היבט טכני של סינתזה אוטומטי הערכה בזמן אמת קינטי של [11ג] הצמד-7941

Summary

כאן, אנו מייצגים פרוטוקול עבור הרדיו האוטומטי לחלוטין של [¹¹ג] הצמד-7941 וניתוח של קינטיקה בזמן אמת של זה PET-מעקב על P-gp הבעת תאים שאינם ביטוי.

Abstract

טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) היא טכניקת דימות מולקולרי חיוני המספקת תובנות למסלולים ושימוש ברדיולירים ממוקדים ספציפיים עבור חקירות vivo. בתוך פרוטוקול זה, חזק ואמין מרחוק מבוקרת רדיוסינתזה של [¹¹ג] הצמד-7941, היריב הורמון ריכוז מלנין ההורמון 1, מתואר. הרדיוסינתזה מתחיל עם ציקלוטרון המיוצר [¹¹ג] CO₂ כי מאוחר יותר הגיב באמצעות מעבר שלב הגז ל [¹¹ג] CH₃otf. אז, זה ביניים תגובתי הוא הציג את הפתרון הקודמן וצורות מעקב הרדיו המתאים. כימיקלים, כמו גם הטוהר הרדיוכימית נקבעים באמצעות מכשירי הradiopharmaceutical, המיושמת באופן שגרתי בתהליך השליטה באיכות מעולה. בנוסף, הפעילות הטוחנת מחושבת כפי שהוא הכרח עבור החקירות הבאות בזמן אמת הקינטי. יתר על כן, [¹¹ג] SNAP-7941 מוחל על MDCKII-WT ו Mdckii-hMDR1 תאים להערכת ההשפעה של p-גליקופרוטאין (p-gp) הביטוי על הצטברות תאים. מסיבה זו, P-gp ביטוי קו התאים (MDCKII-hMDR1) הוא משמש ללא או עם חסימה לפני ניסויים באמצעות המצע P-gp (±)-verapamil ואת התוצאות מושווה אלה שנצפו על התאים wildtype. הגישה הניסיונית הכוללת ממחיש את החשיבות של ניהול זמן מדויק, כי הוא חיוני עבור כל מחקר טרום קליני וקליני באמצעות המשדרים לחיות מחמד רדיאולבטיים עם nuclides קצר, כגון פחמן -11 (מחצית חיים: 20 דקות).

Introduction

[¹¹ג] SNAP-7941 התפתח כטומוגרפיה פליטת פוזיטרון הראשון (PET)-מעקב מיקוד המלנין-ריכוז קולטן הורמון 1 (MCHR1)-קולטן מעורב בעיקר בוויסות המרכזי של תיאבון וצריכת מזון¹. פחמן -11 תוויות של SNAP-7941, יריב מאופיין היטב MCHR1, הניב את מעקב המחמד אותנטי^2,3,4,5. עם זאת, רדיוסינתזה אוטומטית לחלוטין הוא מאוד מאתגר במונחים של יעילות הזמן והשדועות עם הפחמן הקצר החיים הרדיו -11 מציע מחצית חיים של 20 דקות⁶. זמן סינתזה הכולל צריך להישמר למינימום, וככלל האגודל לא צריך לחרוג 2-3 מחצית חיים (כלומר, סביב 40-60 דקות עבור פחמן -11)⁷. במיוחד, הליכי סינתזה עבור רדיומשדרים לפילוח מערכות הקולטן עם צפיפויות ביטוי נמוך חייב להיות ממוטב בהרחבה כדי לקבל תשואות מספיקות וכתוצאה מכך פעילות טוחנת גבוהה⁸. האסטרטגיה הסינתטית מלווה לעתים קרובות את ייצור רדיונוקלידה בתוך ציקלוטרון ושחרורו של [¹¹ג] CO₂ לסינתיסייזר. שם, [¹¹ג] CO₂ מופחת לראשונה ל^[11ג]_{ch 4} ולאחר מכן הגיב עם יוד כדי להיכנע [¹¹ג] ch₃אני דרך השיטה בשלב הגז^9,10. טיפול נוסף עם תשואות triflate כסף [¹¹ג] CH₃otf ישירות מקוון. לאחר מכן, זה הפחמן התגובתי-11 ביניים המסומנת מוצג פתרון המכיל את המולקולה הקודמן. רדיוסינתזה אוטומטית בנוסף כרוך תהליך טיהור עם למחצה המוכן RP-כולל הניסוח הבאים של המוצר מתאים למחקרים פרה-קליניים וקליניים.

ללא קשר למחצית החיים של רדיונוקלידה ומאמץ הזמן של הרדיוסינתזה, הפרמקוקינטיות של radiopharmaceutical הוא החלק הקריטי ביותר להיות מוערך במהלך פיתוח מעקב PET. במונחים של דימות מוחי, כניסת המוח של מעקב PET היא תנאי הקדם העיקרי. עם זאת, מכשול המוח בדם (BBB), "גבול אבטחה" של המוח, מבטא במבטא מאוד מובילים שיכולים לפרוק מולקולות קטנות (כגון מחסומי PET) ולעכב ביעילות את הישימות שלהם.

חיסרון ענק במהלך הערכה טרום קלינית הם אינטראקציות בלתי צפויות לקראת מובילי האפלוקס האלה, אשר לעתים קרובות לא מוכרים בניסויים בתחום החוץ ומובילים לכישלון של מעקב PET ב vivo, כפי שנצפתה עבור [¹¹ג] הצמד-7941. μPET הדמיה בחולדות הפגינו הצטברות המוח נמוך, אשר גדל באופן דרמטי לאחר הממשל של P-gp מעכבי מעכב¹¹. נתונים אלה הראו כי [¹¹ג] הצמד-7941 הוא מצע של מערכת טרנספורטר זה מחזיק לפני ליגקס וקשירה למרכז MCHR1. למרבה הצער, יש עדיין היעדר מספיק מודלים מחוץ לתחום המאפשר חיזוי החדירה BBB בשלב מוקדם של פיתוח מעקב.

