[11C_SNAP-7941] 自动合成和实时动力学评估的技术方面

摘要

在这里,我们代表一个协议,用于对[¹¹C_SNAP-7941 的全自动无线电标记,以及此 PET 跟踪器在 P-gp 表达和非表达细胞上的实时动力学分析。

摘要

正电子发射断层扫描(PET)是一种必不可少的分子成像技术,提供对路径的洞察,并使用特定的靶向放射线进行体内调查。在本协议中,描述了一种强大和可靠的遥控放射性合成[11C_SNAP-7941》,这是黑色素浓缩激素受体1的拮抗剂。放射合成从产生^[11C]CO₂的回旋加速器开始,随后通过气相过渡到 +¹¹C_CH₃OTf 进一步反应。然后,将这种反应性中间体引入前体溶液中,形成相应的放射性追踪器。化学和放射化学纯度通过RP-HPLC确定,在放射性药物质量控制过程中定期实施。此外,摩尔活性的计算,因为它是以下实时动力学研究的必要。此外,对MDCKII-WT和MDCKII-hMDR1细胞应用11C_SNAP-7941,用于评估P-糖蛋白(P-gp)表达对细胞积累的影响。因此,P-gp表达细胞系(MDCKII-hMDR1)在实验前通过P-gp基质(+)-verapamil不使用或带阻塞,结果与野生型细胞的阻滞进行比较。整体实验方法证明了精确时间管理的重要性,这对于使用带有短寿命核素的PET示踪剂放射性标记的每个临床前和临床研究都至关重要,例如碳-11(半寿命:20分钟)。

引言

[¹¹C]SNAP-7941是作为第一个正电子发射断层扫描(PET)示踪剂,针对黑色素浓缩激素受体1(MCHR1) - 一种受体主要涉及食欲和食物摄入量^的中央调节1 。SNAP-7941的碳-11标签,一种特征良好的MCHR1拮抗剂,产生了正宗的PET示踪剂2,3,4,5。然而,全自动放射合成在时间功效和可重复性方面极具挑战性,短寿命放射性核素碳-11提供20^分钟6的半寿命。总合成时间应保持在最低限度,并且根据经验,不应超过2-3个半寿命(即碳-11约40-60分钟)7 。特别是,针对低表达密度的受体系统的放射性追踪器的合成程序必须广泛优化,以获得足够的产量,从而获得高摩尔活性8。合成策略通常遵循回旋加速器内的放射性核素生产,并将 +¹¹C_CO₂释放到合成器。在那里,11 C_CO₂首先降低到 11 C_CH _4,然后通过气相方法^9、10与碘反应,产生 =¹¹C_CH₃I。进一步处理与银三膨胀率 =¹¹C_CH₃OTf 直接在线。之后,将这种活性碳-11标记的中间体引入含有前体分子的溶液中。自动放射合成还涉及半准备RP-HPLC的纯化过程,包括适用于临床前和临床研究的产品的后续配方。

无论放射性核素的半寿命和放射性合成的耗时如何,放射性药物药代动力学是PET示踪剂开发过程中要评估的最关键部分。在神经成像方面,PET追踪器的大脑进入是主要的先决条件。然而,血脑屏障(BBB),大脑的"安全边界",高度表达的排泄物运输器,可以卸载小分子(如PET示踪剂),并有效地阻碍其适用性。

临床前评估的一个巨大缺点是这些排泄物的意外相互作用,这些在体外实验中往往无法识别,并导致PET追踪器在体内失效,如#11 C_SNAP-7941所观察到的。*PET成像在大鼠显示低大脑积累,这大大增加后,P-gp抑制剂塔里基^达尔11。这些数据表明, #¹¹C_SNAP-7941 是这种排泄物传输系统基板,阻碍配体结合到中央 MCHR1.不幸的是,仍然缺乏足够的体外模型,以便能够预测BBB渗透在示踪剂发展的早期阶段。

在这里,我们描述了使用合成器进行碳-11甲基化的自动合成[¹¹C_SNAP-7941。这项工作的重点是概述如何组织连续的实验方法,包括自动合成、质量控制以及具有极短寿命的核素碳-11的连续体外评估。

