Danio rerio Embryogenesis 동안 우수한 눈 고 랑의 시각화

요약

여기, 우리 제시 우수한 눈 고 랑을 관찰 하는 프로토콜의 표준화 된 시리즈 척추 눈에서 최근 발견, 진화론 보존 구조. Zebrafish 애벌레를 사용 하 여, 형성 및 우수한 눈 고 랑의 폐쇄에 기여 하는 요소를 식별 하는 데 필요한 기술을 설명 합니다.

초록

선 천 성 안구 coloboma 불완전 한 맥락 막 게 폐쇄에서 발생 하는 눈의 열 등 한 측면에서 분열으로 일반적으로 관찰 되는 유전 질환 이다. 최근, 홍 채, 망막, 및 비 발한 구조의 발견에 지도 하는 렌즈의 우수한 측면에서 coloboma 개인의 식별 이라고 뛰어난 균열 또는 우수한 눈 고 랑 (SOS)는 지 느 러 미에 뚜렷이 존재 하는 척추 동물 눈 개발 시 컵의 측면. 이 구조는 쥐, 병아리, 물고기, 그리고 영원에 걸쳐 보존은, 비록 SOS의 우리의 현재 이해는 제한 됩니다. 그것의 형성 및 폐쇄에 기여 하는 요인, 명료 하 게 하기 위해 그것을 관찰 하 고 이상이, SOS의 폐쇄에 지연 등 식별 수 필수적입니다. 여기, 우리 immunofluorescent 얼룩 및 mRNA와 같은 일반적인 분자 생물학 기술로 널리 현미경 기술을 결합 하 여 SOS를 효율적으로 시각화를 사용할 수 있는 프로토콜의 표준화 된 시리즈를 만들 밖으로 설정 overexpression입니다. 프로토콜의이 세트는 SOS 폐쇄 지연 관찰 하는 능력에 초점을 맞추고, 하는 동안 실험의 요구에 적응할 수 있는 하 고 쉽게 수정할 수 있습니다. 전반적으로, 친근 한 메서드는 SOS의 우리의 이해 척추 눈 개발의 현재 지식을 확장을 고급 수를 만드는 노력 하겠습니다.

서문

척추 동물 눈의 형성 과정이 매우 보존는 신중 하 게 조율 된 세포 신호 경로 조직 유형을 설정 하 고 지정 지역 정체성¹. 초기 눈 morphogenesis 하 섭 눈의 아키텍처를 깊은 결함 귀착되 고²눈부신 자주 있다. 같은 하나의 질병 시 컵³의 복 부 측에 맥락 막 눈 균열을 실패에서 유래한 다. 눈 coloboma로 알려진이 장애 4-5000 라이브 출생 및 일반적으로 inferiorly 눈^{4의 중심에 있는 눈동자에서 돌출 하는 열쇠 구멍 모양의 구조로 만들어 낸 소아 실명의 원인 3-11 %1 발생 추정 5,6}. 맥락 막 균열의 기능은 후는 균열의 측면 혈관⁷을 묶는 데 융합 것입니다 시 컵에 성장 초기 맥 관 구조에 대 한 진입점을 제공 하는 것 이다.

눈 coloboma은 고 대부터 알려져 왔다, 하는 동안 우리가 최근 눈의 우수한/등 쪽 측면에 영향을 미치는 조직 손실 coloboma 환자의 소설 부분 집합을 확인 했습니다. 우리 실험실에서 최근 작품 지칭 우수한 눈 고 랑 (SOS) 또는 뛰어난 균열⁸zebrafish 등 눈에는 눈 구조의 발견을 주도하 고 있다. 구조는 고 랑과는 균열의 특성은 중요 하다. 한 고 랑 마찬가지로 그것은 비음에서 일시적인 망막에 걸쳐 지속적인 조직 계층입니다. 또한, 구조의 폐쇄는 반대 하는 지하실 막, 2의 융합에 의해 중재 하지 고 전체적 프로세스는 구조는 세포에 의해 채워집니다를 나타납니다. 그러나,는 게와 마찬가지로, 그것은 지하실 막 등 눈의 비 강 및 시간적 측면을 구분 하는 구조 형성. 일관성을 위해 우리는 참조할 SOS로이 텍스트에서.

