 1 g/kg/dia.
      2. Calcule a dosagem de GSKM: 20 g/70 kg/dia x 70 kg x K/0.2 kg = 2 g/kg/dia.
      3. Calcule a dosagem de GSKL: 40 g/70 kg/dia x 70 kg x K/0.2 kg = 4 g/kg/dia.
      4. Calcular dosagem de CAL: 2 comprimidos/70 kg/dia x 70 kg x K/0,2 kg = 0,2 comprimido/kg/dia.
    3. Calcule a dosagem total de grânulo de GSK e CAL.
      1. Calcule a dosagem total para GSKL: 1 g/kg/dia x 0,2 kg x 6 ratos x 3 dias = 3,6 g.
      2. Calcule a dosagem total para GSKM: 2 g/kg/dia x 0,2 kg x 6 ratos x 3 dias = 7,2 g.
      3. Calcule a dosagem total para GSKH: 4 g/kg/dia x 0,2 kg x 6 ratos x 3 dias = 14,4 g.
      4. Calcule a dosagem de CAL = 0,2 comprimido/kg/dia x 0,2 kg x 6 ratos x 3 dias = 0,72 comprimido.
        Nota: um total de 10 mL de soro contendo Granule GSK é necessário para preparar 100 mL de meio de cultura (20% GSK Granule contendo soro). Espera-se que cada rato (6 ratos/grupo) forneça 1,5 − 2 mL de soro contendo Granule GSK após a centrifugação.
    4. Calcule o volume de grânulos GSK aplicados por rato com base no peso corporal15: por exemplo, volume (V) = 2 ml/Rat/dia.
      Nota: o volume para administração intragástrica para rato é 0,1 mL/10 g.
  2. Pesar 3-days ' valor de três doses de GSK grânulos. Pesar 3,6 g, 7,2 g, e 14,4 g de grânulos de GSK e servir como GSKL, GSKM, e GSKH, respectivamente. Pesar 0,72 comprimido para o grupo CAL.
  3. Colocar 7,2 g de grânulos GSK num tubo de 50 mL. Adicionar 36 mL de soro fisiológico e agitar o tubo para dissolver completamente. Repita isto com 3,6 g e 14,4 g de grânulos de GSK.
  4. Repita a secção 1,6 para administração intragástrica com 2 mL de solução de trabalho GSK.
    Nota: administrar o mesmo volume de solução salina (2 mL por rato) para preparar o soro e serve como um grupo de controle em branco para ensaios in vitro.
  5. Preparação do soro contendo GSK
    1. Intraperitoneally anestesiar os ratos com 300 mL/100 g de 80 mg/kg de cetamina 1 h após a última administração de grânulos de GSK. Use uma pitada de agulha dos dedos do pé para confirmar se o rato está completamente anestesiado. Nenhuma resposta indica a anestesia bem sucedida.
    2. Expor o abdômen para a parte inferior do tórax de ratos usando tesoura de operação reta depois de incisão a pele e peritoneum.
      Nota: o instrumento cirúrgico deve ser esterilizado a altas temperaturas e altas pressões antes do uso. A área cirúrgica deve ser esterilizada com 70% de etanol durante a coleta de sangue.
    3. Retire o tecido conjuntivo da aorta abdominal com papel tissue para expor o vaso claramente.
    4. Extraia o sangue da aorta abdominal usando uma seringa de 10 mL, 22 G. Em seguida, retire a agulha e transfira o sangue para um tubo estéril de 15 mL. Geralmente, 6 − 8 mL de sangue podem ser obtidos de um rato.
      Nota: cada rato deve ser mantido vivendo quando se desenha sangue. Um indicador é que a aorta abdominal pulsa quando o rato está vivo. O rato está morto após a tração do sangue.
    5. Mantenha o tubo ereto à temperatura ambiente durante 30 − 60 min até que o sangue esteja coagulado no tubo. Em seguida, centrifugue o tubo a 500 − 600 x g durante 20 min. Transfira todo o sobrenadante (soro) de um grupo (6 ratos) para 1 50 ml de tubo estéril e agitar para misturar.
    6. Inative o soro incubando em um banho de água de 56 ° c por 30 minutos. Filtre o soro usando um filtro hidrofílico de seringa de polietersulfona de 0,22-μm-pore-size. Armazene em-80 ° c para o uso a longo prazo (menos de 1 ano).
      Nota: o soro filtrado pode ser utilizado para osteoclastogênese in vitro e osteoblastogênese.
  6. Aplicativo
    1. Osteoclastogênese in vitro
      1. Diluir as três dosagens do soro contendo GSK (GSKL, GSKM, GSKH) na proporção de 1:4 com o meio de águia mínimo (α-MEM) contendo L-glutamina, ribonucleosídeos e desoxiribonucleosídeos.
        Nota: Assegure-se de que a concentração final de soro contendo GSK para osteoclastogênese in vitro e osteoblastogênese é de 20%.
      2. Adicione o soro contendo GSK diluído (200 μL/poço) da etapa 3.6.1.1 aos macrófagos da medula óssea (BMMs) dos camundongos C57BL/6 velhos de 4 − 6 semanas para a osteoclastogênese e estimule BMMs com fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF, 10 ng/mL) e ativador de receptores para o ligante do fator-κB nuclear (RANKL, 100 ng/mL) como descrito previamente2.
    2. Osteoblastogênese in vitro
      1. Repita a etapa 3.6.1.1.
      2. Adicione o soro contendo GSK diluído (2 ml/poço) às pilhas de haste mesenquimais do osso (bmscs) dos ratos C57Bl/6 velhos da semana 4 − 6 para gerar o osteoblástica como descrito previamente16.

