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摘要

本研究提出了一种简单可行的方法来评估在实验室条件下以水稻为食的白背飞虱的非偏好抗性。讨论了当前鉴定白背飞虱和棕色飞虱抗性的方法的改进策略和构成。

摘要

开发抗虫水稻种质资源及相关基因是培育抗虫品种的首要需求，但水稻抗虫表型鉴定的准确性是一个主要难点。迫切需要开发一种新方法或改进现有方法来筛选水稻的抗虫性。本文描述了一种简单可行的方法来评估水稻在实验室中对白背飞虱 （WBPH） Sogatella furcifera 的非偏好型抗性。通过成对比较不断分析以成熟水稻植株为食或栖息的成年 WBPHs 的偏好。记录水稻植株上 WBPHs 的动态变化并进行比较，作为抗性鉴定的指标。目前的方法作简单，易于观察，周期短。这种方法的使用可以扩展到研究类似半翅目动物的摄食和产卵偏好，例如棕色飞虱 （BPH）、 Nilaparvata lugens （Stål）。

引言

大米是世界上超过三分之一的人口的主食，超过 90% 的大米在亚洲生产和消费 1,2。WBPH 和 BPH 是最具破坏性的水稻害虫，对水稻生产构成重大威胁3.从成本和环境的角度来看，抗虫水稻的培育和施用是控制飞虱造成的损害的最有效途径 4,5,6。因此，筛选抗虫稻种质资源是选育抗虫稻的关键前提。水稻抗性表型鉴定的准确性有助于目标基因的精细定位和进一步的功能研究。然而，由于耐药机制的复杂性，表型鉴定已成为一个主要难点。水稻对害虫的抵抗力可分为三种类型，即抗菌、耐受和非偏好7。每种类型都反映了水稻对害虫的抵抗机制的不同方面。目前，应用最广泛的抗飞虱筛选方法是标准种箱筛选技术 （SSST），该技术可用于快速识别大量水稻植物的表型抗性，并在短时间内获得候选抗性种质系8。

然而，SSST 方法仅反映了水稻在苗期的抗性，在评估耐受型抗性机制方面更有效。水稻对昆虫的抵抗力还反映在抗菌素上，如若虫存活率、若虫持续时间和卵孵化率，以及非偏好性，如栖息地、摄食和产卵偏好9。此外，水稻幼苗的抗性性能通常不是很稳定。随着植物的生长，抗性往往会变得更加稳定。因此，SSST 方法不能完全反映水稻的抗性水平。此外，水稻对病虫害的抗性在不同生长阶段存在差异，幼苗和成熟植株的抗性机制存在明显差异。研究表明，成熟的水稻植物可以释放挥发性的次生代谢产物，以避免虫害的侵扰，这表现为昆虫对水稻植物的摄食或产卵的非选择性10,11。这也是一种非常关键的抗性机制，在预防害虫和保证水稻成熟产量方面发挥着重要作用。

目前，通过非偏好来识别水稻的抗性仍然是一个挑战。在这种情况下，目前使用两种主要方法。一方面，将飞虱和水稻植物放入方形尼龙网笼12 中。虽然这种方法被认为对于同时在多个水稻品系上进行实验相对有效，但它需要更大的实验空间，因此，由于尼龙网材料不透明，导致观察和计数存在一些困难。另一方面，根据水稻释放的挥发性物质的差异，将 Y 管嗅觉计法用于昆虫选择实验。由于其玻璃容器14，这种方法便于观察。这种方法的主要限制因素之一是它只能判断挥发性气味，并且对实验装置的密封性也有严格的要求，耗时较长。

在此，我们描述了一种改进的方法来评价水稻植物对 WBPHs 的非偏好型抗性，该方法作简单，易于观察。该方法还可用于研究 BPH 和其他半翅目害虫的栖息地、摄食和产卵偏好行为。

