注射格里鲁斯双形蛋

摘要

在这里，我们提出了一个协议，注射板球卵，该技术作为基础方法在许多实验在板球，包括但不限于，RNA干扰和基因组操作。

摘要

改变发育中的生物体的基因功能是不同实验的核心。虽然在传统的模型系统中已经开发出了非常强大的遗传工具，但在大多数其他生物体中很难操纵基因或信使RNA（mRNA）。同时，进化和比较方法依赖于对许多不同的物种基因功能的探索，因此需要开发和调整目前遗传性可操作的表达之外的表达技术。物种。该协议描述了一种将试剂注射到板球卵子中的方法，以测定给定操作对胚胎或幼虫发育的影响。介绍了如何用尖刺针头收集和注射卵子的说明。这种相对简单的技术是灵活的，并可能适应其他昆虫。一个实验可以收集和注射几十个卵子，仅缓冲注射的存活率随着实践而提高，可以高达80%。该技术将支持几种实验方法，包括注射药理剂，体外封顶mRNA来表达感兴趣的基因，双链RNA（dsRNA）实现RNA干扰，定期使用聚集与CRISPR相关蛋白9（Cas9）试剂配合进行间隔短回溯重复（CRISPR）进行基因组修饰，并可转位元素生成瞬态或稳定的转基因线。

引言

改变生物体中的基因组或影响基因表达的能力是设计多种实验测试功能因果关系的基础。在传统基因实验室动物模型系统（如Musmusculus、Danio）之外的生物体中，基因组和非基因组修饰技术也对于比较和进化相关工作也至关重要。 雷里奥、德罗索菲拉·梅拉诺加斯特和卡埃诺哈布迪西·埃莱甘斯。无论是理解有机体^多样性1的愿望，还是对Krogh原则的坚持，对于每一个生物问题，都有一个最适合其解决方案2、3、修改基因组或影响基因表达是现代实验设计的关键。

板球Gryllus双形球是一个新兴的模型系统。用于上个世纪的神经学实验4，在过去的二十年里见证了对板球的实验兴趣增加，特别是专注于这种生物体的进化和发展5。板球是一种截带性昆虫，它向经过良好研究的全息昆虫（如D.黑色素气和三硼酸酯6）分枝。由于其在进化树上的有用位置，科学家们有兴趣在这种昆虫中提出现代的、复杂的实验问题，这导致人们越来越有兴趣调整分子工具，用于G.双形虫。

将分子试剂注入板球卵子可用于基因组修饰实验以及胚胎中基因表达的非基因组操作。例如，转基因G.双体细胞携带eGFP插入已经创建使用转座酶piggyBac7，⁸。研究者已经成功地利用锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活器样（TAL）效应素（TALENs）在特定的基因组区域9中引入双链断裂。虽然ZFN和TALEN允许在四大模型系统之外的动物进行特定定位，但这些试剂已被CRISPR/Cas9系统迅速超越，该系统使用更简单、效率更高、灵活性^高。CRISPR已用于G.双核糖核酸生产敲出11以及敲入线12，13 除了基因组修饰，dsRNA可以注射到鸡蛋中，以敲落mRNA表达在开发胚胎，使调查人员了解特定记录的作用在整个开发14，15。一些关于如何注射板球蛋的有限细节已经发表^于12。

在这里，我们描述了注射早期G.双形卵子的详细方案。该协议是有效的，很容易适应各种实验室设置，注射材料，并可能对其他昆虫。虽然设计和实施基因组修饰和击倒实验的其他细节已经在其他地方发表，这些方法最终将依赖于此处详述的注射方案。