כאן, אנו מתארים את הסינתזה האוטומטית של [¹¹ג] הצמד-7941 באמצעות סינתיסייזר עבור מתיכי פחמן -11. הדגש של עבודה זו הוא לתת סקירה על איך לארגן גישה ניסיונית רציפה כולל סינתזה האוטומטי, בקרת איכות, כמו גם הערכה מחוץ למבחנה עם הפחמן הקצר מאוד החיים-11.

ראשית, מתוארים צעדי המפתח לרדיוסינתזה מוצלחת עם הוצאות זמן מינימליות ותשואה מירבית. לאחר מכן, הליך אמין בקרת איכות מוגדר להפוך את מעקב הרדיוזמין למחקרים קליניים פוטנציאליים לפגוש את הקריטריונים של הפרמקופיאה האירופית¹². קוונפיקציה של ריכוז מולרי וחישוב של פעילות טוחנת המתאימים היא דרישה חיונית עבור מדידות קינטית רצופים.

לבסוף, מוצג חדש וישיר בשיטת הפריה חוץ גופית [¹¹ג] SNAP-7941's האינטראקציה כלפי המשלח המעלוקס, P-Gp (hMDR1). מודל קינטי המוצע משתמש קל לטפל המכשיר המאפשר פרשנות נתונים מיידית ודורש תרבות התא מינימלי מאמץ¹³.

Protocol

התראה: בפרוטוקול שלהלן מעורבים מספר צעדים שדורשים טיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. חשוב כי כל צעד הוא בהסכמה עם מחלקת בטיחות הקרינה של המכון ואת המחוקק הלאומית המתאימים. זה חובה למזער את החשיפה לקרינה מייננת עבור המפעילים מעורבים בעקבות ALARA ("נמוך ככל השגה") עיקרון.

1. ניהול זמן ותכנון הניסוי

הערה: מחצית החיים הקצרים של פחמן -11 דורש ניהול זמן מדויק כדי למזער את אובדן הרדיואקטיביות (איור 1). חשוב כי כל אדם מעורב יודע את תחום האחריות שלהם ואת נקודת הזמן של הפעולה המתאימה. עבור הגדרת ניסוי קינטי בזמן אמת של [¹¹ג] SNAP-7941, סביב ארבעה אנשים נחוצים עבור תהליך חלק.

1. ארגן מפיק עבור [¹¹ג] SNAP-7941.
2. ליידע את מפעיל בקרת האיכות ביצוע הערכת המפרט, חישוב של ריכוז המוני ופעילות טוחנת של זמן ההתחלה סינתזה.
3. להחזיק את הניסוי הקינטי בזמן אמת מוכן החישוב דילול וביצוע הניסויים.
4. הנחה את האצן להעברת הרדיואקטיביות למקום המתאים בנקודת הזמן המתאימה.