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研究方案

1. 飞虱、水稻植物和聚氯乙烯笼的制备

  1. 飞虱
    1. 在防虫笼中，将 WBPH 放在一种称为 Taichung Native 1 （TN1） 的易感水稻品种的分蘖上，让它们世代自然繁殖。选择长翅、新出现的雌性成虫进行进一步的实验。
      注：WBPH 由中国农业科学院深圳农业基因组研究所提供。
  2. 水稻植物
    1. 将每条水稻行的种子浸泡在水中，并将它们放入气候控制室中，参数设置为 28 °C，75%-80% 相对湿度 （RH），循环 14 小时光照/10 小时黑暗 2 天，直到发芽。
    2. 将每行测试水稻的 30 颗发芽种子均匀地播种在塑料种子箱（20 厘米 [长] x 15 厘米 [宽] x 10 厘米 [高]）中，该种子箱中装满稻田土壤至 3-4 厘米深。
    3. 用一层薄薄的细干土覆盖种子;然后，用水润湿干燥的土壤。
    4. 将种子箱放入 28 °C 的 200 目防虫笼（75 厘米 [长] x 75 厘米 [宽] x 75 厘米 [高]）中，在 75%-80% RH 和 14 小时光照/10 小时黑暗循环处理中在气候控制室中。每天浇水以保持土壤湿润。继续种植植物 7 天，直到它们达到两到三片叶子的阶段。
    5. 选择 20 棵具有相似生长潜力的幼苗，将幼苗移植到直径为 10 厘米的塑料种子盆（每盆一棵幼苗）中，底部有一个孔。
    6. 将花盆放入 200 目防虫笼（75 厘米 [长] x 75 厘米 [宽] x 75 厘米 [高]）中，温度为 75%-80% RH，在气候控制室中进行 14 小时光照/10 小时黑暗循环处理，托盘底部有水，生长约 30 天，直到它们达到分蘖阶段有一个或两个分蘖。
    7. 在开始实验前 48 小时将水稻植株修剪成一个分蘖。
  3. 圆柱形聚氯乙烯笼
    1. 获得尺寸为 120 厘米 x 90 厘米、厚度为 0.5 毫米的透明聚氯乙烯 （PVC）。
    2. 做成高 90 厘米、直径 35 厘米的圆柱形结构。
    3. 使用订书机固定圆柱体两端的重叠区域。确保重叠区域长约 90 厘米，宽约 10 厘米。
    4. 用压敏胶带密封气瓶外围的整个重叠区域。
      注意： 确保圆柱形笼子可以垂直于地面放置，并且笼子与地面之间没有明显的间隙。
    5. 剪下 200 个网眼尼龙网，每个网的尺寸为 50 厘米 x 50 厘米;为后续步骤做好充分的准备。
    6. 获得足够的橡皮筋;收缩带子时，请确保直径约为 1.5 毫米，周长至少为 32 厘米。

2. 昆虫和水稻处理

  1. 将直径为 28 厘米、高度为 10 厘米的圆形塑料托盘放在气候控制室的平坦混凝土地面上，参数设置如步骤 1.2.6 所述。
    注意：如果温室地板是土壤，请找到尽可能平坦的表面，以确保托盘平放。
  2. 选择两盆不同的米线（从步骤 1.2.7 开始），将它们并排放入托盘中，并在塑料托盘中装满足够的水。
  3. 用步骤 1.3.4 中制作的圆柱形笼子盖住两个测试饭锅。
  4. 将一张尼龙网（来自步骤 1.3.5）放在笼子顶部。
    注意：笼子里的两个饭煲可以成组使用;每组重复 15 组。将饭盆随机放置在位置和方向上，但尽量确保两株稻草的叶子不接触。
  5. 使用手工制作的吸盘收集 40 只新出现的雌性 WBPH 成虫（参见第 1.1 节）。
  6. 将 WBPH 成虫放入玻璃管（直径 2 厘米，高度 15 厘米）中，并用海绵塞盖住。
  7. 提起尼龙网的一角（参见步骤 2.4）。
  8. 从玻璃管上取下海绵塞，将管子放在笼子的中间部分，以释放所有 WBPH。
  9. 快速盖住尼龙网并用橡皮筋密封，以防止 WBPH 逸出（图 1）。

3. 记录和观察

  1. 观察侵染后 3 、 6 、 24 、 48 、 72 、 96 和 120 小时每株水稻植株上 WBPHs 的分布。
  2. 通过透明笼记录不同水稻植株（包括叶鞘和叶子）上各个方向的 WBPH 数量。
    注意：在观察过程中要轻柔，以免打扰 WBPH。

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结果

本研究使用了 3 个测试稻系。水稻品系 FY01 对 WBPH 敏感，用作对照组。水稻品系 HZ08 和 HZ06 是在 FY01 的背景下分别引入潜在 WBPH 抗性 X1 基因和 X5 基因的转基因品系。因此，HZ08/HZ06 和 FY01 之间的水稻抗性比较可以揭示相应的插入基因是否具有潜在的抗性功能。在这项研究中，比较了两种水稻植物在取食或栖息方面的抗性，从而揭示了这两个基因是...

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讨论

成熟的水稻植物通过叶鞘表面的特殊物理结构释放挥发性的次生代谢物来控制害虫或降低这些害虫的交配能力（例如在 WBPH 中），这是一个关键的抗性机制13。在水稻植物中，非偏好不仅与摄食有关，还与栖息地和交配有关。然而，目前的研究集中在若虫的非偏好性 4,12 上，需要开发一种新的方法来识别成虫?...