SOS는 진화론 척추 동물, 물고기, 병아리, 영원, 및 마우스⁸눈 morphogenesis 동안 표시 되 고에서 보존 됩니다. Zebrafish에 20-60 시간 후 수정 (hpf)에서 존재 하는 맥락 막 게 달리 SOS 매우 과도 20-23 hpf에서 쉽게 볼 수 되 고 결 석 26 hpf⁸. 우리 실험실에서 최근 연구는, 비슷한 맥락 막 균열, SOS 역할 눈 morphogenesis⁸동안 혈관 가이드에 발견 했다. 형성 및 SOS의 폐쇄를 제어 하는 요소는 아직 완전히 이해 되지 않습니다, 하지만 우리의 데이터 패턴화 유전자⁸등 복 부 눈에 대 한 역할 강조 했다.

Zebrafish는 SOS를 공부 하는 우수한 모델 생물 이다. 모델 시스템으로 공부 눈 개발에 장점을 제공 합니다: 그것은 척 추가 있는 모델; 각 세대 전시 높은 통치 (~ 200 배아); 그것의 게놈 완전 시퀀싱 된 유전자 조작;를 용이 하 게 그리고 인간의 유전자의 약 70% 이상의 zebrafish orthologue, 그것은 인간의 질병^9,10의 이상적인 유전학 기반 모델을 만드는. 가장 중요 한 것은, 그것의 개발 외부 어머니, 그리고 그것의 애벌레는 투명, 쉽게¹¹와 개발 눈의 시각화에 대 한 수 있습니다.

프로토콜의이 세트에서 우리는 SOS zebrafish 애벌레에 구상 될 수 있다 기술을 설명 합니다. 이 보고서에 사용 되는 시각화 기법의 다양 한 정상적인 눈 개발 하는 동안 SOS의 명확한 관측 뿐만 아니라 SOS 폐쇄 결함을 감지 하는 능력 수 있습니다. 우리의 예제에서는 프로토콜 Gdf6의 조사 기능을 한다는 BMP는 등 지역화 눈과 SOS 폐쇄의 알려진된 레 귤 레이 터. 또한, 이러한 기술은 유전적 요인 또는 약리 에이전트에 적절 한 조 난 신호 형성 및 폐쇄에 영향을 식별 하는 실험 조작 결합 될 수 있다. 또한, SOS를 주변 세포를 형태학 상 변화를 관찰 하는 실험을 수 있도록 프로토콜을 통해 모든 세포 막의 형광 이미징이 가능, 포함 시켰습니다. 우리의 목표는 개발 눈의이 소설 구조에 새로운 통찰력을 제공 하는 과학적 사회 전반에 걸쳐 사용할 수 있는 표준화 된 프로토콜의 집합을 설정 하는.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 앨버타 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 프로토콜 1: stereomicroscopy와 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 이미징 사용 하 여 SOS의 시각화