2. סינתזה אוטומטית של [¹¹ג] הצמד-7941 עבור שימוש קדם-קליני

1. הכנת הסינתיסייזר (איור 2).
   1. הפעל את הסינתיסייזר, גזים טכניים נדרשים (הליום ומימן) ואת תוכנת בקרת הסינתיסייזר Tracerlab. בחר את ההצמדה של רצף הסינתזה המתאים.
   2. לשטוף V1-V3 פעם עם מים ופעמיים עם אצטון באמצעות הכור שסתום השסתומי או על עומס או להזריק מיקום לתוך בקבוק פסולת לולאה.
   3. יבש את כל הקווים המשויכים לתוך ומחוץ הכור דרך שסתום ההזרקה עם זרימת הליום רציפה מופעל באמצעות V18.
   4. מחממים את [¹¹ג]_{ch 3}אני מלכודת, כמו גם את [¹¹ג] ch₃otf מלכודת תחת זרם הליום של 100 ML · min^-1 עד 200 ° c דרך V24, V25, V29, V15, V9, V17 ו V32/V33 עם הכור הפרטי.
   5. בדוק את אותו מסלול עבור דליפות (עם הכור המצורפת) עם תזרים הליום של 100 mL · min^-1. האטימות מובטחת כאשר הזרם נופל מתחת 4 mL · min^-1.
   6. הפעל את המשאבה (5-10 mL · min^-1) ושטוף את קווי האבחנת ושסתום ההזרקה עם המים (50/50, v/v), כמו גם את קווי הV14 באמצעות הממיסים דרך לתוך הנורה.
   7. רוקן את הנורה דרך V11 ו רובוטית v12 לתוך בקבוק פסולת עם זרם הליום דרך V19. שטוף את הקווים המתאימים עם מים מתוך V6 שוב דרך V11 ו רובוטית v12 עם זרם הליום דרך V18.
   8. לשטוף V5 עם אתנול ו V4 עם מים דרך V11 ו רובוטית v12 לתוך בקבוקון אוסף המוצר (pcv) באמצעות זרם הליום דרך V18, ואז לרוקן את pcv דרך V13 לבקבוק פסולת עם זרם הליום דרך V20.
   9. לכבות את המשאבה, לעבור לממס לסינתזה ((2.5 g · L^-1)/97.5 חומצה אצטית/2.5 v/v; pH 3.5)/מיקוד 75/25 v/v), לצרף את העמודה למחצה ה, ליצירת משקל העמודה (זרימה של 5 מ"ל · min^-1).
   10. למלא את הריאגנטים לסינתזה וטיהור: 1.5 mL של מים (V2), 4.5 mL של 0.9% הנאל (V4), 0.5 mL של 96% אתנול (V5), 10 מ ל מים (V6), ו-90 mL של מים (נורה).
   11. לצרף בקבוקון פסולת חדשה לולאה; בקבוקון מוצרים (מתויג ומצויד במחט מרססים) עד V13 והחנקן הנוזלי.
   12. תנאי מקדים (מיצוי שלב מוצק) מחסנית עם 10 מ ל של 96% אתנול ו 20 מ ל של מים ולצרף אותו בין V11 ו רובוטית v12.
   13. להתחיל את רצף טרום ההפעלה 20 דקות לפני תחילת הסינתזה, המורכב מחמם את [¹¹ג] CO₂ השמנה ל 400 ° c ו לרוקן את המלכודת עם זרם הליום של 50 mL · min^-1דרך V27 (2 דקות). אז, מראש ריקון [¹¹ג] CO₂ המלכודת עבור 3 דקות עם גז מימן (120 mL · min^-1) ולבסוף להתקרר למטה 40 ° c.
   14. התמוססות 1 מ ג של המבשר ב 400 μL של acetonitrile (עבור סינתזה DNA, < 10 H₂O), להעביר את הפתרון לתגובה ולהוסיף 5.5 ΜL של tbah (264 Mg · mL^-1 ב מתנול). . חברו את הכור למיקומו המתאים
   15. סגרו את התא החם והפעילו את הלחץ של התא החם.
   16. אשר את התחלת תהליך הקירור של מלכודת CH₄ עם חנקן נוזלי ל-75 ° c.
   17. שחררו את הרדיואקטיביות כאשר הטמפרטורה מתמלאת.
2. הייצור ציקלוטרון של [¹¹ג] CO₂
   הערה: צעדים 2.2.1-2.2.4 מתנהלים בו להכנת מודול הרדיוסינתזה (ראה גם איור 1).
   1. תדליק את המגנט. של הציקלוטרון
   2. בחר את היעד ¹¹C-CO₂ ולהתחיל את הקרן 65 μa.
   3. לאשר את התחלת ההקרנה על ידי דחיפת לחצן להתחיל הקרנה
   4. לעצור את הקרן ולאשר את שחרורו של רדיואקטיביות לתוך הסינתיסייזר על ידי דחיפת לחצן המסירה, לאחר הכמות הרצויה של רדיואקטיביות הוא הגיע (כ. 120 GBq לאחר 30 דקות).
3. ביצוע הרדיוסינתזה האוטומטית
   1. ודא שהמערכת מוכנה לקבל את הרדיואקטיביות ולהתחיל את התהליך האוטומטי
   2. ניטור התהליך האוטומטי הבא.
      1. בדוק אם [¹¹ג] CO₂ מועבר באופן אוטומטי מן הציקלוטרון לתוך יחידת סינתזה דרך V26 (כ. 4 דקות) וכי [¹¹ג] co₂ הוא לכוד על המסננת המולקולרית ספוג עם ניקל כזרז ([ מיכל בן ¹¹ C] CO₂ השמנה) בטמפרטורת החדר.
      2. מעקב אם את [¹¹ג] CO₂ המלכודת הוא רוקן באופן אוטומטי ראשון עם הליום (50 mL · min^-1) ולאחר מכן עם גז מימן (120 ml · min^-1). אז, לשים לב כי V27 ו V25 סגורים ו לכוד^[11ג]_{CO 2} כולל את גז המימן הוא מחומם 400 ° c ושנוצר [¹¹ג] ch₄ הוא מועבר נוסף אל הקירור מראש [¹¹ג] ch₄ . מלכודת ולכודה שם
      3. הצג כי V10 סגור, V9 נפתח (לקראת הטור יוד) ו [¹¹ג] ch₄ שוחרר שוב על ידי חימום את [¹¹ג] ch₄ המלכודת לאט ל 80 ° c ומועבר לתוך יחידת מחזור עם זרם הליום דרך V10 (יציאת פליטה). ובדוק אם [¹¹ג] ch₄ מומר ל [¹¹ג] ch₃אני בתוך יחידת מחזור, אשר האחרון כ .3 דקות והקימו [¹¹ג] CH₃אני לכוד ברציפות על [¹¹ג] מלכודת CH₃I.
      4. ודא כי שסתום הפליטה V16 נפתח ו [¹¹ג] CH₃אני מלכודת מחומם ל 90 ° c עם זרם של הליום (20 מ"ל · min^-1) באמצעות V24. בזאת, תוצרי לוואי אפשריים מוסרים ולאחר מכן V16 סגור.
   3. ודא כי [¹¹ג] CH₃אני מוכן להשתחרר לתוך הכור.
   4. נטר את התהליך האוטומטי הבא: בדוק אם המלכודת [¹¹ג] CH₃i מחוממת ל 190 ° c והנוצרת [¹¹ג] ch₃אני שוחרר לתוך הכור באמצעות [¹¹ג] ch₃המלכודת (V32 ו V33, עדיין ב 200 ° C), V7 ו-V8 תחת זרם הליום רציף (10-25 mL · min^-1, V24). במהלך תהליך זה, V21 ו-V23 (יציאת פליטה) צריך להיות פתוח.
   5. ברגע שכמות הרדיואקטיביות בכור. לא תעלה יותר
   6. ניטור התהליך האוטומטי הבא והתכוננות להתערבות ידנית, במידת הצורך
      1. בדוק אם V23, V21 ו-V8 סגורים באופן אוטומטי ותערובת התגובה מתחממת ל-75 ° c. לאחר 3 דקות, להתבונן אם הכור מקורר עם חנקן נוזלי עד הטמפרטורה היא מתחת 35 ° c. לאחר מכן, ודא כי תערובת התגובה היא מבוכל עם 1.5 mL של מים דרך V2. במהלך תהליך זה, V21 ו-V23 (יציאת פליטה) צריך להיות פתוח.
      2. מסלול אם V21 ו-V23 סגורים ותערובת התגובה מועברת לשסתום ההזרקה ע י העברת גלאי נוזלים ללולאה (5 מ ל). עקוב אחר אם תערובת התגובה מוזרקת באופן אוטומטי אל העמודה ' כיצד '.
   7. להתבונן כרומטוגרם ולחתוך ידנית את פסגת המוצר באמצעות לחצן שיא להתחיל. לחץ על קצה שיא כאשר האות שיא המוצר נופל מתחת כ 400 לאחר זמן שמירה של סביב 8-10 דקות (זרימה: 5 mL · min^-1, איור 3).
   8. הפעל זרם הליום נוסף כדי להאיץ את הנורה הריקון.
   9. הצג אם הנורה מרוקן ולהתבונן בבקבוק הפסולת: בדוק אם הנורה מרוקנת דרך V11, מחסנית SPE ו-רובוטית v12 לתוך הפסולת עם זרם הליום באמצעות V19 וקו הליום נוסף ואם המוצר שומר על מחסנית SPE.
   10. ודא כי הנורה ריקה לחלוטין.
   11. ניטור התהליך האוטומטי של טיהור SPE והעברת מוצרים
       1. בדוק אם מחסנית SPE שטפה עם 10 מ ל של מים באמצעות V6, V11, ו-רובוטית v12 לתוך הפסולת ואם האתנול חומק מהמוצר לתוך pcv באמצעות V5, V11, ו רובוטית v12. לבסוף, בדוק אם 0.9% היאל מתווסף ל -pcv באמצעות V4, V11 ו-רובוטית v12 כדי לדלל את המוצר.
       2. ודא כי פתרון המוצר מועבר באמצעות V13 ומסנן סטרילי לתוך בקבוקון המוצר הסופי עם זרם הליום דרך V20.
   12. ודא שהמוצר הועבר לחלוטין.