Resultados

Os resultados da varredura do Micro-CT indicaram que os ratos de OVX mostraram a perda óssea significativa comparada aos ratos do controle salino (Figura 1a). A intervenção (90 dias) dos grânulos de GSK aumentou grandemente a DMO, particularmente no grupo GSKM (Figura 1b). Os parâmetros da estrutura óssea, como DMO, BV/TV, TB. N e Tb.Th, foram quantificados. Os tratamentos de grânulos GSK levaram ao aumento da DMO, BV/TV, ...

Discussão

Os grânulos de agentes de TCM tornaram-se uma das escolhas comuns para formulações ou prescrições. GSK grânulos são compostos de vários medicamentos fitoterápicos com base em experiências clínicas ou a teoria TCM, e eles exercem melhores efeitos curativos com menos efeitos colaterais4. Comparado com a decocção da água, os grânulo têm estas vantagens: bom gosto, conveniência da entrega, armazenamento a longo prazo, protocolo padrão e efeitos curativos consistentes, assim como uma ...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de ciências naturais da China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 e 81330085), o programa de equipe inovadora, Ministério da ciência e tecnologia da China (2015RA4002 para WYJ), o programa para Equipe inovativa, Ministry da instrução de China (IRT1270 a WYJ), centro médico de Shanghai TCM da doença crônica (2017ZZ01010 a WYJ), três anos de ação para acelerar o desenvolvimento do plano tradicional da medicina chinesa (ZY (2018-2020)-CCCX-3003 a WYJ), e projetos de desenvolvimento de pesquisa-chave nacionais (2018YFC1704302).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
α-MEMHyclone
laboratories		SH30265.018For cell culture
β-GlycerophosphateSigmaG5422Osteoblastogenesis
Caltrate (CAL)WyethL96625Animal interventation
C57BL/6 miceSLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		RandomAinimal preparation
DexamethsomeSigmaD4902
Dimethyl sulfoxideSigmaD2438Cell frozen
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)Sangon Biotech60-00-4Samples treatmnet
Fetal bovine serumGibcoFL-24562For cell culture
Gushukang granuleskangcheng companyin chinaZ20003255Herbal prescription
Light microscopeOlympus BX50Olympus BX50Images for osteoclastogenesis
L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrateSigmaA8960-5GOsteoblastogenesis
MicroscopeLeicaDMI300BOsteocast and osteoblast imagine
M-CSFPeprotechAF-300-25-10Osteoclastogenesis
Μicro-CTScanco
Medical AG		μCT80 radiograph microtomographBone Structural analsysis
RANKLPeprotech11682-HNCHFOsteoclastogenesis
Sprague DawleySLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		RandomBlood serum collection
Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) KitSigma-Aldrich387A-1KTTRAP staining

Referências

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