首先,描述了以最小的时间消耗和最大收益成功进行放射合成的关键步骤。然后,建立一个可靠的质量控制程序,使放射跟踪器可用于潜在的临床研究,并符合欧洲药^典12的标准。摩尔浓度的量化和相应摩尔活性的计算是连续动力学测量的基本要求。

最后,提出了一种新的、直接的体外方法,用于评估=¹¹C_SNAP-7941对外泄物传输器P-gp(hMDR1)的相互作用。建议的动力学模型使用易于操作的设备,允许即时的数据解释,并且需要最少的细胞培养^工作13。

研究方案

注意:在以下协议中涉及多个步骤,需要处理和操作放射性。重要的是,每一步都必须与该研究所的辐射安全部和各自的国家立法机构达成一致。按照 ALARA("尽可能低")原则,相关操作员必须尽量减少电离辐射暴露。

1. 实验的时间管理和规划

注:碳-11的半寿命短,需要精确的时间管理,以尽量减少放射性损失(图1)。任何参与的人必须了解其责任范围和各自行动的时间点。对于设置¹¹C_SNAP-7941 的实时动力学实验,需要四个人左右进行平滑过程。

1. 组织 11C_SNAP-7941 的生产者。
2. 通知质量控制操作员执行规格评估、质量浓度计算和合成开始时间的摩尔活性。
3. 保持实时动力学实验器准备稀释计算和执行实验。
4. 指示跑步者在相应的时间点将放射性转移到相应位置。