3. בקרת איכות (QC)

הערה: בקרת האיכות של radiopharmaceuticals כוללת מדידת הפרמטרים הבאים:

• כימיה רדיוכימית ופעילות טוחנת
• שיורית ממיסים (כרומטוגרפיה גז, GC)
• אוסמליות (בלחץ אדים)
• pH (pH-meter)
• γ ספקטרום/רדיונוקלידה טוהר (γ-ספקטרומטר)
• טוהר מחצית חיים/רדיונוקלידה (מינון כמות)

כל הפרמטרים הפיזיקאלית-כימיים נקבעים לפני שחרורו של המוצר והערכים צריכים להיות בטווח הפרמטרים המוגדר באיכות.

1. הכנת ציוד בקרת איכות
   1. התחל את ההכנה 30 דקות לפני סוף הסינתזה.
   2. הכן בקבוקון חרוט במיכל עופרת מסוכך ומזרק מסוכך 1 מ ל עם מחט מחוברת.
   3. הכינו פתרון סטנדרטי לייחוס של SNAP-7941 (10 μg · mL^-1) במים לצורך הכוונה.
   4. הפעל את מד ה-pH, את כרומטוגרף הגז ואת הגזים המשמשים, את האוסמימטר ואת כל הרכיבים של הכרומטוגרפיה.
   5. הפעל את התוכנה השולטת באופן ובחר את העמודה הייעודית ואת השיטה המתאימה ל-[¹¹ג] SNAP-7941 (השלב הנייד: (מים/חומצה אצטית 97.5/2.5 v/v; 2.5 g. L^-1 אמוניום אצטט; pH 3.5)/oositטריל 70/30 v/v; זרימה: 1 mL · דקות ^-1למעלה. וכתוב רשימה לדוגמה עם שתי מדידות (סטנדרטי ומוצר). הפעל את השיטה לצורך התניה של העמודה.
   6. הכנס 20 μL של פתרון ההפניה SNAP-7941 עם מזרק המילטון לאחר 10 דקות מיזוג ולהתחיל את הניתוח לרוץ.
   7. שטוף את מזרק המילטון פעמיים. עם מניטריל ומים אחרי ההזרקה
   8. הפעל את תוכנת הבקרה של GC וכתוב את רשימת המדגם.
2. מבצע בקרת איכות
   1. למדוד את התשואה הרדיואקטיבית המוחלטת של המוצר לאחר תום הסינתזה והעברת 100 μL של המוצר לתוך בקבוקון תגובה עם מזרק להוביל מוגן מוכן עבור בקרת איכות.
      הערה: יש לתעד את כל הנתונים שהושגו מבקרת האיכות בהתאם לתקנות הלאומיות.
   2. כימיה אנליטית: למדוד את הטוהר הרדיוכימי וטוהר כימי וליידע את האדם האחראי על ניסויים בתרבות התא מיד של התוצאות.
      1. צייר 40 μL של מדגם ה-QC והכנס לתוך הלומדות. הפעל את ההפעלה על ידי הזזת זרועו של שסתום ההזרקה מטעינה כדי להזריק (איור 3).
         הערה: במהלך הריצה (8 דקות), ניתן לבצע מדידות אחרות של הפרוטוקול כדי למנוע ריקבון רב ככל האפשר.
      2. פתח את כרומוטוגרמה ולשלב את כל הפסגות בערוץ הרדיואקטיביות. השוואת זמן השמירה של המוצר (5.0-7.0 min) עם זמן השמירה של תקן הייחוס. השוו את האזור שמתחת לעקומה באחוזים מכל הפסגות המשולבות. שיא המוצר צריך להיות יותר מ 95% (טוהר רדיוכימיקלים) של האזורים המשולבים הכולל (ערוץ רדיו).
      3. לשלב את האות בערוץ UV כדי לקבוע טוהר כימי. הטומאה העיקרית היא בדרך כלל חומצת הצמד הקודמן ב 2.8-3.5 דקות. הריכוז של [^natC] SNAP-7941 מחושב מעקומת הכיול לאחר השילוב. חשב את הריכוז של הצמד-7941 ב-μa · mL^-1 וקבע את הפעילות הטוחנת באמצעות המשוואה הבאה:
         