研究方案

1. 硬件设置和材料准备

注:有关解决方案、试剂和设备详细信息的准备，请参阅表 1和材料表。

1. 设置解剖显微镜，以便看到鸡蛋并引导注射针。（图1A显示了装有荧光的解剖显微镜。荧光能力是有利的，但不是必须的。
2. 放置一个3轴微操作器，将注射针操纵到位（图1A）。
3. 设置一个带有管子和针架的显微注射器，以注入少量材料（图1A）。可选择使用图中未显示的脚踏板。
4. 使用 3D 打印机或激光雕刻机打印所需图案的反面，设计和创建用于为鸡蛋创建井的图（图 1C）。
   注:显示的 3D 打印样本戳图为 4.5 厘米 x 5 厘米，带 128、3 厘米 x 1 厘米 x 1 mm 突起，用于创建单个井。有关如何制作各种可定制模具的详细信息已在其他地方^公布16。
5. 制备10x注射缓冲液，HEPES缓冲盐水（HBS），以及四甲基二甲胺Dextran染料的库存溶液，并储存在4°C。
6. 准备要注射的实验溶液，如dsRNA，CRISPR/Cas9^12，可转位元素，体外封顶mRNA7，8，药理剂17，ZFNs，或TALENS9。
7. 将双棒胶带放在玻璃显微镜幻灯片上几层标准实验室胶带上，以便在玻璃幻灯片上方 1 mm 左右创建一个平台，用于固定针头进行评估。
8. 准备一个约40厘米x60厘米大小的板球容器，盖子带有网状覆盖的开口，用于空气循环。
9. 添加食物、水和遮蔽材料。
10. 添加几十个健康的男性和女性成年板球。通过翅膀的存在来识别成年板球。
    注:一系列后想象年龄可能会增加卵子的产量。板球的密度应该相对较高，以便能够收集足够的鸡蛋进行实验，但不要拥挤到人吃发生。例如，在上述大小的容器中，大约20只健康的板球，男女比例大致相等，应该足以在一至两个小时的时间内收集大约200个鸡蛋。板球可以在室温下保持，但如果板球保持在温暖（23.5-26 °C）、潮湿（40-60%相对湿度）培养箱中，发育和行为将是最佳的。

2. 为注射做针

1. 使用带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管（有关尺寸详情，请参阅材料表）。准备在同一天或注射完成前几天的拉针。
2. 将毛细管玻璃放入拉拔器中，将玻璃放在灯丝上，并拧紧旋钮以将玻璃固定到位。
3. 将拉拔器温度设置在玻璃斜坡温度附近（-5 °C 至 +10 °C）。
4. 使用单步式高热协议拉长拉带小开口的拉片，但避免熔化末端关闭。
   注:例如，当使用配备盒丝的材料表中详述的微移液拉器时，对于斜坡温度为 478 的玻璃，请使用以下参数:加热 478;拉动 45;Vel 75;德尔120。生产如图 2B所示形状的针的最佳条件应由每个用户根据经验确定。
5. 为注射做准备的斜面针尖。
6. 用滴水将转床的旋转磨床平面弄湿（图2A）。使用反渗透 （RO） 或二乙酰二甲酸酯 （DEPC） 处理的蒸馏水。
7. 将拉针放入弯盘中，然后转向 20° 角。
8. 放下针头，直到它接触磨削平面，并斜面 2 到 3 分钟。
9. 将斜面针放在附着在玻璃显微镜幻灯片上的双杆胶带上，以评估斜面。
10. 将手持针头的幻灯片放在装有摄像头和图像采集软件的复合显微镜的舞台上。
11. 使用 20x 目标获取针尖的图像。
12. 使用成像软件测量针的内部流明直径，正好接近凸贝开口（图2C）。最佳尺寸为 10 μm = 2 μm。
13. 丢弃开口低于 8 μm 且高于 12 μm 的针头。
14. 将针头存放在装有盖子的容器中，以免出现灰尘。使用蜡条或类似材料将针头从容器底部抬起，以防止打碎吸头（图 2D）。