2. 自动合成 #¹¹C_SNAP-7941,用于临床前使用

1. 合成器的制备(图2)。
   1. 打开合成器,所需的技术气体(氦气和氢气)和合成器控制软件Tracerlab。选择相应的合成序列捕捉。
   2. 在负载或注入循环废瓶位置时,用水一次、丙酮两次,通过反应器和 HPLC 阀清洗 V1-V3。
   3. 通过喷射阀将所有相关管路干燥进出反应器,并通过V18 激活连续氦流。
   4. 通过V24、V25、V29、V15、V9、V17 和 V32/V33,在 100 mLμmin^-1至 200 °C 的氦流下加热 +¹¹C_CH₃I 陷阱以及 *¹¹C_CH₃OTf 陷阱。
   5. 检查同一通道的泄漏(与附加的反应堆)与氦流100 mLμmin-1。当流量低于 4 mLμmin^-1时,保证密封性。
   6. 打开 HPLC 泵(5-10 mL=min-1),用醋酸酯/水(50/50,v/v)清洗 HPLC 管路和注水阀,以及 HPLC 管路,通过V14 将 HPLC 溶剂清洗到灯泡中。
   7. 通过 V11 和 V12将灯泡通过V19用氦流倒入废瓶中。通过 V11 和 V12再次用V6 中的水冲洗各个管路,并通过V18 用氦流冲洗。
   8. 使用乙醇和 V4 将 V5 用水通过V11 和 V12 用水通过V18 将氦流用氦流倒入产品收集小瓶 (PCV),然后通过 V13 将 PCV通过V13 排入废瓶,并通过V20 将氦流排入废瓶中。
   9. 关闭 HPLC 泵,切换到合成溶剂((醋酸铵(2.5 g*L^-1)/醋酸 97.5/2.5 v/v;pH 3.5)/醋酸石75/25 v/v/v),连接半准备HPLC柱并平衡该列(流量为5 mL=min-1)。
   10. 填充用于合成和纯化的试剂:1.5 mL 水 (V2)、4.5 mL 0.9% NaCl (V4)、0.5 mL 96% 乙醇 (V5)、10 mL 水 (V6) 和 90 mL 水(灯泡)。
   11. 附加一个新的循环废物小瓶;产品小瓶(贴有标签并配有曝气针)至 V13 和液氮。
   12. 预置 SPE(固相提取)盒,具有 10 mL 的 96% 乙醇和 20 mL 的水,并将其安装在 V11 和 V12 之间。
   13. 在开始合成前 20 分钟开始预运行序列,包括将 +¹¹C_CO₂陷阱加热到 400 °C,并通过V27(2 分钟)用 50 mLμmin^-1的氦流冲洗陷井。然后,用氢气(120 mLμmin^-1)预冲洗+¹¹C+CO₂陷阱3分钟,最后冷却至40°C以下。
   14. 在400μL的醋酸酯中溶解1毫克前体(用于DNA合成,<10 H₂O),将溶液转移到反应中,并加入5.5 μL的TBAH(甲醇中的264mgμmL-1)。将反应器连接到其各自的位置。
   15. 关闭热电池并在热电池的压力下打开。
   16. 确认液氮至-75°C的CH₄疏水阀冷却过程的开始。
   17. 达到温度时释放放射性。
2. 回旋加速器生产 #¹¹C_CO₂
   注:步骤2.2.1-2.2.4同时用于准备放射合成模块(参见图1)。
   1. 打开回旋加速器的磁铁。
   2. 选择目标¹¹C-CO₂并启动光束65 μA。
   3. 通过按下"开始辐照"按钮确认辐照的开始
   4. 在达到所需的放射性量(约120GBq后30分钟)后,按下按钮"传递",停止光束并确认放射性释放到合成器中。
3. 全自动放射性合成的执行
   1. 确认系统已准备好接收放射性并启动自动化流程
   2. 监视以下自动化过程。
      1. 检查是否通过V26(约 4 分钟)从回旋加速器自动将 11 C+CO₂转移到合成单元,以及^[11C]CO₂是否被困在以镍作为催化剂浸渍的分子筛上(*¹¹C_CO₂陷阱)在室温下。
      2. 跟踪是否首先用氦气(50 mLμmin-1)自动冲洗 11 C_CO₂陷阱,然后用氢气(120 mL=min-1 ) 进行冲洗。然后,观察 V27 和 V25 关闭,将包含氢气的被困 11 C_CO₂加热到 400 °C,并将形成的 [¹¹C_CH₄进一步传输到预冷却的 ]¹¹C_CH₄陷阱和被困在那里。
      3. 监测 V10 关闭、V9 打开(朝碘柱)和 #¹¹C_CH₄再次释放,将 ±¹¹C_CH₄陷阱缓慢加热到 80°C,并通过氦流输送到循环单元V10(排气出口)。并进一步检查 [¹¹C_CH₄是否转换为循环单元内的 11 C_CH₃I,持续约 3 分钟,形成 [11 C_CH₃I] 连续被困在[11 C]CH₃I 陷阱。
      4. 确保排气阀 V16 已打开,并且通过V24 将 11 C_CH₃I 陷阱加热至 90°C,并带有氦流 (20 mLμmin^-1)。因此,可能会删除可能副产品,然后关闭 V16。
   3. 确认 11C_CH₃I 已准备好释放到反应器中。
   4. 监控以下自动化过程:检查^[11C_CH₃I I 陷阱是否加热到 190 °C],以及形成 [¹¹C_CH₃I]是否通过+¹¹C_CH₃OTf 陷阱(V32 和 V33,仍在 200 °) 释放到反应器中。C)、V7 和 V8 在连续氦流下(10-25 mLμmin^-1, V24)。在此过程中,V21 和 V23(排气出口)必须打开。
   5. 确认放射性到达反应堆,一旦反应堆中的放射性量不再升高。
   6. 监控以下自动化流程,并在必要时准备手动干预
      1. 检查 V23、V21 和 V8 是否自动关闭,并将反应混合物加热到 75°C。3分钟后,观察反应器是否用液氮冷却,直到温度低于35°C。随后,确保反应混合物通过V2用1.5 mL水淬火。在此过程中,V21 和 V23(排气出口)必须打开。
      2. 跟踪 V21 和 V23 是否关闭,反应混合物通过流体检测器传递到 HPLC 环路 (5 mL) 后传输到 HPLC 喷射阀。跟踪反应混合物是否自动注入 HPLC 柱。
   7. 观察色谱图,并通过按钮峰值启动手动切割产品峰值。当产品峰值信号在大约 8-10 分钟(流量:5 mL=min-1,图 3) 后,当产品峰值信号降至约 400 cps 以下时,按峰值结束。
   8. 打开额外的氦流以加速灯泡排空。
   9. 监控灯泡是否正在排空并观察废瓶:通过 V11、SPE 墨盒和 V12 检查灯泡是否通过V19 和额外的氦流排入废物中,以及产品是否保留在 SPE 墨盒上。
   10. 确认灯泡完全清空。
   11. 监控SPE纯化和产品转移的自动化过程
       1. 检查 SPE 墨盒是否通过V6、V11 和 V12 将 10 mL 水洗入废物中,以及乙醇是否通过V5、V11 和 V12 将产品渗入 PCV。最后,观察是否通过V4、V11 和 V12 将 0.9% NaCl 添加到 PCV 中以稀释产品。
       2. 确保产品溶液通过 V13 和无菌过滤器通过V20 通过氦流传输到最终产品小瓶中。
   12. 确认产品已完全转移。