   3. עבור כרומטוגרפיה גז, להעביר 20 μL של מדגם בקרת איכות בבקבוקון זכוכית ייעודי. מקם אותו בדוגם האוטומטי והתחל את המדידה. לאחר סיום המדידה, לפתוח את כרומטוגרם ולכתוב את המספרים של פסגות משולבים אוטומטית. המדגם לא צריך להכיל יותר מ 410 דפים לדקה ו 10% אתנול.
   4. Osmolality: לשים דיסק לדוגמה נייר על חלול ייעודי ולהחיל 10 μL של המדגם. לחץ על לחצן סגור למדידת האוסמאליות. לאחר 3 דקות, המכשיר מציג את האוסמאליות שצריך להיות בטווח של 190-500 mosm · ק"ג^-1.
   5. pH: לשטוף את האלקטרודות עם מים. למדוד את ה-pH על ידי לשים את האלקטרודה במדגם. ה-pH צריך להיות בטווח של 5.0-8.5. לשטוף את האלקטרודות שוב לאחר המדידה ומניחים את האלקטרודה בפתרון pH התייחסות.
   6. γ-ספקטרום: לשים את דגימת ה-QC ב-γ-ספקטרומטר, לפתוח את תוכנת השליטה ולהתחיל את המדידה. הפסק את המדידה וכתוב את האנרגיה הנמדדת שחייבת להיות 511 קוו (טווח 420-520 קוו). פתח את תפריט הקובץ ובטוח את הקובץ עם מספר אצווה בהתאמה. זכור את הספקטרום השמור בתוכנה הייעודית והדפס את הספקטרום.
   7. מחצית החיים: למדוד את הפעילות של מדגם ה-QC פעמיים באמצעות המינון מכייל. רשום את המועדים המתאימים וחשב את מחצית החיים של המעריך.
3. שחרר
   1. לאחר שנבדקו כל הפרמטרים והתוצאות בהתאם להנחיות של השלטונות האוסטרים, שחררו את מכשיר המעקב. המפעיל חייב לחתום על נכונות הנתונים.

4. הערכת אינטראקציות כלפי מוביל P-gp

1. תרבית תאים
   1. התחל את זרימת האוויר הלבינארי (LAF) של ספסל העבודה ונקה את הספסל לפחות 15 דקות לפני תחילת העבודה.
   2. מערבבים את המדיום תרבות התא תחת תנאים סטריליים ב LAF עם 10% של FCS (50 mL) ו 0.5% של אנטיביוטיקה (2.5 mL) עם מערכת הצינורות הנפחי סטרילי באמצעות מכשיר ליטוף אוטומטי.
   3. להפשיר mdckii-hMDR1 ו mdckii-WT תאים ולטפח ב T75 או T175 תרבות התא בקבוקון 10-14 ימים מראש של ניסויים בתנאים אספטי (laf).
   4. שנה את המדיום ביום שלמחרת כדי להסיר את כל התאים האינם מחסיד והאפוטוטיים.
   5. החלף כל שלושה ימים המדיום עם אחד טרי (12 מ ל עבור T75 ו 23 mL עבור T175 התרבות התאים הבקבוקון, בהתאמה).
   6. פצל את התאים בהתאם ללוח הזמנים של ניסויים לצלוחיות טריות או מנות תרבות התאים במפגש של 80% כדי למנוע הגדלת בילאייר.
2. הכנה לניסויים בתאים
   1. פצל את התאים יומיים לפני ניסויים וזרע בריכוז של 2.5 x 10⁵ תאים לכל 2 מ ל במישור אלכסוני של צלחת תרבות התא (איור 4). השתמש בהתקן של מונה תאים אוטומטי או בחדר ספירת תאים של Neubauer כדי לספור את התא ולחשב את יחס הפיצול המתאים.
   2. להסיר את המדיום יום אחד לפני ניסויים, לשטוף את התאים על מנת התרבות עם 4 מ ל של DPBS ולהוסיף טריים 5 מ ל של תרבות התא בינונית. מניחים את המנה אופקית בחממה.
   3. לשטוף את התאים עם DPBS לפחות 0.5 h לפני ניסויים ולהחליף עם 2 מ ל של FBS בינונית חינם. בחנו את המפגש ואת מורפולוגיה התא במיקרוסקופ.
3. מבצע את הניסויים. בשלוש הגדרות שונות
   1. השתמשו בצלחת פטרי לניסויים כמתואר ב4.2.3.
   2. לטפל בתאים עבור 0.5 h לפני ניסויים עם 10 μM (±)-verapamil הידרוכלוריד.
   3. הוסף 0.98 μL של פתרון מלאי verapamil (20.4 mM (±)-verapamil הידרוכללוריד ב DMSO). התוכן הסופי DMSO הוא ≤ 0.05% במהלך הטיפול.
   4. דגירה את התאים עבור 0.5 h עם בקרת הרכב (DMSO). השתמש באותו אמצעי אחסון המשמש לטיפול בתרופות.
4. ניסויים בזמן אמת (לכל שלושת הכיוונונים)
   1. הפעל את ההתקן, את המחשב וודא שהם מחוברים כראוי ולאחר מכן פתח את תוכנת הבקרה.
   2. בחר באפשרות היעד האחת , בטל את נעילת התבנית והתאם את ההגדרה הבאה:
      מספר משרות: 2 (שני)
      זמן זיהוי (שניות): 3 (שלוש)
      זמן השהיה של זיהוי: 2 (שני)
      שם השלב הראשון: תוכנית בסיסית
   3. הכנס את הצלחת תרבות התא לתוך תמיכה נוטה של המכשיר, וודא כי הקוטב התא הוא בצד התחתון ומכוסה במדיום תרבות התא.
   4. הפעל את ההפעלה באמצעות לחצן התחל . המערכת מבקשת לשמור את הקובץ. בחרו שם קובץ ונתיב שמירה. מרכז הבקרה יצוץ והמדידה הבסיסית מתחילה (התמיכה בצלחת תרבות התא מתחילה להסתובב).
   5. בחר תחת אפשרויות אחרות:
      סרגל זמן: דקות
      תיקון nuclide: פחמן -11
   6. בדוק את כל התיבות תחת עקומות בגרף (רקע (אדום), יעד (כחול) והיעד פחות רקע (שחור)).
   7. השג פרמטרים של בקרת איכות: פעילות טוחנת [GBq. μמול¹] וריכוז הפעילות [MBq.mL^-1] בסוף הסינתזה.
   8. חישוב נפח מעקב בהתאמה עבור 15 ננומטר של [^natC] SNAP-7941 בנפח החישוב של 2 מ ל.
      