3. 鸡蛋的收集和制备

1. 在尝试收集鸡蛋之前，通过剥夺板球在一夜之间或至少8-10小时的任何潮湿产卵材料（水小瓶、蛋盘）来最大化产蛋的数量。
   注:由于女性有能力在内部储存精子，如果仔细定时受精在实验^{上是必要的，}可能需要一种不同的定时程序。
2. 在水中制作 40 mL 的 1% 甘蔗，倒入 10 厘米培养皿中。
3. 在甘蔗凝固之前，在蛋井上盖上印记。
4. 取出印记，一旦甘蔗凝固，露出井（图1C）。
5. 用含有1%青霉素/链霉素的HBS填充甘蔗井板。
6. 将盖子放在盘子上，用片卷包裹，储存在4°C处。
   注:餐具可在4°C下储存几天，但在使用前应加热至室温，以避免冷凝。
7. 制作一个鸡蛋收集菜，让板球下蛋，用白色操场沙填充35毫米的培养皿（图1B）。
   注:"材料表"中指定的沙度为适当的颗粒大小。如果沙粒太大，沙会损坏鸡蛋。
8. 用一条方形的纸巾盖住蛋盘，切至约18厘米x18厘米，并放在盘子顶部用沙。通过这个纸巾用自来水盖住填充的盘子。
9. 倾斜培养皿，轻轻挤压顶部以去除多余的水。
10. 将纸巾方形的角塞在盘子下方，将蛋盘放在倒置的盖子中，这将有助于将纸巾盖到位。
11. 将鸡蛋盘放入板球箱中，让成年雌性卵子排卵一至两小时。
    注:相对较短的时间在这里确保所有的鸡蛋将类似的发展阶段，在注射时。如果在细胞化前注射很重要，注射应在14小时内^产卵19。
12. 同时，让阿加塞菜（从步骤3.6）加热到室温，准备持有鸡蛋注射。
13. 从板球箱中取出现在含有新鲜鸡蛋的鸡蛋收集盘，并取下纸巾盖。将孔径为 0.5–1 mm 的滤网放在至少 500 mL 容量的烧杯上（图 1B）。
14. 将产卵盘（沙和蛋）的含量冲洗到过滤网中，在轻轻运行的自来水下，让沙粒通过滤网落入下面的烧杯中的水中，但将板球蛋留在滤网中。
15. 向容器中填充 RO 水并将其放入托盘中。将滤网倒置在容器上，然后将其与盘子对，将鸡蛋放入水中。鸡蛋会沉入容器的底部。
16. 用剪刀将 P1000 移液器尖端切下，使开口直径约为 3 mm。将这个尖端放在P1000移液器上，用它将鸡蛋从容器转移到甘蔗蛋模盘，尽可能少地转移水。
17. 使用塑料钳子将鸡蛋排列在充满HBS加1%青霉素/链霉素的甘蔗井中。每个鸡蛋会沉入单个井的底部。盖上培养皿盖，直到准备注射。

4. 准备显微注射器

1. 将微注射器连接到压缩空气或气体源（此协议已使用压缩空气或 N₂进行优化）。
   注:如果使用便携式储气罐，则加注至至少 75 psi。油箱在整个喷射过程中将失去气压，可能需要重新加注;注射变得难以低于40psi。
2. 打开显微注射器。将喷射时间设置为 0.17 s，将压力设置为 10–15 psi。
   注:所需的确切压力取决于针的开口，并且必须根据经验确定每一轮注射和/或使用的新针头。
3. 确保微注射器的 BALANCE 旋钮转向 0（通常完全逆时针），并且微注射器处于加压且处于喷射模式。