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披露声明

作者没有什么可披露的。

致谢

作者感谢 Lang Yang 博士喂养白背飞虱和培养水稻。这项工作得到了深圳市大鹏新区产业发展专项资金（Grant No.KY20180216 和 KY20180115）。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
climate-controlled roomNingbo Jiangnan Instrument FactorySZJYS2013temperature, relative humidity, photoperiod control
glass tube with sponge stopper//diameter 2 cm and height 15 cm
handmade suction trap///
insect-proof cage //200-mesh, (L × W × H, 75 × 75 × 75 cm)
Nylon net//200 mesh
paddy soil///
plastic seed box // (L × W × H, 20 × 15 × 10 cm)
plastic seed pot//10-cm-diameter
plastic tray// (D × H, 28  × 10 cm)
rice seed of FY01 line//60 seeds
rice seed of HZ06 line//30 seeds
rice seed of HZ08 line//30 seeds
rice seed of TN1 variety//many
Rubber band//diameter is 1.5 mm, and the circumference is 32 cm
scotch tape///
SPSS Statistics 19.0IBM Corporation/statistical data analysis
stapler///
transparent PVC //120 cm × 90 cm dimensions and thickness of 0.5 mm

参考文献

  1. Du, B., et al. Identification and characterization of Bph14, a gene conferring resistance to brown planthopper in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. , (2009).
  2. Khush, G. S. Strategies for increasing the yield potential of cereals: case of rice as an example. Plant Breeding. 132 (5), 433-436 (2013).
  3. Heong, K. L., Hardy, B. Breeding for resistance to planthoppers in rice. Planthoppers: New Threats to the Sustainability of Intensive Rice Production Systems in Asia. , International Rice Research Institute, Asian Development Bank, Australian Government, Australian Centre for International Agricultural Research . 401-409 (2009).
  4. Han, Y., Wu, C., Yang, L., Zhang, D., Xiao, Y. Resistance to Nilaparvata lugens in rice lines introgressed with the resistance genes Bph14 and Bph15 and related resistance types. PLoS One. 13 (6), e0198630(2018).
  5. Arora, R., Sandhu, S. Advances in Breeding for Resistance to Hoppers in Rice. Breeding Insect Resistant Crops for Sustainable Agriculture. , Springer. Singapore. 101-130 (2017).
  6. Sarao, P. S., et al. Donors for resistance to brown planthopper Nilaparvata lugens (Stål) from wild rice species. Rice Science. 23 (4), 219-224 (2016).
  7. Horgan, F. Mechanisms of resistance: a major gap in understanding planthopper-rice interactions. Planthoppers: New Threats to the Sustainability of Intensive Rice Production Systems in Asia. Heong, K. L., Hardy, B. , International Rice Research Institute, Asian Development Bank, Australian Government, Australian Centre for International Agricultural Research. 281-302 (2009).
  8. He, J., et al. High-resolution mapping of brown planthopper (BPH) resistance gene Bph27 (t) in rice (Oryza sativa L). Molecular Breeding. 31 (3), 549-557 (2013).
  9. Ling, Y., Weilin, Z. Genetic and biochemical mechanisms of rice resistance to planthopper. Plant Cell Reports. 35 (8), 1559-1572 (2016).
  10. Qi, J., et al. The chloroplast-localized phospholipases D α4 and α5 regulate herbivore-induced direct and indirect defenses in rice. Plant Physiology. , 111(2011).
  11. Qiu, Y., Guo, J., Jing, S., Zhu, L., He, G. High-resolution mapping of the brown planthopper resistance gene Bph6 in rice and characterizing its resistance in the 9311 and Nipponbare near isogenic backgrounds. Theoretical and Applied Genetics. 121 (8), 1601-1611 (2010).
  12. Liu, Y., et al. A gene cluster encoding lectin receptor kinases confers broad-spectrum and durable insect resistance in rice. Nature Biotechnology. 33 (3), 301(2015).
  13. Lou, Y., et al. Differences in induced volatile emissions among rice varieties result in differential attraction and parasitism of Nilaparvata lugens eggs by the parasitoid Anagrus nilaparvatae in the field. Journal of Chemical Ecology. 32 (11), 2375(2006).
  14. Da Silva, A. G., et al. Non-preference for oviposition and antibiosis in bean cultivars to Bemisia tabaci biotype B (Hemiptera: Aleyrodidae). Revista Colombiana de Entomologia. 40 (1), 7-14 (2014).

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