3. 质量控制 (QC)

注:放射性药物的质量控制包括测量以下参数:

• 放射性化学纯度和摩尔活性(RP-HPLC)
• 残留溶剂(气相色谱,GC)
• 渗透性(蒸汽压力渗透仪)
• pH(pH-米)
• • 光谱/放射性核素纯度(*光谱仪)
• 半寿命/放射性核素纯度(剂量校准器)

所有物理化学参数在产品发布前确定,且值必须位于定义的质量参数范围内。

1. 质量控制设备的制备
   1. 在合成结束前 30 分钟开始准备。
   2. 在铅屏蔽容器中制备锥形小瓶,用连接的针头制备 1 mL 屏蔽注射器。
   3. 为HPLC在水中制备SNAP-7941(10μgμmL-1)的参考标准溶液。
   4. 打开 pH 计、气体色谱仪和用过的气体、渗透仪和 HPLC 的所有组件。
   5. 打开 HPLC 控制软件,并选择专用列和相应的方法,用于 +¹¹C_SNAP-7941(移动相:(水/醋酸 97.5/ 2.5 v/v/v;2.5 g.L^-1醋酸铵;pH 3.5)/醋酸 70/30 v/v;流量:1 mLμm^-1)并编写一个包含两个测量值(标准和产品)的示例列表。启动列的调理方法。
   6. 在10分钟的调理后,用汉密尔顿注射器注射20μL的SNAP-7941参考溶液,然后开始分析运行。
   7. 注射后用醋酸酯和水清洗汉密尔顿注射器两次。
   8. 启动 GC 控制软件并编写示例列表。
2. 执行质量控制
   1. 在合成结束后测量产品的绝对放射性产量,并将产品的 100 μL 转移到反应小瓶中,使用制备的铅屏蔽注射器进行质量控制。
      注:从质量控制获得的所有数据必须按照国家法规进行记录。
   2. 分析HPLC:测量放射化学纯度和化学纯度,并立即将结果通知细胞培养实验的负责人。
      1. 抽取 40 μL 的 QC 样品,然后注入 HPLC。通过将喷射阀的臂从负载移到喷射(图 3 )开始运行。
         注:在运行期间(8 分钟),可以执行协议的其他测量,以避免尽可能多的衰减。
      2. 打开色谱图,并将放射性通道中的所有峰值集成在一起。将产品的保留时间(5.0-7.0 分钟)与参考标准的保留时间进行比较。以所有集成峰值的百分比比较曲线下的面积。产品峰值必须超过总集成区域(无线电通道)的 95%(放射化学纯度)。
      3. 将信号集成在紫外线通道中,以确定化学纯度。主要杂质通常是前体SNAP酸,在2.8-3.5分钟。在集成后,从校准曲线计算了 _^natC_SNAP-7941 的浓度。计算[mol_mL-1]中SNAP-7941的浓度,并通过以下方程确定摩尔活性:
         
