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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo studio presenta un metodo semplice e fattibile per valutare la resistenza non preferenziale alle cicaline dorsobianco che si nutrono di riso in condizioni di laboratorio. Vengono discussi il miglioramento delle strategie e la composizione dell'attuale metodo di identificazione della resistenza alle cicaline dal dorso bianco e bruno.

Abstract

Sfruttare le risorse di germoplasma di riso resistenti agli insetti e i geni correlati è la necessità primaria per l'allevamento di varietà resistenti agli insetti, ma l'accuratezza dell'identificazione dei fenotipi di riso resistenti agli insetti è una grande difficoltà. È urgente sviluppare un nuovo metodo o migliorare i metodi esistenti per lo screening del riso per la resistenza agli insetti. Questo articolo descrive un metodo semplice e fattibile per valutare la resistenza del riso alla cicalina dal dorso bianco (WBPH), Sogatella furcifera, in laboratorio. La preferenza dei WBPH adulti che si nutrono o abitano le piante di riso in maturazione viene continuamente analizzata mediante confronto a coppie. Le variazioni dinamiche dei WBPH sulle piante di riso vengono registrate e confrontate come indice di identificazione della resistenza. Il metodo attuale è semplicemente utilizzabile e facilmente osservabile e ha un ciclo breve. L'uso di questo metodo potrebbe essere esteso per studiare la preferenza alimentare e di ovodeposizione di emitteri simili, come la cicalina bruna (BPH), Nilaparvata lugens (Stål).

Introduzione

Il riso è un alimento base per oltre un terzo della popolazione mondiale e oltre il 90% del riso viene prodotto e consumato in Asia 1,2. Il WBPH e l'IPB sono i parassiti più distruttivi del riso e una minaccia sostanziale per la produzione di riso3. Dal punto di vista dei costi e dell'ambiente, l'allevamento e l'applicazione di riso resistente agli insetti è l'approccio più efficace per controllare i danni causati dalle cavallette 4,5,6. Di conseguenza, lo screening delle risorse di germoplasma di riso resistente è un prerequisito fondamentale per l'allevamento di riso resistente agli insetti. L'accuratezza nell'identificazione del fenotipo resistente al riso è utile per la mappatura fine e l'ulteriore ricerca funzionale dei geni bersaglio. Tuttavia, l'identificazione fenotipica è diventata una grande difficoltà a causa della complessità del meccanismo di resistenza. La resistenza del riso ai parassiti può essere suddivisa in tre tipi, vale a dire antibiosi, tolleranza e non preferenza7. Ogni tipo riflette un aspetto diverso del meccanismo di resistenza del riso ai parassiti. Attualmente, il metodo più utilizzato per lo screening della resistenza alle cicaline è la tecnica standard di screening delle seedbox (SSST) che può essere utilizzata per identificare rapidamente la resistenza fenotipica di un gran numero di piante di riso e per ottenere linee di germoplasma resistenti candidate in breve tempo8.

Tuttavia, il metodo SSST riflette solo la resistenza del riso allo stadio di plantula ed è più efficace nella valutazione dei meccanismi di resistenza di tipo tollerante. La resistenza del riso agli insetti si riflette anche negli antibios, come il tasso di sopravvivenza della ninfa, la durata della ninfa e il tasso di schiusa delle uova, e nella non preferenza, come l'habitat, l'alimentazione e la preferenza per l'ovideposizione9. Inoltre, le prestazioni delle piantine di riso per la resistenza spesso non sono molto stabili. Con la crescita delle piante, la resistenza tende a diventare più stabile. Pertanto, il metodo SSST non può riflettere completamente il livello di resistenza del riso. Inoltre, la resistenza del riso ai parassiti varia nelle diverse fasi di crescita e ci sono evidenti differenze nei meccanismi di resistenza tra le piantine e le piante in maturazione. Gli studi hanno dimostrato che le piante di riso in maturazione possono rilasciare metaboliti secondari volatili per evitare l'infestazione da insetti nocivi, che si manifestano con la non selettività dell'insetto nell'alimentazione o nella deposizione di uova sulla pianta di riso10,11. Questo è anche un tipo di meccanismo di resistenza molto critico, che svolge un ruolo importante nella prevenzione degli insetti nocivi e nel garantire la resa del riso alla maturità.

