研究使用细胞外基体水凝胶的正常组织辐射效应

摘要

该协议提出了一种在外体照射后,对母体乳腺脂肪垫进行去细胞化和随后水凝胶形成的方法。

摘要

辐射是治疗三阴性乳腺癌患者的一种疗法。辐射对健康乳腺组织细胞外基质(ECM)的影响及其在原发性肿瘤部位局部复发中的作用尚不得而知。在这里,我们提出了一种从母体乳腺脂肪垫中提取的ECM水凝胶的去细胞化、冻干和制造方法。对脱细胞化过程的有效性进行了评价,并评估了变菌学参数。GFP-和荧光素酶标记的乳腺癌细胞封装在水凝胶中,表明辐照水凝胶的增殖增加。最后,利用phalloidin结合染色来可视化封装肿瘤细胞的细胞骨架组织。我们的目标是提出一种用于体外研究的培养水凝胶的方法,模拟体内乳房组织环境及其对辐射的反应,以研究肿瘤细胞行为。

引言

癌症的特点是细胞的过度增殖,可以避免凋亡,也可以转移到遥远的站点1。乳腺癌是美国女性最常见的发病之一,2018^年估计有26.6万新发病例和4万例死亡。特别具有攻击性和难以治疗的亚型是三阴性乳腺癌(TNBC),它缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人类表皮生长因子(HER2)。放射治疗通常用于乳腺癌,以消除肿瘤切除术后的残余肿瘤细胞,但超过13%的TNBC患者在原发性肿瘤^部位3仍然出现复发。

众所周知,放射治疗是有效的缓解转移和复发,因为块切除术和辐射的组合导致相同的长期生存,作为乳房切除术4。然而,最近已经表明,放射治疗与免疫功能低下设置5、6的原发性肿瘤部位局部复发有关。此外,众所周知,辐射通过诱导纤维^化7改变正常组织的细胞外基质(ECM)。因此,了解辐射引起的ECM变化在控制肿瘤细胞行为中的作用是很重要的。

脱细胞组织已被用作体外模型来研究疾病8,9。这些去细胞化组织可保存ECM成分,并重述体内复合体ECM。这种脱细胞组织ECM可以进一步处理和消化,形成重组的ECM水凝胶,可用于研究细胞生长和功能10,11。例如,从脱细胞的人类脂吸剂和心肌组织中提取的可注射水凝胶作为组织工程的非侵入性方法,而从猪肺组织中提取的水凝胶被用作体外检测方法中生干细胞附着和活力12,13,14。然而,正常组织辐射损伤对ECM特性的影响尚未研究。

从ECM衍生的氢凝胶对体外体外现象的研究潜力最大。其他几种材料已经研究过,包括胶原蛋白、纤维蛋白和母蛋白,但很难综合地概括ECM13的成分。使用ECM衍生水凝胶的一个优点是ECM含有特定组织所需的蛋白质和生长因子14,15。在块切除术期间对正常组织的照射会导致ECM的显著变化,ECM衍生的水凝胶可用于在体外研究这种效应。这种方法可能导致更复杂和更准确的疾病体外模型。

在这项研究中,我们让母体乳腺脂肪垫(MFP)受到外体辐射。MFP被脱细胞制成预凝胶溶液。水凝胶是由嵌入的4T1细胞,一个小鼠TNBC细胞系形成的。研究了水凝胶材料的脑学特性,并在水凝胶内评估了肿瘤细胞动力学。由辐照的MFP制成的水凝胶增强了肿瘤细胞增殖。未来的研究将纳入其他细胞类型,以研究治疗后癌症复发背景下的细胞-细胞相互作用。

研究方案

动物研究是根据范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会批准的机构准则和协议进行的。

1. MFP的准备和外生辐照

1. 使用CO2窒息和宫颈脱位牺牲贫血Nu/Nu小鼠(8-10周)。
2. 使用 70% 乙醇清洁皮肤。
3. 使用预消毒剪刀和钳子从牺牲的小鼠身上收集乳腺脂肪垫 (MFP),在含有完整 RPMI 介质的 15 mL 锥形管中(RPMI 补充 1% 青霉素-链霉素和 10% 胎儿牛血清)(参见材料表).
4. 使用镉源将样品照射到 20 Gy。
5. 将辐照多功能一体机和完整的 RPMI 介质放入生物安全机柜中。介质将依赖于要在最后的水凝胶中生长的细胞系。用足够的介质填充 6 厘米或 10 厘米的盘子,以浸入多功能一体机。对于 6 厘米的菜肴,使用 8 mL 的介质,对于 10 厘米的盘子,使用 20 mL 的介质。
6. 在37°C/5%CO2培养箱中孵育两天。可调整培养箱中的时间长度。
7. 在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中冲洗组织,将 MFP 放入 15 mL 锥形管中,在 -80°C 下储存,直至去细胞化。此冻结步骤有助于去细胞化步骤,即使后续步骤已准备就绪,也应冻结样品。

2. 去细胞化(改编自参考文献12、16、17)

注:这个程序是从以前发表的专注于脂肪去细胞化的方法,其中包括钠脱氧胆汁离子洗涤剂,而不是硫酸钠,以有效地去除DNA^12,16,17.