   3. 对于气相色谱,将 20 μL 的质量控制样品转移到专用玻璃瓶中。将其放入自动进样器,然后开始测量。测量完成后,打开色谱图并记下自动集成峰的数量。样品中不应含有超过410ppm的乙酰乙酰乙激起比和10%的乙醇。
   4. 渗透性:在专用空心上放置一个纸样盘,并应用10μL的样品。按"关闭"按钮可测量渗透性。3分钟后,设备显示必须在190-500莫斯米-kg-1范围内的渗透性。
   5. pH:用水清洗电极。将电极放入样品中,测量 pH 值。pH 必须在 5.0-8.5 的范围内。测量后再次清洗电极,并将电极置于参考 pH 溶液中。
   6. * 光谱:将QC样品放入α光谱仪中,打开控制软件并开始测量。停止测量并记下测量能量必须为 511 keV(范围 420-520 keV)。打开文件菜单,用相应的批号保护文件。回忆专用软件中保存的频谱并打印频谱。
   7. 半寿命:使用剂量校准器测量QC样品的活性两次。记下各自的时间并计算指数的半寿命。
3. 释放
   1. 对所有参数进行了测试,结果符合奥地利当局的准则后,释放放射跟踪器。操作员必须签署数据的正确性。

4. 评估对P-gp运输机的相互作用

1. 细胞培养
   1. 启动工作台的层压气流 (LAF),并在开始工作前至少 15 分钟清洁工作台。
   2. 在 LAF 的无菌条件下,将细胞培养基与 10% 的 FCS (50 mL) 和 0.5% 的抗生素 (2.5 mL) 与使用自动移液辅助剂的无菌体积移液器混合。
   3. 在无菌条件下(LAF)实验前10-14天,在T75或T175细胞培养瓶中解冻MDCKII-hMDR1和MDCKII-WT细胞。
   4. 第二天更换培养基以去除所有非粘附细胞和凋亡细胞。
   5. 每三天用新鲜介质更换一次介质(T75 和 23 mL 分别用于 T175 细胞培养瓶的 12 mL)。
   6. 根据实验的时间安排将细胞分裂成新鲜烧瓶或细胞培养皿,在汇合80%时避免双层生长。
2. 用于实验的细胞制备
   1. 在实验前两天将细胞分裂,并在细胞培养皿的斜面中分粒,浓度为每2 mL2.5 x 10⁵细胞(图4)。使用自动细胞计数器装置或 Neubauer 计数室对细胞进行计数并计算适当的拆分比率。
   2. 在实验前一天取出培养基,用4mL的DPBS清洗培养盘上的细胞,并加入新鲜的5 mL细胞培养基。将盘子水平放在培养箱中。
   3. 在实验前用DPBS清洗细胞至少0.5小时,用2mL的FBS自由培养基代替。用显微镜检查汇合和细胞形态。
3. 在三种不同的设置中执行实验。
   1. 使用培养皿进行 4.2.3 中所述的实验。
   2. 在使用10μM(+)-盐酸二甲苯的实验前,将细胞处理0.5小时。
   3. 在 DMSO 中加入 0.98 μL 的维拉帕米尔库存溶液(20.4 mM (+)-盐酸二甲)。最终DMSO含量在治疗过程中为±0.05%。
   4. 使用车辆控制 (DMSO) 孵育细胞 0.5 小时。使用与药物治疗相同的体积。
4. 实时测定的实验(所有三个设置)
   1. 打开设备、计算机并确保它们正确连接,然后打开控制软件。
   2. 选择"一个目标"选项,解锁模板并调整以下设置:
      职位数: 2 (2)
      检测时间(秒):3 (3)
      检测延迟时间(s):2 (2)
      第一阶段的名称:基线
   3. 将细胞培养皿插入设备的倾斜支架中,确保细胞杆位于底部,并覆盖细胞培养基。
   4. 通过"开始"按钮启动运行。系统要求保存文件。选择文件名和保存路径。控制中心弹出,基线测量开始(细胞培养皿支撑开始旋转)。
   5. 在"其他选项"下选择:
      时间刻度:分钟
      核素校正:碳-11
   6. 检查图形中曲线下的所有框(背景(红色)、目标(蓝色)和目标减去背景(黑色)。
   7. 获得质量控制参数:摩尔活性[GBq.βmol-1]和活性浓度[MBq.mL-1]在合成结束时。
   8. 在 2 mL 的测定体积中计算15 nM 的 15 nM 的相应示踪量。
      