1. 배아 컬렉션
   1. Dechlorinated 물 탱크에서 여성 제 브라와 남성 zebrafish를 페어링 하 여 저녁에 gdf6a⁺ zebrafish의 십자가 준비 합니다. 배아는 시간의 작은 범위 내에서 태어난 되도록 구분선을 사용 하 여 여성에서 남성을 구분 해야 합니다.
   2. 다음 아침, 구분선을 끌어 E3 미디어, Zebrafish 책¹²에 설명 되어 있는 접시에 배아를 수집 하는 30 분 보다 더 이상에 대 한 번 식을 zebrafish를 허용 하 고 28.5 ° C 배양 기에 넣어.
   3. 모든 unfertilized 계란 또는 흰색과 불투명 나타납니다 죽은 태아를 제거 합니다.
2. 준비 및 zebrafish 태아의 라이브 영상
   1. 20 hpf, E3 미디어 0.004 %1-페 닐 2-thiourea (PTU) 안료 생산을 방지 하기 위해 포함 된 교체는 E3 미디어.
      참고: 22-24 hpf 같은 약간 나중 timepoint에 PTU의 추가 화상의 시간에는 배아의 초기 나이 실험을 방해할 가능성이 크다. 그러나, SOS의 이미징 방해할 수 있는 등 눈에 나타나는 색소의 밴드는 완전히 착 색을 방지 하기 위해 초기 배아를 치료 하는 것이 좋습니다.
   2. 모든 태아 관찰의 시간을 다양 한 지점에서 올바른 발달 단계에 있는지 확인 하십시오. 이 somite에 수는 명확 하 게 보이는 Kimmel 외.¹³에 의해 설명 하는 단계에서 이루어집니다 하는 것이 좋습니다. 그 발달 성숙 하지 않은 제거 합니다.
   3. 부드럽게 떨어져 chorion 미세 집게를 사용 하 여 당겨 해 현미경, 및 dechorionate에서 배아 배아를 놓습니다. 등 눈에 SOS를 시각화 합니다. SOS, 눈의 등 쪽 여백에서 들여쓰기로 나타날 수 있으며 선 지 눈에서에 표시 되어야 합니다. 일반 SOS 폐쇄에 대 한 주위에 배아 관찰 hpf 20-23. 지연된 SOS 폐쇄 고기 검사, 28에서 배아 관찰 hpf 이상.
   4. SOS 폐쇄 지연 하지 않는 보여 주는 배아를 정렬 합니다.
   5. 이러한 배아 해 현미경을 사용 하 여 사진, e 3에서 1 %agarose 포함 하는 배양 접시를 준비 합니다. 가볍게 태아의 노 른 자 태아는 agarose에 배치 되 면 앉을 수 있는 얕은 구멍 생성 하기 agarose의 중심을 찌 르 기. 이렇게 하면 태아 아니다는 것을 경사 각도에서 촬영 되 고 때.
   6. 배아는 agarose 옆에 e 3에 0.003 %tricaine anesthetize
   7. 35 mm 페 트리 접시 포함 gelled 비 1% 낮은 녹는 포인트 agarose e 3에서의 작은 bolus로 배아 배아 화합물 또는 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지를 전송 (w/v). 신속 하 게 옆으로 잘 낚 싯 줄 또는 속눈썹을 사용 하 여 태아를 놓고을 agarose를 기다립니다. agarose는 회사, 일단 충분 한 e 3는 agarose를 접시에 붓으십시오. 자세한 내용은 Distel 및 Köster¹⁴를 참조 하십시오.
      참고: 경우는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여, 태아 수 유리 coverslip 아래 접시의 유리에 대 한 배치 되며 X 객관적 렌즈 표준 20 군데.
   8. 물 침수 20 배 대물 렌즈를 사용 하 여 복합 현미경으로 SOS를 시각화. 시각화, 다음 부드럽게 당겨 배아에서 agarose 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 수정 또는 그들의 개발을 계속 하 허용.

2. 2 프로토콜: laminin의 전체-마운트 immunofluorescent 얼룩

1. 전체-마운트 immunofluorescent laminin의 얼룩: 1 일
   1. 단계에서 설명한 1.2.3, 완료 되지 않은 경우에 배아를 Dechorionate 갓 만든된 4%에서 원하는 timepoint에 microcentrifuge 튜브 배아 수정 PFA 실 온 (22-25 ° C) 통에 2 h. 1에서 세척 5 분, 4 회 x PBST.
