达尼奥胚胎发生过程中的上眼硫可视化

摘要

在这里, 我们提出了一系列标准化的协议, 以观察上眼沟, 最近确定的, 进化保存的结构在脊椎动物的眼睛。利用斑马鱼幼虫, 我们展示了必要的技术, 以确定有助于形成和关闭的上眼沟的因素。

摘要

先天性眼结肠瘤是一种遗传性疾病, 通常被观察为眼睛下部的裂隙, 其原因是不完全的脉络膜裂隙闭合。最近, 在虹膜、视网膜和晶状体的上侧识别有结肠瘤的个体, 发现了一种新的结构, 称为上裂隙或上眼沟 (SOS), 这种结构是暂时存在于背侧的在脊椎动物眼睛发育过程中的视杯方面。虽然这种结构是在小鼠、小鸡、鱼和纽特之间保存的, 但我们目前对 SOS 的理解是有限的。为了阐明有助于其形成和关闭的因素, 必须能够观察到它, 并查明异常情况, 例如在关闭 SOS 方面的延误。在这里, 我们着手创建一系列标准化的协议, 可用于通过将广泛使用的显微镜技术与免疫荧光染色和 mRNA 等常见的分子生物学技术相结合, 有效地可视化 SOS表达。虽然这一组协议侧重于观察 sos 闭包延迟的能力, 但它能适应实验者的需要, 可以很容易地修改。总的来说, 我们希望创造一种平易近人的方法, 通过这种方法, 我们可以提高对 sos 的理解, 以扩大目前对脊椎动物眼睛发育的了解。

引言

脊椎动物眼的形成是一个高度保守的过程, 在这个过程中, 精心编排的细胞间信号通路建立组织类型, 并指定区域身份¹。早期眼睛形态发生的扰动导致眼睛结构的深刻缺陷, 并经常致盲²。其中一种疾病是由于未能关闭视神经杯³腹侧的脉络膜眼裂隙造成的。这种被称为眼结肠瘤的疾病, 估计发生在每4-5000个活产中的 1个, 并导致3-11 的儿科失明, 通常表现为一个关键孔状结构^,从眼睛中心的瞳孔下突出, ^5,6。脉络膜裂隙的功能是为早期血管生长到光学杯中提供一个切入点, 之后裂隙的两侧将融合在血管7中.

虽然眼结节瘤自古以来就被人们所熟知, 但我们最近发现了一个新的结肠瘤患者的组织丢失的子集, 这些患者的组织丢失影响了眼睛的上背部。最近在我们的实验室的工作已经导致发现的眼睛结构斑马鱼背眼, 我们称之为上眼沟 (SOS) 或上裂隙⁸。需要注意的是, 该结构既有沟的特点, 也有裂缝的特点。类似于沟, 它是一个连续的组织层, 跨越鼻腔到颞部视网膜。此外, 结构的闭合不是由两个相对基底膜的融合介导的, 它似乎需要一个形态发生过程, 通过这个过程, 结构是由细胞填充的。然而, 类似于裂缝, 它形成了一个结构, 分离鼻腔和时间两侧的背眼与基底膜。为了保持一致, 我们将在本文中将其称为 SOS。

SOS 在进化上在脊椎动物中被保守, 在鱼类、小鸡、牛顿和小鼠⁸的眼睛形态发生过程中可见。与斑马鱼受精后20-60小时的脉络膜裂隙不同, SOS 是高度瞬态的, 从 20-60 hpf 很容易看到, 而在 26 hpf⁸时不存在。我们实验室最近的研究发现, 与脉络膜裂隙类似, sos 在眼睛形态发生过程中的血管引导^中起着一定的作用。尽管控制 SOS 形成和闭合的因素尚未完全了解, 但我们的数据确实突出了背腹眼模式基因⁸的作用。

斑马鱼是研究 SOS 的优良模型生物。作为一个模型系统, 它为研究眼睛发育提供了许多优势: 它是一个脊椎动物模型;每一代表现出较高的繁殖力 (~ 200个胚胎);它的基因组已被完全测序, 这有利于基因操纵;约70% 的人类基因至少有一种斑马鱼的同源物, 使其成为人类疾病^{9,10 的}理想基因模型。最重要的是, 它的发育发生在母亲的外部, 它的幼虫是透明的, 这使得它可以相对容易地显示发育中的眼睛11。