      
   9. 在铅屏蔽中,将移液器准备到相应的体积和 +¹¹C_SNAP-7941 产品的等分。
   10. 单击"暂停"在控制中心窗口中运行。等待,直到盘旋转停止和边栏与标题暂停和下一阶段发生。
   11. 打开实时动力学装置的盖子。将培养盘支架向左转动 90°。添加已计算的示踪量并返回初始位置。然后,关闭设备的盖子。立即按"继续"按钮以启动实验。
   12. 20 分钟后通过选择暂停并随后终止运行(按侧栏中的"结束"运行)结束实验。
5. 使用统计软件进行数据分析和处理
   1. 打开实时控制软件。单击"打开文件"以调用所需的动力学。动力学在控制中心窗口中进行说明。
   2. 通过右键单击直接选择动力学导出曲线。保存包含原始数据的文本文件。打开统计程序,粘贴实时实验的原始数据文件。
   3. 从添加无线电跟踪器的时间(x 轴)开始(不包括背景测量),并规范化为最大 CPS 的百分比信号(每秒计数)。
   4. 将所有规范化数据加载到新的 GraphPad 棱镜文件中。
   5. 计算平均值和标准偏差。
   6. 将获得的数据描述为图表,显示所有三个设置的示踪剂摄取的偏差(增加率)。

结果

*¹¹C_SNAP-7941 的全自动放射合成产生了 5.7 ± 2.5 GBq(EOB 为 4.6 ± 2.0%,基于 11C_CH₃OTf; n = 10) 配方产品,为 14.9 ± 5.9%。总体合成持续约40分钟,其中15分钟需要通过气相法制备11 C_CH₃OTf,另外5分钟需要前体的放射性标记,然后是10分钟的半制备RP-HPLC 纯化,10 分钟用于 C18 盒式固相提取和配方。然后,将一个小等分(约100-200μL)交付给负责质量控制的人员,而含有即用型示踪剂的原始产品小瓶则传递给实时动力学分析的实验者。

质量控制在合成结束后10分钟内完成。摩尔活性在72~41GBq/μmol(n = 10)的范围内,放射化学纯度始终大于95%。所有其他参数(pH、渗透性、残留溶剂)均符合释放标准。对于实时动力学测定,选择三种不同的实验设置:(A)处理和未处理(车辆)MDCKII-WT细胞,(B)未处理或用车辆MDCKII-hMDR1细胞处理,(C)后者的细胞系在实时前阻塞使用 (+) -verapamil 对传输器的动力学测定。将¹¹C_SNAP-7941 应用于野生型细胞系 MDCKII-WT(P-gp 非表达)和 MDCKII-hMDR1(P-gp 表达)显示不同的动力学行为,因为野生型细胞系的快速累积,而未观察到累积用于 MDCKII-hMDR1 细胞。然而,用(+)-verapamil阻断MDCKII-hMDR1细胞中的P-gp排流传输器,导致与野生型细胞系类似的实时动力学(图5)。

图 1:工作流概述。流式放射合成、质量控制以及实时动力学测量性能^为#11C_SNAP-7941。黑色箭头表示放射性的传输方式。请点击此处查看此图的较大版本。

图2:自动合成器的放射合成方案。自动合成器的开关电路,从循环单元开始,为11C_CH₃I/*¹¹C_CH₃OTf生产,反应器用于将活性引入前体溶液和SPE纯化(SPE |固相萃取;PCV = 产品收集小瓶)。请点击此处查看此图的较大版本。