5. 注射

1. 使用 1 mL 注射器和 0.45 μm 注射器过滤器过滤约 500 μL 的 10x 注射缓冲液。
2. 混合注射试剂（以下详细信息用于注射dsRNA，^如12所述）。
   注:最好设计和执行多个控件，尤其是在首次学习此技术时。在不注射卵、单独注射缓冲液 +染料或注射缓冲液 + 染料 + 控制试剂（如 eGFP dsRNA）的情况下，打卵都是对注射协议各种元素的破坏性的良好测试。有关多种不同的控件的生存能力，请参阅图3。
3. 从 4 mL dsRNA 等分开始。
4. 将过滤的10倍注射缓冲液的0.5 mL添加到dsRNA等分。
5. 加入0.5 mL的50毫克/mL四甲基罗丹胺染料库存溶液。如果在没有荧光的情况下进行解剖范围，请使用苯酚红色。
6. 在注射期间，将所有材料放在冰上。
7. 使用 20 mL 装载头和 p10 移液器将注射液装入注射针中。
8. 绘制 1.5 mL 注射液，并将装载尖端插入注射针的宽端。
9. 尽可能向下喷射溶液，轻轻轻拂，消除气泡;小心不要打针。
10. 将鸡蛋盘放在解剖显微镜下，选择约 10 倍的低放大倍率（通过 10 倍眼镜镜查看 1 倍放大倍率）。
11. 将针头插入注射壳体并拧紧。
    注:小心针头是否正确牢固地插入壳体中。为此，将针的宽端从金属外壳中拉出，将硅管带入外壳中。调整硅管，使针的玻璃端伸出硅管正其正。如果不能做到这一点，硅管可能会夹在玻璃和金属外壳之间，阻塞针的末端。
12. 小心地将注射罩与连接的针插入微操作器。注意针的锋利端，并小心不要撞到表面和破碎。
13. 通过显微镜观察鸡蛋和针头时，将针头移到盘子网格左上角的鸡蛋附近。
14. 降低针头，直到尖端进入HBS加1%青霉素/链霉素缓冲溶液在盘。
15. 将针头放在视野中，移动蛋盘，使针头比鸡蛋离盘子边缘更近几毫米。
16. 不要用针遮挡鸡蛋网格的视野。
17. 将显微镜设置为适合罗达明的过滤器，以便观察针中的荧光并聚焦在针头上。
18. 在显微注射器上，顺时针缓慢转动 BALANCE 旋钮，直到注射液开始从针头泄漏到悬架溶液中。微注射器屏幕上的余额数字将开始增加，尽管数值并不重要。接下来，逆时针稍微旋转旋钮，直到染料停止从针头中泄漏。
    注:每次使用新针时，设置这种平衡至关重要。如果没有适当的平衡设置，显微注射器将在触发注射后持续注射一段时间。甚至有可能，一次按下注射按钮与不平衡的针将导致驱逐所有内容物的加载针。
19. 将针头居在视场中，移动蛋盘，使针头瞄准要先注射的鸡蛋。建议注射从排列的鸡蛋网格的一个角开始，例如左上角。
20. 将放大倍率调整到约 50 倍;在此放大倍率下，单个鸡蛋将填满大部分视野。
21. 使用微操作器和鸡蛋盘上的手将针头移入注射位置。
22. 使用微操作器推进针头，并将针头插入要注射的第一个卵子中。
23. 从鸡蛋的后部（直插）端以20-30%的鸡蛋长度插入针头（图1E），垂直于鸡蛋的长轴。
24. 使用喷射脚踏板或显微注射器上的喷射按钮注射溶液。卵子内的荧光物质小波表示注射成功（图1D）。
    注:注射期间从卵子中弹出一些蛋黄并不罕见（图1F），这并不一定意味着注射的卵子是不可行的。
25. 从鸡蛋上收回针头。如果卵子在缩回针头时无意中从井中取出，使用小钳子将卵子推回井中，同时缩回针头。
26. 如果在注射过程中针堵塞，从鸡蛋中取出针头，保持针头浸入HBS加1%青霉素/链霉素溶液覆盖鸡蛋，清除堵塞的针使用清除功能或通过推注射按钮。
27. 继续使用相同的针头，重复注射程序尽可能多的鸡蛋。起初，这可能只有大约20或30个鸡蛋，但会增加到超过100与实践。
28. 如果针头堵塞且无法清除，请丢弃针头，填充新针头，然后重新开始（即返回步骤 5.7）。
29. 将注射的卵子储存在温暖孵化器（23.5~26°C）中，该培养皿稍微潮湿（以尽量减少蒸发），直到胚胎达到分析所需的发育阶段。
30. 至少每24小时，取出不再存活的卵子（图3A，B），用新鲜的HBS加1%的青霉素/链霉素代替悬浮液。
31. 注射后两到三天，通过温和的移液或用塑料钳子将卵子转移到用HBS加1%青霉素/链霉素湿润的纸巾上，在带盖的培养皿中继续发展，在温暖潮湿的培养箱中继续发育。
32. 监测鸡蛋，并去除每天不再存活的鸡蛋（图3A，B）。