在这一组协议中, 我们描述了在斑马鱼幼虫中可视化 SOS 的技术。本报告中使用的各种可视化技术将使人们能够在正常的眼睛发育过程中清楚地观察 SOS, 并能够检测 SOS 闭合缺陷。我们的示例协议将以 Gdf6 的调查为特色, BMP 本地化为背眼和已知的 SOS 闭合调节器。此外, 这些技术可以与实验操作相结合, 以确定影响适当的 SOS 形成和关闭的遗传因素或药理作用剂。此外, 我们还包括了一个协议, 通过该协议可以对所有细胞膜进行荧光成像, 使实验者能够观察 SOS 周围细胞的形态变化。我们的目标是建立一套标准化的协议, 可以在整个科学界使用, 为这种新的发展眼结构提供新的见解。

研究方案

这里描述的所有方法都得到了阿尔伯塔大学动物护理和使用委员会的批准。

1. 议定书 1: 使用立体显微镜和差分干涉对比成像显示 SOS

1. 胚胎采集
   1. 在一罐无氯水中, 在晚上将雄性斑马鱼与雌性斑马鱼配对, 准备好gdf6a^+/ 斑马鱼的十字架。一定要使用分隔器将雄性和雌性分开, 以确保胚胎在很短的时间内出生。
   2. 第二天早上, 拉起分隔线, 让斑马鱼繁殖时间不超过 30分钟. 用《斑马鱼书¹²》中描述的 e3 培养基收集 petri 培养皿中的胚胎, 并将它们放置在28.5°c 的孵化器中。
   3. 除去任何未受精的卵子或死去的胚胎, 它们会出现白色和不透明的情况。
2. 斑马鱼胚胎的制备及活体成像
   1. 在 20 hpf 时, 将 E3 介质替换为含有 0.004% 1 苯基 2-硫脲 (PTU) 的 E3 介质, 以防止颜料生产。
      注: 在稍晚的时间点 (如 22-24 hpf) 添加 PTU 不太可能干扰实验, 因为在成像时胚胎很早就进入。然而, 建议尽早治疗胚胎, 以完全防止色素沉着, 因为有一个色素沉着带出现在背眼, 这可能会干扰 SOS 的成像。
   2. 确保所有胚胎在观察前的各个阶段处于正确的发育阶段。建议在金梅尔等人13所概述的明显可见的阶段这样做.删除那些发育不成熟的。
   3. 将胚胎置于解剖显微镜下, 用细钳轻轻将绒毛膜拉开, 使胚胎分离。想象背眼中的 SOS。SOS 可能在眼睛的背侧边缘显示为压痕, 在背眼上应该可以看到一条线。对于正常的 SOS 闭合, 观察 20-23 hpf 处的胚胎。对于延迟 SOS 闭合表型的检查, 观察 28 hpf 或更高版本的胚胎。
   4. 对显示 sos 闭合延迟的胚胎进行分类。
   5. 要使用解剖显微镜拍摄这些胚胎, 请准备一个在 E3 中含有1% 琼脂糖的培养皿。轻轻刺刺琼脂糖的中心, 形成一个浅孔, 当胚胎被放置在琼脂糖上时, 胚胎的蛋黄可以坐在这个洞中。这将确保胚胎在被拍照时不会处于斜角。
   6. 在 E3 中对0.003% 的滴虫胚胎进行麻醉, 并侧向放置在琼脂糖上。
   7. 为了使用复合或共聚焦显微镜对胚胎进行成像, 将胚胎转移到35毫米的 Petri 培养皿中, 其中含有 e3 (w/v) 中1% 低熔点琼脂的小孔。使用细鱼线或睫毛快速将胚胎侧向定位, 等待琼脂糖冷却。一旦琼脂糖牢固, 就把足够的 E3 倒进盘子里, 以覆盖琼脂糖。有关详细信息, 请参阅 Distel 和 Köster¹⁴。
      注: 如果使用倒置显微镜, 胚胎可以放在玻璃覆盖底盘的玻璃上, 并用标准的20X 物镜成像。
   8. 使用水浸20x 物镜, 用复合显微镜可视化 sos。在可视化之后, 轻轻地从胚胎中提取琼脂糖, 并将其固定在4% 的甲醛 (PFA) 中, 或允许它们继续发育。