图3:[11 C_SNAP-7841]全自动放射合成的代表性色谱图。半准备RP-HPLC色谱在顶部说明,在底部纯化后分析。请点击此处查看此图的较大版本。

图4:细胞培养皿制备实时实验。步骤 1 包括 2.5 x 10⁵到 1 x 10⁶的种子,具体取决于细胞类型及其生长速率。随后,培养皿被放置在倾斜平面(约30-45°)。因此,提供的金属装置或细胞培养皿的盖子可用于培养箱,以稳定培养皿的倾斜位置。后天(24小时),盘水平调整,并添加新鲜的细胞培养培养基,以完全覆盖细胞表面。在实验当天,检查细胞的生存能力和汇合。根据实验方案,细胞用DPBS清洗,培养基被无血清培养基(2 mL)取代,培养皿重新定位到倾斜位置,直到实验开始。从此以后,细胞可以用抑制剂或车辆进行治疗。请点击此处查看此图的较大版本。

图5:对 +¹¹C_SNAP-7941 的实时动力学测量。^*11C_SNAP-7941的代表性实时动力学在三个不同的设置中显示:使用MDCKII-WT单元;MDCKII-hMDR1细胞预阻塞,预封为(+)-维拉帕米尔作为P-gp抑制剂,MDCKII-hMDR1细胞无阻塞。y轴说明了预阻塞的MDCKII-hMDR1和WT细胞与未经处理或车辆处理的MDCKII-MDR1细胞结果相比的增长率(无接受率,0%)。请点击此处查看此图的较大版本。

讨论

^*11C_SNAP-7941的放射合成是在一个商业合成模块上建立的。由于有可能完全自动化制备程序,放射性合成证明是可靠的,并且对操作员的辐射防护进行了改进。合成器的制备对放射跟踪器的质量有巨大的影响,特别是在摩尔活性方面。因此,必须在惰性条件下(例如氦气)下不断工作,并冲洗位于反应容器之前的所有生产线(目标线、11 C_CH₃I 生产周期和反应器(见图2)。此外,在合成开始之前加热各自的陷阱和烤箱,以去除水分和大气碳,可有利地增加摩尔活性。特别是AgOTf柱,浸渍石墨化碳,对湿度极其敏感。即使是少量的任何水分源也会干扰 11°C_CH₃I 到 +¹¹C_CH₃OTf 的转换。在开始合成之前,必须再次将 +¹¹C_CO₂陷阱和 +¹¹C_CH₃I I 陷阱冷却至室温,以便启用后续陷印。此外,建议在开始合成前不久溶解前体,并将基体直接添加到前体溶液中。

碳-11放射性跟踪器的质量控制必须合理设计,以便持续快速的工作流程。然而,细胞培养研究最重要的参数是放射化学纯度和摩尔活性,以获得有效的结果。正确评估摩尔活性需要可靠的分析 HPLC 方法,校准曲线必须覆盖最终产品的浓度范围。放射性追踪器的挑战部分是达到浓度超过定量(LOQ)极限,由于少量,在放射性合成过程中产生。因此,艺术是找到高摩尔活动之间的平衡,以避免受体饱和和足够高的浓度,仍然能够量化非放射性信号。