1. 第1天,从-80°C中去除冷冻的MSP,并在室温下解冻。
2. 一旦解冻,干式多功能一机在一个微妙的任务擦除短暂。使用分析量表对多功能一步机进行称重。
3. 使用一对带剪刀或手术刀的钳子,将组织分成 3 mm x 3 mm x 3 mm 样品,用于研究完整的 ECM 和用于水凝胶生产的剩余组织。
   注: 样本数量取决于测试方法的数量,例如,下面描述了两个样品的收集:一个用于石蜡嵌入(步骤 2.5),另一个用于冷冻在低温嵌入介质中(如果需要,请参阅材料表)和步骤 2.6)。
4. 称量组织。如果嵌入石蜡进行切片,请继续执行步骤 2.5。如果在冷冻中嵌入介质以进行切片,请继续执行步骤 2.6。
5. 在化学罩中,在4°C下将组织浸入10%中性缓冲形式(NBF)(见材料表)24小时。在 PBS 中洗涤 3 次,每次 5 分钟。在4°C下将组织浸入30%蔗糖中48小时。
   1. 现在,这个片子已被移除,就称量组织。继续步骤 2.6。
6. 在化学罩中,将 MFP 件放入带有低温嵌入介质的标记盒中。添加更多的冷冻嵌入介质以覆盖组织。
   1. 将盒装放入2甲基丁烷的烧杯中(见材料表),用液氮预冷却。烧杯应有足够的2甲基丁烷覆盖底部,但不足以淹没盒,因为冷冻嵌入介质不应接触2甲基丁烷。让盒装纸盒位于2-甲基丁烷中,直到冷冻剂嵌入介质冻结并变得不透明。
   2. 将盒带包裹在箔片中,贴上标签,并在 -80°C 下离开,直到用于切片。
      注:立即放置在冷冻嵌入介质中的组织在5μm处被分割,而用蔗糖孵育的组织在30μm处被分割,以保留脂肪细胞形态。
7. 使用钳子手动按摩剩余的组织。
   注:组织片也可以放置在10%的NBF24-48小时,在PBS冲洗,并留在70%乙醇,直到嵌入石蜡。嵌入后,5 μm 截面可用于血氧素和欧辛(H & E)染色(见下文第7节)。
8. 将多功能一百万分放入 6 厘米的菜肴中,其中 5 mL 0.02% 胰蛋白酶/0.05% EDTA 溶液。在37°C孵育1小时,喷雾并用70%乙醇擦拭盘子,然后再放入培养箱。
9. 使用 0.7 mm 滤网将水浇在组织上三次,用去离子 (DI) 水清洗多功能一体。使用钳子手动按摩两次按摩之间的组织。
10. 在一个微妙的任务,简要干燥组织擦拭和称重。将组织放入含有适当尺寸的搅拌棒的预高压烧杯中。每1克组织用60 mL的3%t-octylxoxy聚乙氧乙醇(见材料表)覆盖组织,并在室温下搅拌1小时。 使用至少 20 mL。
11. 将组织和内容物倒入滤网中。用DI水冲洗烧杯,倒入纸巾上。再重复两次。使用钳子手动按摩冲洗之间的组织。
12. 在一个微妙的任务,简要干燥组织擦拭和称重。将纸巾和搅拌棒放回同一烧杯中,每 1 克组织用 60 mL 的 4% 脱氧胆酸覆盖。在室温下搅拌1小时。使用至少 20 mL。
13. 将组织和内容物倒入网状滤网中。用DI水冲洗烧杯,倒入纸巾上。再重复两次。使用钳子手动按摩冲洗之间的组织。
14. 在一个微妙的任务,简要干燥组织擦拭和称重。
15. 将组织放在同一烧杯中,加入新鲜的DI水,并辅以1%的青霉素-链霉素。用石蜡薄膜紧紧盖住。在4°C下过夜。
16. 清洗滤网和烧杯,以便第二天使用。
17. 第2天,将烧杯中的内容排入滤网。在一个微妙的任务,简要干燥组织擦拭和称重。
18. 将多功能一体机放在同一烧杯中,并带有适当大小的搅拌棒。每1克组织使用60 mL 4%乙醇/0.1%的多乙酸溶液覆盖。使用至少 20 mL。在室温下搅拌2小时。
19. 将组织和内容物倒入 0.7 mm 滤网中。使用钳子手动按摩组织。将内容放回烧杯中。用每1克组织60 mL的1x PBS覆盖组织。使用至少 20 mL。在室温下搅拌15分钟。重复一次。
20. 将组织和内容物倒入 0.7 mm 滤网中。使用钳子手动按摩组织。将内容放回烧杯中。用每1克组织60 mL DI水覆盖组织清洗组织。使用至少 20 mL。在室温下搅拌15分钟。重复一次。
21. 在一个微妙的任务,简要干燥组织擦拭和称重。将组织和内容物倒入滤网中。使用钳子手动按摩组织。
22. 将内容放回烧杯中。用每1克组织60mL的100%n-丙醇覆盖组织。使用至少 20 mL。在室温下搅拌1小时。
23. 在一个微妙的任务,简要干燥组织擦拭和称重。将组织和内容物倒入 0.7 mm 滤网中。使用钳子手动按摩组织。
24. 将内容放回烧杯中。用每1克组织60 mL的DI水覆盖组织清洗组织。使用至少 20 mL。在室温下搅拌15分钟。重复三次。
25. 将组织和内容物倒入滤网中。重复步骤2.3~2.6收集蔗糖孵育和冷冻在冷冻嵌入介质中的组织片段。
26. 在一个微妙的任务,简要干燥组织擦拭和称重。放入标有 15 mL 的管中。在-80°C冷冻过夜。