      참고: gastrulation, 다음 배아 수를 해결할 더 나은 dechorionation 후.
   2. 5 분 보육 시간 배아는 고정 발달 단계에 따라 달라 집니다 대 한 실 온에서 10 mg/mL 가수분해 K에에서 배아를 permeabilize (Thisse 및 Thisse 참조¹⁵).
   3. 1에서 세척 5 분, 4 회 x PBST.
   4. 5% 염소 혈 청 및 2 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 실 온 통에 1-2 h에 대 한 1xPBST에서의 솔루션에 배아를 차단 합니다.
   5. 1: 200 희석에 블록 솔루션에서 토끼 안티 laminin 항 체를 희석 하 여 1 차적인 항 체 솔루션을 준비 합니다.
   6. 4 ° C 통에 하룻밤 안티 laminin 1 차 항 체에 태아를 품 어.
2. 전체-마운트 laminin의 immunofluorescent 얼룩이 지기: 주 2
   1. 1에서 세척 15 분, 5 번에 대 한 x PBST.
   2. 1에서 염소 안티 토끼 알 렉 사 Fluor 488 항 체를 diluting 하 여 이차 항 체 솔루션을 준비 1:1000의 희석을 x PBST.
      참고:이 단계는 다른 이차 항 체를 사용 하 여 사용할 수 있는 리소스는 실험에 맞게 적응 가능 하다.
   3. 4 ° C 통에 하룻밤 이차 항 체에 태아를 품 어. 앞으로이 단계에서 가능한 한 많은 빛에서 방패.
   4. 1에서 세척 15 분, 4 회 x PBST. 필요한 경우 최대 1 주일, 4 ° C에서 배아를 저장할 수 있습니다.
3. 해 부 및 미 발달 눈의 설치
   1. 원하는 경우 배아 작은 페 트리 접시에 놓고 1에서 배아 deyolk x PBST. 부드럽게 잘 집게와 노른자위를 방해 하 고 노 른 자 색의 가벼운 스크 통해 노 른 자 세포를 제거 하 여 이렇게 합니다.
   2. Microcentrifuge 튜브에서 PBS 글리세롤 시리즈 솔루션의 다음 농도 준비: PBS에서 30%, 50% 및 70% 글리세롤. 30% 글리세롤/PBS, 솔루션 및 가능한 이전 솔루션의 조금 전송 배아를 확인으로 배아를 전송 합니다. 튜브의 바닥에 침 몰 하기 위하여 배아를 기다립니다.
   3. 배아 바닥에 침 몰 할 때, 50% 글리세롤/PBS에 그들을 전송 합니다. 반복 하 고 70% 글리세롤/PBS에 전송.
   4. 일단 태아 70% 글리세롤/PBS에서 침 몰, 해에 대 한 작은 플라스틱 접시에 그들을 이동 합니다.
   5. 태아는 hindbrain에 후부를 베 고 필요한 경우 유전형, 후부 조직을 사용 합니다.
   6. 가능한 작은 글리세롤으로 전송 하는 유리 슬라이드에 머리를 이동 합니다. 집게 또는 다른 정밀한 해 부 도구를 사용 하 여 유지 하는 고정 후부 끝에 개최. 좋은 minutien 핀 또는 다른 정밀한 해 부 도구를 사용 하 여 부드럽게는 앞쪽에서 개 심 실에 삽입 하 고 서로 머리의 오른쪽과 왼쪽 반쪽을 아래로 밀어. 이동 하면서 뒤로 midbrain를 hindbrain 심 실에 기본적으로 중간 선 아래로 머리를 fileting 이것을 반복 합니다. 눈 및 그로 인하여 손상 되지 않은 SOS을 떠나 주변 조직의 수동 조작을 최소화 됩니다.
   7. 위로 아래로, 눈 머리 중간의 각 측면을 탑재 합니다. 위치 4 모서리 (적절 한 거리를 사용 하는 coverslip 떨어져)에서 진공 그리스의 게시물 및 유리 coverslip 커버, 예제와 함께 접촉 하 게 아래로 밀어 순차적으로 각 게시물에는 coverslip까지. 플라스틱 70% 글리세롤은 coverslip의 가장자리에는 글리세롤은 coverslip 슬라이드 사이의 공간을 채우고, 아래 가져온 있도록.
   8. 하루, 또는 매니큐어와 이미지 샘플 매니큐어 건조 했다 후에 coverslip 주위 인감 이미지 샘플. 4 ° c.에 어둠 속에서 저장