2. 第2议定书: 层压蛋白全安装免疫荧光染色

1. 层压蛋白全安装免疫荧光染色: 第1天
   1. 如步骤1.2.3 中所述, 如果尚未这样做, 则可将胚胎描述出来。在室温 (22-25) 振动台上, 将胚胎固定在所需时间点的新制作的 4% PFA 中2小时。在 1x PBST 中清洗 5分钟, 4次。
      注: 排卵后, 胚胎在分离后可能会固定得更好。
   2. 在室温下对 10个 mgml 蛋白酶 K 的渗透, 5分钟, 孵化时间将取决于胚胎固定的发育阶段 (见 Thisse 和 Thisse¹⁵)。
   3. 在 1x PBST 中清洗 5分钟, 4次。
   4. 在室温振荡器上, 将5% 山羊血清和2mgml 牛血清白蛋白 (BSA) 溶液中的胚胎块在1-2小时内。
   5. 在1:200 稀释的情况下, 通过稀释块状溶液中的兔抗层压蛋白抗体制备初级抗体溶液。
   6. 在4°C 的振动台上, 在抗层压素原代抗体中隔夜培养胚胎。
2. 层压蛋白全安装免疫荧光染色: 第2天
   1. 在 1x PBST 中清洗 15分钟, 5次。
   2. 在 1x PBST 中稀释山羊抗兔亚历克莎 Flor 488 抗体, 使其稀释 1:1000, 制备二级抗体溶液。
      注: 通过使用不同的二级抗体, 可以调整此步骤以适应实验者可用的资源。
   3. 在4°C 的振动台上将胚胎在二级抗体中培养一夜。从这一步开始, 尽可能远离光线。
   4. 在 1x PBST 中清洗 15分钟, 4次。如有必要, 胚胎可在4°c 下保存长达一周。
3. 胚胎眼睛的解剖和安装
   1. 如果需要, 将胚胎放入一个小的培养皿中, 并将胚胎变黄在 1x PBST 中。要做到这一点, 可以用细钳轻轻扰乱蛋黄, 并通过温和刮蛋黄囊来去除蛋黄细胞。
   2. 在微型离心管中制备以下浓度的 Pbs-甘油系列溶液: PBS 中的30%、50% 和70% 甘油。将胚胎转化为30% 的甘油 pbs, 确保将胚胎置于溶液的顶部, 并尽可能地减少先前溶液的转移。等待胚胎沉入试管底部。
   3. 当胚胎沉入底部时, 将其转移到50% 甘油 pbs。重复并转移到70% 甘油/pbs。
   4. 一旦胚胎沉入70% 的甘油 pbs 中, 将它们转移到一个小塑料盘中进行解剖。
   5. 将胚胎后部的后脑, 并使用后组织进行基因分型, 如有必要。
   6. 将头部移动到玻璃滑梯上, 转移尽可能小的甘油。使用钳子或其他精细的解剖工具, 以保持后端, 以保持头部静止。使用一个精细的薄荷别针或其他精细的解剖工具, 轻轻地插入前脑室从前面, 并向下推分离头部的左右半部分彼此。重复这一点, 同时在中脑和后脑脑室向后移动, 实质上是将头部从中线压下来。这最大限度地减少了对眼睛和周围组织的手动操作, 从而使 SOS 不受损害。
   7. 将头部的每一侧都安装在中线以下, 向上看。在角落放置四个真空润滑脂柱 (使用的盖板的适当距离), 并用玻璃盖板覆盖, 按顺序向下推每个岗位, 直到盖板与样品接触。移液器70% 甘油在盖板的边缘, 使甘油被拉到下面, 填补了盖板和滑块之间的空间。
   8. 图像样品在一天内, 或密封周围的盖板与指甲油和图像样品, 只有在指甲油干燥。在4°C 的黑暗中存放。