3. 冻干

1. 从 -80°C 中取出 15 mL 管,放在干冰上。将样品冷冻在干冰上,直到在冻干剂上。
2. 取下盖。使用橡皮筋将精细的任务擦除固定在顶部以盖住开口。将样品放在冻干剂上至少2天。
3. 从冻干剂中取出样品,并将管子放在干冰上。去除精细的任务湿巾,在分析尺度上称量每个样品。连夜将盖和放置在 -80°C。

4. 铣削

1. 在浅容器中填充液氮。从 -80 °C 冷冻箱中取出样品。称量每个冻干性MFP。
2. 将一个样品放入砂浆中。使用低温手套将砂浆留在液氮中。
3. 使用连接到手持钻头的刺来铣削样品。以 1 分钟间隔铣削,检查进度,并从液氮中取出戴手套的手。碾磨至少 5 分钟。
4. 对所有样本重复上述步骤。在每个样品之间喷洒和擦拭砂浆和用乙醇擦拭。
5. 将粉末样品储存在15 mL管中,温度为-80°C,直至准备就绪。
   注:样品可立即使用或储存过夜。

5. 水凝胶形成

1. 如果储存在-80°C过夜,在室温下取出并解冻。解冻时,计算胰蛋白素(见材料表)的必要重量和每个样品所需的盐酸(HCl)体积,从而产生1%的w/v样品粉末和0.1%的带0.1%的胰蛋白蛋白(0.01 M HCl)。将胰蛋白蛋白添加到HCl中形成胰蛋白辛-HCl溶液。
2. 将样品粉末和胰蛋白石-HCl溶液加入15 mL管中。加入一个小搅拌棒,搅拌48小时。
3. 将管子放在冰上5分钟。计算每个样品所需的10x PBS所需体积,从而产生1x PBS浓度的溶液。将适当的 10x PBS 体积添加到每个管中。
4. 在每个解决方案中添加 10% v/v 0.1 M NaOH,达到 pH 7.4。使用 pH 纸单独测试。
   注:凝胶溶液可在4°C下储存一周。