3. 프로토콜 3: 시각화의 의 조 난 신호를 사용 하 여 eGFP CAAX mRNA

1. EGFP CAAX mRNA의 합성
   1. 37 ° c.에서 4 시간 동안 1mg pCS2 eGFP CAAX 플라스 미드¹⁶ 노트 40 mL의 반응 볼륨에서의 선형화
   2. 제한 다이제스트 반응을 중지, 추가 10 RNase 무료 물, 2.5 mL 10 %SDS 및 2.0 mL 10 mg/mL 가수분해 공화국
   3. 50 ° c.에 1 시간을 품 어
   4. 다음 반응에 추가 (전체 용량 200ml) 다음 단계로 진행: RNase 무료 50 mL 물, 20 mL 3 M 나트륨 아세테이트 pH 5.2와 75.5 RNase 무료 물
      참고: RNase 무료 물 나트륨 아세테이트의 과도 한 희석을 방지 하기 위해 두 개의 별도 경우에 추가 됩니다.
2. 페 놀/클로 프롬 추출 및 에탄올 강 수를 통해 DNA의 정화
   1. 추가 200 mL 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜과 소용돌이 20 미 분리에 대 일 분에 대 한 18000 x g에서 원심 분리를 통해 수성 및 유기 단계.
   2. 새로운 microcentrifuge 튜브, 하단 유기 층의 전송 방지를 위 수성 층 전송. 새로운 튜브를 클로 프롬의 동일한 볼륨을 추가 합니다.
      참고: 클로 프롬의 추가 선택 사항 이지만 샘플에서 페 놀의 완전 한 제거를 보장 하는 것이 좋습니다.
   3. 20 미 분리 5 분 18000 x g에서 원심 분리를 통해 수성 및 유기 단계에 대 한 소용돌이.
   4. 이전, 새로운 microcentrifuge 튜브, 하단 유기 층의 전송 방지를 위 수성 층 전송.
   5. 3 M 나트륨 아세테이트 pH 5.2의 1/10 볼륨을 추가 합니다.
   6. -20 ° C에서 4 ° c.에 20 분에 대 한 18000 x g 15 분 원심 분리기에서 100 %RNase 무료 에탄올과 오의 3 볼륨을 추가 하 여 DNA를 침전 펠 릿은 표시 되어야 합니다. 상쾌한을 가만히 따르다.
   7. 70% 에탄올/RNase 무료 찬물 100ml와 펠 릿을 세척. 부드럽게 혼합 후 판이 펠 릿을, 4 ° c.에서 15 분 18000 x g에서 원심 펠 릿은 표시 되어야 합니다. 상쾌한을 가만히 따르다.
   8. 5 분 동안 펠 릿 건조 하 고 7 mL 물에 DNA를 resuspend.
      참고: 펠 릿 해야 사용할 수 있는 공기 흐름에 따라 5 분 이상 건조 합니다.
3. 전사 및 eGFP CAAX mRNA의 정화
   1. RNase 없는 방식으로 한 체 외에 녹음 방송 반응 상용 Sp6 RNA 중 합 효소 키트, 순화 선형화 플라스 미드 DNA 단계 3.2에서의 약 1 밀리 그램을 사용 하 여 준비 합니다. 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어
      참고: Sp6 RNA 중 합 효소 출장된 mRNA의 생산을 위해 사용 해야 합니다.
   2. 1 mL DNase 추가 (2 U/mL; RNase 무료) 37 ° c.에 30 분 동안 품 어와
   3. 어떤 상용 RNA 정화 키트와 mRNA를 정화. 약 수-80 ° c.에 저장 반복된 동결-해 동을 피하기 위해 mRNA
4. 사출 및 시각화
   1. 1.1 프로토콜에에서 명시 된 배아를 얻을.
   2. Microinjection 장치를 사용 하 여 1 셀 단계에서 eGFP CAAX mRNA의 300 pg를 주사.
   3. EGFP 형광 stereoscope를 사용 하 여 눈에서의 밝은 표정으로 배아에 대 한 화면.
   4. 프로토콜 1.2에 설명 된 대로 배아를 이미지.
   5. 또는, dechorionate 4%에서 원하는 timepoint에 배아를 수정 하 고 실내 온도에 또는 하룻밤 4 ° c.에서 4 시간 동안 PFA 이전 일 경우 5 분 PBST, 4 번, 그리고 dechorionate, x 1에 배아를 씻어. 눈을 해 부하 고 프로토콜 2.3에 설명 된 대로 슬라이드에 그들을 마운트.

결과

Zebrafish SOS 20에 나타납니다 hpf 추정 등 망막⁸에. 넓은 들여쓰기의 초기 좁은 아키텍처에서 23 hpf SOS 전환 및 26 hpf 그것은 더 이상 볼 수⁸. 따라서, 정상적인 zebrafish 눈 개발 하는 동안 SOS를 검사, 태아는 20-23 hpf 사이 관찰 해야 합니다. 이 기간 동안 SOS와 DIC 이미징 개발 망막 (그림 1)의 비 강 및 시간 반으로 구분 하는 ...

토론

여기, 선물이 발전 zebrafish 태아에서 조 난 신호를 관찰 하는 프로토콜의 표준화 된 시리즈. 확인 하려면 폐쇄 지연 고기, 우리의 프로토콜에 초점을 맞춘 눈, 비슷한 맥락 막 게 폐쇄 지연 시각화 하는 데 사용 하는 기술을의 지 강과 등 시간적 측면의 두 개의 개별 돌출부의 분리를 구별할 수 있는 능력 복 부 눈에 고기입니다.

이러한 시각화 기술은 SOS의 폐쇄에 그들의 역할을 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl 2-thiourea	Sigma Aldrich	P7629-10G
100 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713
35 mm Petri dish	Corning	CLS430588
Agarose	BioShop Canada Inc.	AGA001.1
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
DIC/Fluorescence microscope	Zeiss	AxioImager Z1
Dissection microscope	Olympus	SZX12
Dissection microscope camera	Qimaging	MicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning High-vacuum grease	Fisher Scientific	14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma Aldrich	A5040-25G
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Image capture software	Zeiss	ZEN
Incubator	VWR	Model 1545
Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Minutien pin	Fine Science Tools	26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2	Fisher Scientific	BP1752-100
Proteinase K	Sigma Aldrich	P4850
Rabbit anti-laminin antibody	Millipore Sigma	L9393
TURBO Dnase (2 U/µL)	Invitrogen	AM2238
Ultrapure low-melting point agarose	Invitrogen	16520-100
UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Invitrogen	15525017