[¹¹C]SNAP-7941被确认为人类P-gp运输机的强效基质,因为未经处理或车辆处理的MDCKII-hMDR1细胞中未观察到快速排泄物的积累。相比之下,两个实验设置(MDCKII-WT或预阻塞的MDCKII-hMDR1细胞)都提供了类似的结果(积累11C_SNAP-7941),支持这种体外测定的多功能性。MDCKII-hMDR1细胞由于具有稳定的转染、快速生长和持续抗旋转细胞培养皿引起的剪切应力,因此非常适用于利格特跟踪器实验。因此,大鼠和小鼠大脑中缺乏11C_SNAP-7941的摄入量可能是通过P-gp传输器的排泄物引起的。由于犬肾细胞与人多药抗性蛋白1(hMDR-1,P-gp)的转染,该方法在人身上的排泄物结合的预测价值较高,有利于未来的临床应用。然而,到目前为止,对其他排泄物的选择性尚未得到证实。因此,可以使用其他细胞系,表达不同的突出的排泄物输送剂作为乳腺癌抗性蛋白(BCRP)或多重抗性蛋白-1(MRP-1),以研究对这些转运体的相互作用。该方法与经典积累或运输测定方法比较简单,可立即产生定性结果。此外,最大的优点是,与使用间接定量(主要是位移)的传统实验相比,该技术能够实时评估PET示踪剂和目标的直接相互作用。此外,实时辐射测定软件提供实验灵活性(例如,核素衰变校正、测量时间和位置等),因此,用户具有较高的自由度。另一方面,该方法的局限性包括样品吞吐量低,因为一次只能测量一个细胞盘。此外,还应考虑其他一些技术和业务问题:所述技术对背景辐射非常敏感;因此,辐射源应保持距离,在实验前应重点进行背景测量。在比室温更高的温度下进行实验的另一个问题是倾斜支架的加热:细胞培养基的蒸发可能会影响探测器。整个设备最好放在孵化器中,而不是加热。此外,该方法仅限于附着细胞系。通过细胞培养皿的旋转,剪切应激细胞可能从培养皿中分离出来,从而导致无效结果。

然而,如果实验者注意这些小缺点,该方法为临床前PET示踪剂的动力学行为分析提供了快速可靠的结果。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941
Ni catalyst	Shimadzu, Kyoto, Japan		Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh
Iodine	Merck, Darmstadt, Germany		1.04761.0100
Acetonitrile	Merck, Darmstadt, Germany		for DNA synthesis, < 10 ppm H2O
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
Ammonium acetate	Merck, Darmstadt, Germany
Acetic acid	Merck, Darmstadt, Germany		glacial
Ethanol	Merck, Darmstadt, Germany		96%
NaCl	B. Braun, Melsungen, Germany		0.9%
Tetrabutylammonium hydroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Methanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
SPE cartridge	Waters, Milford, MA, USA		SepPak C18plus
Semi-preparative RP-HPLC column	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm
Precolumn	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm
Precursor	University of Vienna, Austria		SNAP-acid
Reference compound	University of Vienna, Austria		SNAP-7941
Silver trifluoromethanesulfonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Graphpa GC	Alltech, Deerfield, IL, USA		80/100 mesh
PET trace 860 cyclotron	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
[11C]CO2 high pressure target	Air Liquide, Vienna, Austria
TRACERlabFX2 C	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
N2 + 1% O2	Air Liquide, Vienna, Austria		Target gas
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941.
Merck Hitachi LaChrom, L-7100	Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria)		HPLC pump
Merck Hitachi, L7400	Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan)		UV-detector
NaI-radiodetector	Raytest (Straubenhardt, Germany)		NaI-radiodetector
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm	Merck (Darmstadt, Germany)		HPLC column
430-GC	Bruker (Bremen, Germany)		Gas chromatograph
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm	SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia)		Gas capillary
Wesco, osmometer Vapro 5600	Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria)		Osmometer
g-spectrometer			g-spectrometer
Gas chromatography controlling software	VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A)		Galaxie Version 1.9.302.952
Gamma spectrometer controlling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Maestro for windows Version 6.06
Gamma spectrum recalling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Winplots version 3.21
HPLC controlling software	Raytest (Straubenhardt, Germany)		Gina Star Version 5.9
inolab 740	WTW (Weilheim, Germany)		pH meter
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941.
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1)
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Wildtype (WT)
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
Fetal Calf Serum (FCS)	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 10270-106
Penicillin/Streptomycin	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 15140
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
In vitro experiments
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
(±)-Verapamil hydrochloride	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)
DMSO	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)		276855-100 mL
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
Sterile disposable plastic pipettes	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Sterilin, 5 mL – 25 mL
Sterile pipette tips	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL
Cell culture flasks	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175
LigandTracer control Version 2.2.2	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer Yellow	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer White	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
GraphPad Prism 6.0	GraphPad Software, Inc.
Handheld automated Cell Counter	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter (Cat.No. PHC00000)
Cell Counter Sensors	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050)