6. 在水凝胶中封装细胞

1. 使用 GFP 和荧光素酶标记的单元格
   1. 使用pH 7.4凝胶溶液,将颗粒化的GFP和荧光素酶标记的4T1细胞重新悬浮到500,000或1,000,000细胞/mL的凝胶溶液中。在 16 孔腔室滑动的每个孔中加入 16 μL 的凝胶细胞溶液。在37°C下孵育30分钟。
   2. 在每个井中添加 100 μL 的完整 RPMI 介质。在37°C下继续孵育48小时。GFP-和荧光素酶标记的细胞可以在凝胶化后0小时、24小时和48小时内使用荧光显微镜进行可视化。
      注:通过向井中添加(S)-4,5-二氢-2-(6-羟基-2-苯甲酸)-4-硫磷酸钾盐(见材料表),可以测量此处使用的GFP和荧光素酶标记4T1细胞的细胞增殖以及使用生物发光成像系统进行生物发光成像(参见材料表)。在生物发光成像后,细胞骨架可以可视化(见第10节)。
2. 使用未标记的单元格
   1. 使用pH 7.4凝胶溶液,将未标记的颗粒4T1细胞重新悬浮至500,000或1,000,000细胞/mL的凝胶溶液。在 16 孔腔室滑动和 96 孔板的每个孔中加入 16 μL 的凝胶细胞溶液。在37°C下孵育30分钟。
   2. 向每个井添加 100 μL 的介质。在37°C下继续孵育48小时。
      注:可以测量细胞的存活性(见第11节)。16 孔室滑动可用于成像,96 孔板可用于定量。

7. H & E 染色

1. 对于正式固定的石蜡嵌入组织,在 100% 二甲苯(5~10 分钟)中两次将包含 5 μm 部分的滑片浸入,以进行脱石化。再水化在100%、95%、85%和70%乙醇中,每次5分钟,然后用DI水再水5分钟。继续步骤7.6。
2. 对于冷冻组织部分,立即从冷冻室中取出部分,并将其浸入 10% NBF 中 10 分钟。在 1x PBS 中清洗三次,每次 5 分钟。在水中冲洗5分钟。
3. 用血氧素染色核3分钟,在自来水中冲洗。
4. 在 0.3% 酸醇中浸渍 1⁄2 次(70% 乙醇中为 0.3% HCl)。在自来水中冲洗 5 分钟。
5. 加入30秒的蓝光剂,在自来水中冲洗5分钟,在95%乙醇中浸入30秒。
6. 在室温下用eosin孵育90s。在3次100%乙醇的改变中脱水,每次5分钟。
7. 在100%二甲苯中浸入两次,每次5分钟。向幻灯片中添加脱苯-塑料-二甲苯(DPX0 安装介质,并添加盖玻片)。让它在成像前一夜之间治愈。

8. 1-([4-(Xylylazo)xlyl_azo)-2-纳普霍尔染色

1. 准备1-(+4-(Xylylazo)xlyl_azo)-2-纳普霍尔溶液。
   1. 将 0.5 g 的 1-([4-(Xlylylazo)xlyl_azo]-2-纳普霍尔粉末添加到含有 100 mL 丙二醇的烧杯中。加热至95~100°C,搅拌至少30分钟,防止温度超过100°C。
   2. 从热中取出烧杯,并稍稍冷却。通过 4 级定性滤纸浇注溶液,去除任何残留颗粒。
      注:溶液可储存在室温下,应在染色前立即通过0.45μm注射器过滤器过滤。
2. 染色冷冻组织部分。
   1. 从 -80°C 冷冻箱中取出滑片,在 -20°C 下在 -20°C 下预冷却 10% NBF 30 分钟,在 Coplin 罐中干燥 30 分钟。将幻灯片在室温下固定 10 分钟,在 DI 水中清洗 3 次,每次 5 分钟。
   2. 在浸入丙二醇2次,每次5分钟之前,使用精细的任务擦拭去除多余的水。从丙二醇中取出滑片。请勿冲洗。
   3. 在室温下将幻灯片放入注射器过滤的油红 O 染色溶液中 3 小时。
   4. 将幻灯片放入85%丙二醇5分钟,在PBS中冲洗样品两次,每次5分钟。以区分。
   5. 用血氧素染色样品30秒,在自来水中洗涤5分钟,然后将滑梯放入DI水中。
   6. 使用基于水的安装介质安装样品,并允许介质在成像前过夜干燥。

9. 循环学

1. 将预凝胶溶液从步骤 5.4 带到冰上的辐射仪。
2. 将 25 mm 臂和板连接到辐射计。打开连接到变速器的计算机上的变通学软件。
3. 执行旋转映射并确定零间隙。完成后,抬起手臂。
4. 板上预凝胶的移液器 500 μL。降低臂,直到预凝胶溶液完全占据板和手臂之间的间隙。保守,因为将手臂降至此点将导致预凝胶溶液从侧面溢出。
5. 在预凝胶溶液保持 37°C 30 分钟后,从 0.1~100 Hz 对预凝胶溶液进行频率扫描。
6. 完成后,升起呼伦比表臂。用精细的任务擦拭液体。用 DI 水冲洗,并用精细的任务擦拭。使用附加示例重复步骤 9.4_9.6。