      
   9. הכן את הפיפטה לאמצעי האחסון המתאים ואת המוצר של [¹¹ג] SNAP-7941 מוצר במגן עופרת.
   10. לחץ על השהה הפעלה בחלון מרכז הבקרה. המתן עד שסיבוב הכלים ייפסק והסרגל הצדדי עם הכותרת תושהה והשלב הבא יתרחש.
   11. פתח את המכסה של המכשיר הקינטי בזמן אמת. להפוך את צלחת התרבות תמיכה 90 ° שמאלה. הוסף את עוצמת המעקב המחושבת וחזור למיקום ההתחלתי. לאחר מכן, סגור את המכסה של ההתקן. לחצו מיד על לחצן ' המשך ' להתחלת הניסוי.
   12. סיים את הניסוי לאחר 20 דקות על-ידי בחירה בהשהיה ולאחר מכן סיים את ההפעלה (הקש סיום הפעלה בסרגל הצדדי).
5. ניתוח נתונים ועיבוד באמצעות תוכנה סטטיסטית
   1. פתח את תוכנת בקרת הזמן האמיתי. לחץ על הקבצים הפתוחים כדי לאחזר את הקינטיקה הנדרשת. הקינטיקה מאוירת בחלון מרכז הבקרה.
   2. לבחור על ידי לחיצה ימנית ישירות על עקומות לייצאהקינטיקה. שמור את קובץ הטקסט המכיל את הנתונים הגולמיים. פתח את תוכנית הסטטיסטיקה והדבק את קובץ הנתונים הגולמיים של ניסויים בזמן אמת.
   3. התחל עם הזמן (ציר x) בתוספת של מכשיר המעקב (לא לכלול מדידה ברקע) ולנרמל את האות באחוזים של ה-"מקסימום" (ספירות לשניה).
   4. טען את כל הנתונים המנורמלות לקובץ חדש של מנסרה.
   5. חשב ערכי ממוצע וסטיית תקן.
   6. להמחיש את הנתונים שהושגו כגרף המציג את סטיית התקן (קצב הגדלה) של ספיגת מעקב של כל שלושת ups.

תוצאות

רדיוסינתזה האוטומטי המלא של [¹¹ג] הצמד-7941 הניב 5.7 ± 2.5 GBq (4.6 ± 2.0% ב eob, 14.9 ± 5.9% מבוסס על [¹¹ג] CH₃otf; n = 10) של מוצר ניסח. הסינתזה הכללית נמשכה סביב 40 דקות, שם 15 דקות נדרשו להכנה של [¹¹ג] CH₃otf דרך השיטה בשלב הגז, עוד 5 דקות היו נחוצים עבור רדיויניום של הקודמן, ואחריו 10 דקות של חצי ההכנה הוצאת מחסנית מוצקה לסי18 וניסוח מוצק. לאחר מכן, a קטן (100-200 μL) נמסר לאדם האחראי על בקרת האיכות, בעוד בקבוקון המוצר המקורי המכיל את מעקב מוכן לשימוש הועבר לניסויים של ניתוח קינטי בזמן אמת.

בקרת איכות הושלמה בתוך 10 דקות לאחר סוף הסינתזה. הפעילות הטוחנת היתה בטווח של 72 ± 41 GBq/μמול (n = 10) וטוהר רדיוכימיקלים תמיד > 95%. כל הפרמטרים האחרים (pH, אוסמאליות, שיורית ממיסים) מילאו את קריטריוני השחרור. עבור הטיפול הקינטי בזמן אמת, שלושה הגדרות ניסוי שונות נבחרו: (א) טיפל ולא טופלו (רכב) MDCKII-WT תאים, (ב) לא מטופלים או מטופלים עם רכב MDCKII-hMDR1 תאים ו (ג) קו התא האחרון עם חסימת לפני זמן אמת השיטה הקינטית של הטרנספורטר באמצעות (±)-verapamil. החלת [¹¹ג] הצמד-7941 אל קו wildtype מסוג MDCKII-WT (p-gp לא ביטוי) ו Mdckii-HMDR1 (p-gp ביטוי) מראה התנהגות קינטית שונה, כמו יש הצטברות מהירה קו התאים wildtype, בעוד שאין הצטברות נצפתה עבור התאים MDCKII-hMDR1. עם זאת, חסימת P-gp המשלח inMDCKII-hMDR1 תאים עם (±)-verapamil הוביל לקינטי בזמן אמת דומה כפי שכבר נראה עבור קו התאים wildtype (איור 5).