结果

板球很容易在潮湿的材料中产卵，并提供足够的材料，如潮湿的沙或污垢，诱导他们下大量的鸡蛋。如果首先在洁净的沙中产卵8~10小时，这尤其有效。解剖显微镜、显微注射器和微操作器（图1A）可用于向单个卵子注入各种材料（图1D）。鸡蛋在后端附近被注射，沿前后轴大约20-30%?...

讨论

该技术的两个主要挑战是最佳针尺寸和生存能力的相关问题。虽然较小的针头可以提高生存能力，但流明较窄的针头在工作中具有更大程度的毛细管力，这使得蛋黄更有可能进入针头，导致其堵塞。在最好的情况下，只需注射另一个卵子或清除针头即可清除堵塞，如上所述。也可以尝试增加显微注射器上的平衡压力，直到蛋黄被推出针头。这项技术的另一个主要挑战是生存能力。在我们手中，注?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent dissecting microscope	Leica	M165 FC	Stereomicroscope with fluorescence
External light source for fluorescence	Leica	EL 6000
Microinjector	Narishige	IM-300	-Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-
mCherry filter cube	Leica	M205FA/M165FC	Filter cube for mCherry or similar red dye will work
Micromanipulator	World Precision Instruments, Inc.	M3301R	Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)
Magnetic stand	Narishige	MMO-202ND
Pipette Holder (Needle holder)	Narishige	HD-21
Tubing to connect air source to microinjector
Egg well stamp	3D printed	custom	3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic
Microwave	various
Incubator or temperature controlled room	various		Temperatures of 23.5-26 °C are needed.
Cricket food	various		cat food or fish flakes are appropriate food.
Cricket water	vairous		Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls
Cricket shelter	arious		Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons
Glass capillary tubes	World Precision Instruments, Inc.	Item no. 1B100F-4	Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament
Micropipette puller	Flaming/Brown	Model P-97	Distributed by Sutter Instrument Co.
Beveller/Micro grinder	Narishige	Model EG-45/EG-400	EG-400 includes a microscope head
Petri dishes	CellTreat	Product code 229693	90 mm diameter
Play Sand	Sandtastik Products Ltd.	B003U6QLVS	White play sand
Agarose	American Bioanalytical	AB000972	Agarose GPG/LE ultrapure
Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers	US Kitchen Supply	Model SS-C123	Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm
Penicillin Streptomycin	Gibco by Life Technologies	Ref 15070-063	Pen Strep
Plastic tweezers	Sipel Electronic SA	P3C-STD	Black Static Dissipative, 118 mm
Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm	Nalgene	725-2545	Use with 1 mL syringe
1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip	Becton Dickinson	309602	Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work
Air tank (optional)	Midwest Products	Air Works®	Portable air tank
Rhodamine dye	Thermofisher	D-1817	dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,
20 mL loading tips	Eppendorf	Order no. 5242 956.003	epT.I.P.S. 20 μL Microloader
Compound microscope	Zeiss	Axioskope 2 plus
20x objective	Ziess	Plan-Apochromat 20x/0.75 M27
Camera	Leica	DMC 5400
Leica Application Suite  software	Leica	LAS	Version 4.6.2 used here