10. 法洛丁结合染色的F-actin

1. 将方黄素结合溶液带入室温。在打开前以低速短暂离心。对测定的抗比溶液,并将其余溶液储存在-20°C。
2. 将 1 μL 库存溶液添加到 1 mL 1x PBS = 1% 牛血清白蛋白 (BSA) 中,将 1000x phalloidin 结合库存溶液稀释到 1x 工作溶液中。这足以满足 10 口井(100 μL/井)。
   注意: 一个人可以使用普通 1x PBS, 但 1x PBS + BSA 是首选,以防止苯甲素结合粘到管.在测定后不要存储此解决方案。1 μL的蓝色荧光染料(见材料表)工作溶液可添加到核染色中。将 1 μL 的 20 mM 蓝色荧光染料与 11.3 μL 1x PBS 混合,可制成工作溶液。
3. 从井中吸气介质(步骤 6.1)。用 1x PBS 冲洗水井。
4. 添加 10% NBF。在室温下用10%NBF孵育井20分钟。去除上清液。每次用PBS洗3次5分钟。
5. 在PBS中加入0.1%t-Octyl苯二氧乙二醇5分钟。吸气和每次用PBS洗涤3次5分钟。
6. 将步骤 10.2 中 100 μL 的工作溶液添加到每个井中。在室温下孵育1小时。每次用PBS吸气和洗涤3次5分钟。在 4 °C 时留在 PBS 中。
7. 吸气,从造型室滑道上的垫片中取出井。使用针鼻钳从滑轨上拆下垫片。使用基于水的安装介质安装和盖玻片样品。允许治愈(5分钟)。
8. 在590/618nm的激发/发射下,在荧光显微镜下观察细胞。

11. 可行性测定

1. 用 Dulbecco 的 PBS (DPBS) 冲洗细胞。在每个井中加入100 μL的DPBS,其中含有1μM钙质AM和2μM甲酸酯。在室温下孵育30分钟。
2. 通过荧光显微镜将 16 井室幻灯片成像。在激励/排放 = 494/517 nm 时可观察到甲基乙氧甲基(钙素 AM)。在激发/发射 = 528/645 nm 时,可以观察到紫杉石。
3. 在步骤 11.2 中,使用相同波长读取板读取器上的 96 孔板。

结果

使用图1A所示的程序在辐照后对MFP进行去细胞化。图为MFP预脱细胞化(图1B)和脱细胞后(图1C)。使用血氧素和欧辛(H & E)染色确认去细胞化,并使用1-([4-(Xlylazo)xlyl_azo-2-纳普霍尔染色法评估脂质含量(图2)。ECM水凝胶的学性质在37°C下也得到评估(图3)。在所有条件下,储存模量均高于损耗模量,表明水凝胶形成稳定。

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讨论

这种水凝胶形成方法很大程度上取决于起始组织的数量。Murine MM 非常小,脱细胞化过程可显著减少材料(表 1)。该过程可以重复与更多的多功能一机,以提高最终产量。铣削是另一个可能导致材料损失的重要步骤。其他人已经展示了成功的低温磨机,但该协议是基于铣削通过手持砂浆和电钻与刺带附件8,17。这具有降低资本成本和最小化材料损失...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128	-
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387	-
AR 2000ex Rheometer	TA Instruments	10D4335	rheometer
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G	-
calcein acetoxymethyl (calcein AM)	Molecular Probes, Inc.	C1430	-
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Biosynth Chemistry & Biology	L-8820	(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt
DPX Mountant for Histology	Sigma-Aldrich	06522-500ML	-
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133	-
Eosin-Y with Phloxine	Richard-Allan Scientific	71304	eosin
ethidium homodimer	Molecular Probes, Inc.	E1169	ethidium homodimer-1 (EthD-1)
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F0926-500ML	-
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	aqueous based mounting medium
FreeZone 4.5	Labconco	7751020	lyophilizer
Hoechst 33342 Solution (20 mM)	Thermo Scientific	62249	blue fluorescent dye
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148-500ML	-
IVIS Lumina III	PerkinElmer	CLS136334	bioluminescence imaging system
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500	-
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625-25G	1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol
OPS Diagnostics CryoGrinder	OPS Diagnostics, LLC	CG-08-02	-
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	-
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887-5G	pepsin
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML	-
Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757)	abcam	ab176757	phalloidin conjugate
Propylene glycol	Sigma-Aldrich	W294004-1KG-K	-
Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent	Richard-Allan Scientific	7301L	bluing agent
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211	-
RPMI Medium 1640	Gibco	11875-093	-
Sodium deoxycholate, 98%	Frontier Scientific	JK559522	deoxycholic acid
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016	-
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056	-
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-4	-