איור 1: מבט כולל על זרימת העבודה. זרימת עבודה של רדיוסינתזה, בקרת איכות, וביצועים של מדידה קינטית בזמן אמת של [¹¹ג] הצמד-7941. החיצים השחורים מציינים את. דרך ההובלה של הרדיואקטיביות אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ערכה רדיוסינתטית של הסינתיסייזר האוטומטי. החלפת מעגל של הסינתיסייזר האוטומטי, החל ביחידת המחזור עבור [¹¹ג] ch₃I/[¹¹ג] ch₃הפקה otf, הכור למבוא של הפעילות לתוך הפתרון הקודמן וטיהור (spe = הפקת פאזה מוצקה; PCV = בקבוקון אוסף המוצרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: כרומטוגרמות מייצגים של רדיוסינתזה אוטומטית לחלוטין של [¹¹ג] הצמד-7841. מומחש למחצה-RP-כרומאטוגרם מאוירים בחלק העליון והאנליטי לאחר טיהור בתחתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הכנת תבשיל תרבות התא לניסויים בזמן אמת. שלב 1 כולל את הזריעה של 2.5 x 10⁵ עד 1 x 10⁶ בהתאם לסוג התא ואת קצב הצמיחה שלהם. לאחר מכן, תבשיל התרבות ממוקם במישור אלכסוני (כ 30-45 °). לכן, מכשיר מתכת שסופקו או מכסה של צלחת תרבות התא ניתן להשתמש בחממה כדי לייצב את המיקום הנוטה של המנה. יום לאחר (24 שעות) המנה מותאמת אופקית, ומדיום תרבות התא הטרי מתווסף לחלוטין לכסות את משטח התא. ביום הניסוי, הכדאיות והמפגש של התאים נבדקים. על פי הפרוטוקול הניסיוני, התאים נשטפים עם DPBS, המדיום מוחלף על ידי סרום ללא מדיום (2 מ ל), ואת הצלחת התרבות הוא ממקם מיקום אלכסוני עד תחילת ניסויים. מעתה ואילך, ניתן לטפל בתאים בעזרת המעכב או הרכב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: בזמן אמת מדידות קינטית של [¹¹ג] הצמד-7941. מייצג קינטיקה בזמן אמת של [¹¹ג] הצמד-7941 מוצגים בשלושה מערכת ups שונים: באמצעות תאים MDCKII-WT; MDCKII-hMDR1 תאים מראש חסומים עם (±)-verapamil כמו P-gp מעכבי ו MDCKII-hMDR1 תאים ללא חסימה. ציר y ממחיש את שיעור הגידול של התאים הטרום חסומים MDCKII-hMDR1 ו WT בהשוואה לתוצאות של תאים מטופלים או טיפול MDCKII-MDR1, בהתאמה (לא ספיגה, 0%). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

הרדיוסינתזה של [¹¹ג] SNAP-7941 הוקמה על מודול סינתזה מסחרית. בשל האפשרות להפוך את הליך ההכנה לאוטומטי לחלוטין, יש לאפשר את הרדיוסינתזה להיות אמינה, ושיפורים לגבי הגנת הקרינה של המפעיל הושגו. להכנת הסינתיסייזר יש השפעה עצומה על איכות מכשיר הרדיו, במיוחד במונחים של פעילות טוחנת. כך, חיוני לעבוד כל הזמן תחת תנאים אינרטי (למשל, אווירת הליום), ולרוקן את כל הקווים הממוקמים לפני כלי התגובה (קו היעד, [¹¹ג] CH₃אני מחזור הייצור והכור (ראה איור 2)). יתר על כן, חימום המלכודות והתנורים המתאימים לפני תחילת הסינתזה להסיר לחות הפחמן אטמוספרי מגביר את הפעילות הטוחנת יתרון. במיוחד העמודה agotf, ספוג עם פחמן גרפיט חשמליים הוא רגיש מאוד לחות. אפילו כמויות זעירות של כל מקור לחות להפריע ההמרה של [¹¹ג] ch₃אני ל [¹¹ג] ch₃otf. לפני שמתחילים את הסינתזה, את המלכודת [¹¹ג] CO₂ ו-[¹¹ג] CH₃אני צריך להיות מקורר לטמפרטורת החדר שוב כדי לאפשר השמנה הבאים. יתר על כן, מומלץ לפזר את הקודמן זמן קצר לפני התחלת סינתזה להוסיף את הבסיס ישירות לתוך הפתרון מקודמן.

בקרת איכות עבור מכשירי הרדיו פחמן -11 צריך להיות מתוכנן באופן רציונלי עבור זרימת עבודה רציפה ומהירה. עם זאת, הפרמטרים החשובים ביותר עבור לימודי תרבות התא הם טוהר רדיוכימיקלים ופעילות טוחנת כדי להשיג תוצאות חוקיות. הערכה נכונה של פעילות הטוחנת דורשת שיטת אבחון אנליטית איתנה ועקומת הכיול צריכה לכסות את טווח הריכוז של המוצר הסופי. החלק המאתגר לרדיומשדרים הוא להשיג ריכוז מעל גבול הכמת (LOQ) בשל כמויות קטנות, המיוצרים במהלך הרדיוסינתזה. מכאן, האמנות היא למצוא את האיזון בין פעילויות הטוחנת גבוהה כדי למנוע רוויית קולטן וריכוזים גבוהים מספיק כדי עדיין להיות מסוגל לכמת את האות הלא רדיואקטיבי.