Al momento, l'identificazione della resistenza del riso attraverso la non preferenza è ancora una sfida. In questo caso, attualmente vengono utilizzati due approcci principali. Da un lato, le cavallette e le piante di riso vengono messe in una gabbia quadrata di rete di nylon12. Sebbene questo approccio sia considerato relativamente efficiente per l'esecuzione di esperimenti su più linee di riso contemporaneamente, richiede uno spazio sperimentale più ampio e, quindi, causa alcune difficoltà nell'osservazione e nel conteggio a causa dei materiali delle reti di nylon non trasparenti. D'altra parte, il metodo dell'olfattometro a tubo Y viene utilizzato negli esperimenti di selezione degli insetti in base alla differenza nelle sostanze volatili rilasciate dal riso. Questo metodo facilita l'osservazione grazie al suo contenitore in vetro14. Uno dei principali fattori limitanti di questo metodo è che può giudicare solo l'odore volatile e ha anche un requisito rigoroso sulla tenuta dei dispositivi sperimentali e richiede molto tempo.

In questo articolo, descriviamo un metodo migliorato per valutare la resistenza di tipo non preferenziale della pianta di riso ai WBPH, che è semplice da utilizzare e facile da osservare. Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare l'habitat, l'alimentazione e il comportamento di preferenza per l'ovideposizione dell'IPB e di altri parassiti emitteri.

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Protocollo

1. Preparazione delle cavallette, delle piante di riso e della gabbia per cloruro di polivinile

  1. Planthoppers
    1. Posteriore WBPH su timone di una varietà di riso suscettibile chiamata Taichung Native 1 (TN1) in gabbie a prova di insetti e permette loro di riprodursi naturalmente per generazioni. Scegli femmine adulte dalle ali lunghe e appena emerse per ulteriori esperimenti.
      NOTA: I WBPH sono stati forniti dall'Istituto di Genomica Agraria di Shenzhen, Accademia Cinese delle Scienze Agrarie.
  2. Piante di riso
    1. Immergere i semi di ogni linea di riso in acqua e metterli in una stanza climatizzata con parametri impostati a 28 °C, 75%-80% di umidità relativa (UR) e cicli di 14 ore luce/10 ore buio per 2 giorni fino alla germinazione.
    2. Semina 30 semi germinati di ogni linea di riso testata in modo uniforme in una scatola di plastica (20 cm [lunghezza] x 15 cm [larghezza] x 10 cm [altezza]) che viene riempita con terriccio di risaia fino a una profondità di 3-4 cm.
    3. Copri i semi con un sottile strato di terriccio fine e asciutto; Quindi, bagnare il terreno asciutto con acqua.
    4. Metti la cassetta dei semi in una gabbia a prova di insetti da 200 maglie (75 cm [lunghezza] x 75 cm [larghezza] x 75 cm [altezza]) a 28 °C, con il 75%-80% di umidità relativa e un ciclo di 14 ore luce/10 ore buio in una stanza climatizzata. Innaffia ogni giorno per mantenere il terreno umido. Continua a coltivare le piante per 7 giorni, fino a quando non hanno raggiunto lo stadio di due o tre foglie.
    5. Scegli 20 piantine con un potenziale di crescita simile, trapianta le piantine in vasi di plastica di 10 cm di diametro (una piantina per vaso) con un foro sul fondo.
    6. Posizionare i vasi in una gabbia a prova di insetti da 200 maglie (75 cm [lunghezza] x 75 cm [larghezza] x 75 cm [altezza]) a 28 °C, con 75%-80% di umidità relativa e un trattamento di 14 ore luce / 10 ore di buio in una camera climatizzata, con acqua sul fondo del vassoio, per circa 30 giorni di crescita fino a raggiungere la fase di accestimento con una o due frese.
    7. Taglia le piante di riso a una fresa 48 ore prima di iniziare l'esperimento.
  3. Gabbia cilindrica in cloruro di polivinile
    1. Ottenere cloruro di polivinile (PVC) trasparente con dimensioni di 120 cm x 90 cm e uno spessore di 0,5 mm.
    2. Trasformalo in una struttura cilindrica con un'altezza di 90 cm e un diametro di 35 cm.
    3. Utilizzare una cucitrice per fissare l'area di sovrapposizione su entrambe le estremità del cilindro. Assicurarsi che l'area di sovrapposizione sia di circa 90 cm di lunghezza e 10 cm di larghezza.
    4. Sigillare l'intera area di sovrapposizione dalla periferia del cilindro con nastro adesivo sensibile alla pressione.
      NOTA: Assicurarsi che la gabbia cilindrica possa essere posizionata verticalmente rispetto al suolo e che non vi sia uno spazio evidente tra la gabbia e il suolo.
    5. Tagliare 200 reti di nylon a maglie, ciascuna con dimensioni di 50 cm x 50 cm; Preparati abbastanza per i passaggi successivi.
    6. Procurati elastici adeguati; Assicurati che il diametro sia di circa 1,5 mm e la circonferenza sia di almeno 32 cm quando la fascia è contratta.