3. 协议 3:使用 Egfp-caax mrna 可视化 sos

1. eGFP-CAAX mRNA 的合成
   1. 在37°c 下, 用 Noi 对1毫克的 Pcs2-efp-caax 质^{粒 16}进行连续4次。
   2. 为停止限制性消化反应, 加入10毫升无 rnase 水、2.5 mL 10% SDS 和 2.0 ml 10 Mg/ml 蛋白酶 k。
   3. 在50°c 下孵化1小时。
   4. 在反应中加入以下内容 (总体积为200毫升), 然后继续下一步:50 mL Rnase-nase-wl 水、20 Ml 3 m 醋酸钠 ph 值5.2 和 75.5 mL Rnase 水
      注: 在两个不同的场合添加无 rnase 的水, 以防止醋酸钠过度稀释。
2. 表热氯仿提取和乙醇沉淀纯化 DNA
   1. 加入200毫升苯酚: 氯仿: 异戊醇和涡流为 20秒. 通过离心分离水和有机相, 在 18, 000 x g, 5分钟。
   2. 将上水层转移到新的微离心管, 确保避免底层有机层的转移。在新管中加入等量的氯仿。
      注: 添加氯仿是可选的, 但建议确保从样品中完全去除苯酚。
   3. 涡流为 20秒, 通过 18, 000 x g 离心分离水相和有机相5分钟。
   4. 像以前一样, 将上水层转移到新的微离心管, 确保避免底层有机层的转移。
   5. 加入半体积的 3 m 醋酸钠 pH 值5.2。
   6. 通过添加3卷100% 不含 rnase 的乙醇和在-20°c 下冷却15分钟来沉淀 DNA, 在4°C 下, 以 18, 000 x g 离心20分钟。颗粒应该是可见的。欺骗上清液。
   7. 用100% 乙醇/无乙醇的水清洗颗粒。轻轻混合后, 打破颗粒松动, 离心机在 18, 000 x 克在4°C 下15分钟。颗粒应该是可见的。欺骗上清液。
   8. 将颗粒风干 5分钟, 并在7毫升水中重新悬浮 DNA。
      注: 颗粒可能需要干燥超过 5分钟, 具体取决于可使用的气流。
3. eGFP-CAAX mRNA 的转录和纯化
   1. 以不使用 rnase 的方式, 使用市售的 Sp6 RNA 聚合酶试剂盒, 使用在步骤3.2 中获得的约1毫克纯化的线性化质粒 DNA, 准备体外转录反应。在37°c 下孵化2小时。
      注: Sp6 RNA 聚合酶必须用于生产封顶的 mRNA。
   2. 加入1毫升的 Dnml (2 U/ml;不含 RNase), 并在37°c 下孵育30分钟。
   3. 使用任何市售的 RNA 纯化试剂盒纯化 mRNA。倾斜 mRNA, 以避免反复冻融, 并在-80°c 储存。
4. 注射和可视化
   1. 获得第1.1号议定书概述的胚胎。
   2. 使用微注射装置, 在1个细胞阶段注射 300 pg 的 eGFP-CAAX mRNA。
   3. 用荧光立体镜筛选胚胎, 在眼睛中具有 eGFP 的明亮表达。
   4. 按照第1.2号议定书所述对胚胎进行成像。
   5. 或者, 在室温下将胚胎在所需的时间点上固定 4小时, 或在4°C 过夜。如果以前没有清洗, 则在 1x PBST 中清洗胚胎 5分钟, 4次, 并进行 dechorionate。按照第2.3号议定书的规定, 在幻灯片上解剖眼睛并将其安装。

结果

斑马鱼 sos 出现在 20 hpf^在推定的背侧视网膜8。由 23 hpf sos 从它的最初的狭窄的建筑学转换到一个宽广的缩进和由 26 hpf 它不再是可看见^{的 8}。因此, 要检查正常斑马鱼眼睛发育过程中的 SOS, 必须在 20-23 hpf 之间观察胚胎。在此期间, 通过解剖显微镜和 DIC 成像可以观察到 sos, 它是将发育中视网膜的鼻腔和颞半分开的背眼的一条细线 (

讨论

在这里, 我们提出了一系列标准化的方案, 以观察 sos 在发展斑马鱼胚胎。为了确定闭合延迟表型, 我们的协议侧重于区分眼睛背鼻和背时间两侧两个离散裂片的分离能力, 类似于用于显示脉络膜裂隙闭合延迟的技术腹侧眼的表型。

这些可视化技术可与各种基因操作技术结合使用, 以研究抑制某些基因表达或诱导表达的影响, 从而研究它们在 SOS 闭合中的作用。我们选择使用gdf...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea	Sigma Aldrich	P7629-10G
100 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713
35 mm Petri dish	Corning	CLS430588
Agarose	BioShop Canada Inc.	AGA001.1
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
DIC/Fluorescence microscope	Zeiss	AxioImager Z1
Dissection microscope	Olympus	SZX12
Dissection microscope camera	Qimaging	MicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning High-vacuum grease	Fisher Scientific	14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma Aldrich	A5040-25G
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Image capture software	Zeiss	ZEN
Incubator	VWR	Model 1545
Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Minutien pin	Fine Science Tools	26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2	Fisher Scientific	BP1752-100
Proteinase K	Sigma Aldrich	P4850
Rabbit anti-laminin antibody	Millipore Sigma	L9393
TURBO Dnase (2 U/µL)	Invitrogen	AM2238
Ultrapure low-melting point agarose	Invitrogen	16520-100
UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Invitrogen	15525017