[¹¹ג] SNAP-7941 אושרה להיות מצע חזק של הטרנספורטר P-gp האנושי, כמו הצטברות לא נצפתה הטיפול מטופל או הרכב MDCKII-hMDR1 בתאים בשל מהיר מאוד. לעומת זאת, שניהם מערכת ניסיונית ups (MDCKII-WT או טרום חסם MDCKII-hMDR1 תאים) סיפק תוצאות דומות (הצטברות של [¹¹ג] SNAP-7941), תמיכה הצדדיות של זה בתוך שיטת מבחנה. MDCKII-hMDR1 תאים מתאימים מאוד עבור ניסויים ליגאנדנותב בשל ההתפתחות היציבה שלהם, צמיחה מהירה ומתמשך נגד הטיית מתח הנגרמת על ידי צלחת התרבות מסתובבת התא. העדר [¹¹ג] הצמדה-7941 ספיגת במוח עכברוש ועכברים עלול אפוא להתרחש כתוצאה מכך על ידי לאחר מוביל P-gp. בשל העברה של תאים כליות הכלב עם החלבון האנושי רב התנגדות התרופה 1 (hMDR-1, P-gp), את הערך החזוי של שיטה זו לכריכה טרנספורטר מוביל בבני אדם הוא גבוה, אשר מבחינה חיובית במונחים של יישום קליני עתידי. עם זאת, עד כה, הסלקטיביות נגד טרנספורטר אחרים לא אומתה. לכן, קווי תאים אחרים ניתן להשתמש, ביטוי שונים מובילים בולטים של מובילי כמו סרטן השד התנגדות חלבון (BCRP) או התנגדות מרובים חלבון -1 (MRP-1), כדי ללמוד אינטראקציות כלפי מובילים אלה. השיטה הינה בהשוואה להצטברות קלאסית או להובלה מאוד פשוטה ומעניקה תוצאות איכותיות באופן מיידי. יתר על כן, היתרון הגדול ביותר הוא כי טכנולוגיה זו מאפשרת הערכה של אינטראקציה ישירה של מעקב PET ואת המטרה בזמן אמת, בניגוד לניסוי קונבנציונאלי באמצעות כימות עקיפה (בעיקר עקירה). בנוסף, התוכנה בזמן אמת מספקת את הגמישות הניסיונית (למשל, תיקון ריקבון נוקליד, מדידת זמן ומיקומים, וכו ') ולכן, חופש גבוה עבור משתמשים. בצד השני, מגבלות השיטה כוללות תפוקת דגימה נמוכה, כאשר ניתן למדוד רק צלחת תא אחת בכל פעם. יתרה מזאת, יש לקחת בחשבון עוד כמה סוגיות טכניות ומבצעיות: הטכנולוגיה המתוארת רגישה מאוד לקרינת הרקע; לפיכך, יש לשמור על מקורות קרינה במרחק ודגש על מדידת הרקע לפני הניסוי. בעיה נוספת בנוגע לניסויים בטמפרטורות גבוהות יותר מטמפרטורת החדר, היא החימום של התמיכה הנוטה: התאיידות של מדיום התרבות התאית עשויה להשפיע על הגלאי. במקום חימום, המכשיר כולו רצוי ממוקם לתוך החממה. כמו-כן, השיטה מוגבלת לקווי תאים מחסיד. דרך הסיבוב של הצלחת תרבות התא, להטות את הלחץ תאים רגישים יכול להתנתק ממנה, אשר יכול להוביל לתוצאות לא חוקיות.

אף על פי כן, אם הניסיונית מקדיש תשומת לב לחסרונות אלה קטין השיטה מספקת תוצאות מהירות ואמינות לניתוח של התנהגות קינטית של מנותבים לחיות מחמד טרום קלינית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941
Ni catalyst	Shimadzu, Kyoto, Japan		Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh
Iodine	Merck, Darmstadt, Germany		1.04761.0100
Acetonitrile	Merck, Darmstadt, Germany		for DNA synthesis, < 10 ppm H2O
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
Ammonium acetate	Merck, Darmstadt, Germany
Acetic acid	Merck, Darmstadt, Germany		glacial
Ethanol	Merck, Darmstadt, Germany		96%
NaCl	B. Braun, Melsungen, Germany		0.9%
Tetrabutylammonium hydroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Methanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA		HPLC grade
SPE cartridge	Waters, Milford, MA, USA		SepPak C18plus
Semi-preparative RP-HPLC column	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm
Precolumn	Merck, Darmstadt, Germany		Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm
Precursor	University of Vienna, Austria		SNAP-acid
Reference compound	University of Vienna, Austria		SNAP-7941
Silver trifluoromethanesulfonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Graphpa GC	Alltech, Deerfield, IL, USA		80/100 mesh
PET trace 860 cyclotron	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
[11C]CO2 high pressure target	Air Liquide, Vienna, Austria
TRACERlabFX2 C	GE Healthcare, Uppsala, Sweden
N2 + 1% O2	Air Liquide, Vienna, Austria		Target gas
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941.
Merck Hitachi LaChrom, L-7100	Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria)		HPLC pump
Merck Hitachi, L7400	Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan)		UV-detector
NaI-radiodetector	Raytest (Straubenhardt, Germany)		NaI-radiodetector
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm	Merck (Darmstadt, Germany)		HPLC column
430-GC	Bruker (Bremen, Germany)		Gas chromatograph
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm	SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia)		Gas capillary
Wesco, osmometer Vapro 5600	Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria)		Osmometer
g-spectrometer			g-spectrometer
Gas chromatography controlling software	VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A)		Galaxie Version 1.9.302.952
Gamma spectrometer controlling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Maestro for windows Version 6.06
Gamma spectrum recalling software	ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.)		Winplots version 3.21
HPLC controlling software	Raytest (Straubenhardt, Germany)		Gina Star Version 5.9
inolab 740	WTW (Weilheim, Germany)		pH meter
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941.
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1)
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT)	Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands)		Wildtype (WT)
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
Fetal Calf Serum (FCS)	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 10270-106
Penicillin/Streptomycin	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 15140
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
In vitro experiments
DMEM GlutaMAX	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Gibco 61965-026
(±)-Verapamil hydrochloride	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)
DMSO	Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)		276855-100 mL
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
Sterile disposable plastic pipettes	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Sterilin, 5 mL – 25 mL
Sterile pipette tips	VWR International GmbH, Vienna, Austria		Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL
Cell culture flasks	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175
LigandTracer control Version 2.2.2	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer Yellow	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer White	Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
GraphPad Prism 6.0	GraphPad Software, Inc.
Handheld automated Cell Counter	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter (Cat.No. PHC00000)
Cell Counter Sensors	Millipore Corporation Billerica MA01821		Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050)