2. Trattamento degli insetti e del riso

  1. Posizionare un vassoio di plastica rotondo con un diametro di 28 cm e un'altezza di 10 cm su un terreno pianeggiante di cemento in una stanza climatizzata con impostazioni dei parametri come descritto al passaggio 1.2.6.
    NOTA: Se il pavimento della serra è in terra, trovare una superficie il più piatta possibile per garantire che il vassoio sia steso in piano.
  2. Scegli due pentole di linee di riso diverse (dal passaggio 1.2.7) e mettile nella teglia, una accanto all'altra, e riempi la teglia di plastica con acqua a sufficienza.
  3. Coprire le due pentole di riso di prova con la gabbia cilindrica realizzata al punto 1.3.4.
  4. Metti un pezzo di rete di nylon (dal passaggio 1.3.5) sopra la gabbia.
    NOTA: Le due pentole di riso nella gabbia possono essere utilizzate in gruppo; Ripeti 15 serie di ogni gruppo. Posiziona le pentole di riso in modo casuale in posizione e direzione, ma cerca di assicurarti che le foglie delle due piante di riso non si tocchino.
  5. Utilizzare una trappola di aspirazione fatta a mano per raccogliere 40 femmine adulte di WBPH appena emerse (fare riferimento alla sezione 1.1).
  6. Mettere gli adulti WBPH in un tubo di vetro (con un diametro di 2 cm e un'altezza di 15 cm) e coprirlo con un tappo di spugna.
  7. Sollevare un angolo della rete di nylon (vedere il passaggio 2.4).
  8. Rimuovere il tappo di spugna dal tubo di vetro e posizionare il tubo nella parte centrale della gabbia per rilasciare tutti i WBPH.
  9. Coprire rapidamente la rete di nylon e utilizzare un elastico per sigillarla per evitare la fuoriuscita dei WBPH (Figura 1).

3. Registrazione e osservazione

  1. Osservare la distribuzione dei WBPH su ciascuna pianta di riso a 3, 6, 24, 48, 72, 96 e 120 ore dopo l'infestazione.
  2. Registra il numero di WBPH su diverse piante di riso, tra cui la guaina fogliare e la foglia da tutte le direzioni attraverso la gabbia trasparente.
    NOTA: Essere delicati durante il processo di osservazione per non disturbare i WBPH.

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Risultati

In questo studio sono state utilizzate tre linee di riso di prova. La linea di riso FY01 è suscettibile alla WBPH e viene utilizzata come gruppo di controllo. Le linee di riso HZ08 e HZ06 erano linee transgeniche in cui sono stati introdotti rispettivamente il gene X1 e il gene X5 potenzialmente resistenti a WBPH, sulla base del background di FY01. Pertanto, un confronto della resistenza al riso tra HZ08/HZ06 e FY01 potrebbe rivelare se il corrispondente...

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Discussione

Le piante di riso in maturazione rilasciano metaboliti secondari volatili per controllare gli insetti nocivi o ridurre la capacità di accoppiamento di questi parassiti (come nei WBPH) attraverso una speciale struttura fisica sulla superficie della guaina fogliare, che è un meccanismo di resistenza chiave13. Nelle piante di riso, la non preferenza non è solo legata all'alimentazione, ma anche all'habitat e all'accoppiamento. Tuttavia, gli studi attuali si sono c...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori sono grati al Dr. Lang Yang per aver nutrito le cicaline dal dorso bianco e per aver coltivato il riso. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi speciali per lo sviluppo industriale del nuovo distretto di Dapeng, nella città di Shenzhen (sovvenzione n. KY20180216 e KY20180115).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
climate-controlled roomNingbo Jiangnan Instrument FactorySZJYS2013temperature, relative humidity, photoperiod control
glass tube with sponge stopper//diameter 2 cm and height 15 cm
handmade suction trap///
insect-proof cage //200-mesh, (L × W × H, 75 × 75 × 75 cm)
Nylon net//200 mesh
paddy soil///
plastic seed box // (L × W × H, 20 × 15 × 10 cm)
plastic seed pot//10-cm-diameter
plastic tray// (D × H, 28  × 10 cm)
rice seed of FY01 line//60 seeds
rice seed of HZ06 line//30 seeds
rice seed of HZ08 line//30 seeds
rice seed of TN1 variety//many
Rubber band//diameter is 1.5 mm, and the circumference is 32 cm
scotch tape///
SPSS Statistics 19.0IBM Corporation/statistical data analysis
stapler///
transparent PVC //120 cm × 90 cm dimensions and thickness of 0.5 mm

Riferimenti

  1. Du, B., et al. Identification and characterization of Bph14, a gene conferring resistance to brown planthopper in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. , (2009).
  2. Khush, G. S. Strategies for increasing the yield potential of cereals: case of rice as an example. Plant Breeding. 132 (5), 433-436 (2013).
  3. Heong, K. L., Hardy, B. Breeding for resistance to planthoppers in rice. Planthoppers: New Threats to the Sustainability of Intensive Rice Production Systems in Asia. , International Rice Research Institute, Asian Development Bank, Australian Government, Australian Centre for International Agricultural Research . 401-409 (2009).
  4. Han, Y., Wu, C., Yang, L., Zhang, D., Xiao, Y. Resistance to Nilaparvata lugens in rice lines introgressed with the resistance genes Bph14 and Bph15 and related resistance types. PLoS One. 13 (6), e0198630(2018).
  5. Arora, R., Sandhu, S. Advances in Breeding for Resistance to Hoppers in Rice. Breeding Insect Resistant Crops for Sustainable Agriculture. , Springer. Singapore. 101-130 (2017).
  6. Sarao, P. S., et al. Donors for resistance to brown planthopper Nilaparvata lugens (Stål) from wild rice species. Rice Science. 23 (4), 219-224 (2016).
  7. Horgan, F. Mechanisms of resistance: a major gap in understanding planthopper-rice interactions. Planthoppers: New Threats to the Sustainability of Intensive Rice Production Systems in Asia. Heong, K. L., Hardy, B. , International Rice Research Institute, Asian Development Bank, Australian Government, Australian Centre for International Agricultural Research. 281-302 (2009).
  8. He, J., et al. High-resolution mapping of brown planthopper (BPH) resistance gene Bph27 (t) in rice (Oryza sativa L). Molecular Breeding. 31 (3), 549-557 (2013).
  9. Ling, Y., Weilin, Z. Genetic and biochemical mechanisms of rice resistance to planthopper. Plant Cell Reports. 35 (8), 1559-1572 (2016).
  10. Qi, J., et al. The chloroplast-localized phospholipases D α4 and α5 regulate herbivore-induced direct and indirect defenses in rice. Plant Physiology. , 111(2011).
  11. Qiu, Y., Guo, J., Jing, S., Zhu, L., He, G. High-resolution mapping of the brown planthopper resistance gene Bph6 in rice and characterizing its resistance in the 9311 and Nipponbare near isogenic backgrounds. Theoretical and Applied Genetics. 121 (8), 1601-1611 (2010).
  12. Liu, Y., et al. A gene cluster encoding lectin receptor kinases confers broad-spectrum and durable insect resistance in rice. Nature Biotechnology. 33 (3), 301(2015).
  13. Lou, Y., et al. Differences in induced volatile emissions among rice varieties result in differential attraction and parasitism of Nilaparvata lugens eggs by the parasitoid Anagrus nilaparvatae in the field. Journal of Chemical Ecology. 32 (11), 2375(2006).
  14. Da Silva, A. G., et al. Non-preference for oviposition and antibiosis in bean cultivars to Bemisia tabaci biotype B (Hemiptera: Aleyrodidae). Revista Colombiana de Entomologia. 40 (1), 7-14 (2014).

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