Injetando ovos de Gryllus bimaculatus

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para injetar ovos do grilo, uma técnica que sirva como um método fundamental em muitas experiências no grilo, incluindo, mas não limitado a, a interferência do RNA e a manipulação genomic.

Resumo

Alterando a função gênica em um organismo em desenvolvimento é central para diferentes tipos de experimentos. Embora as ferramentas genéticas tremendamente poderosas tenham sido desenvolvidas em sistemas modelo tradicionais, é difícil manipular genes ou RNA mensageiro (mRNA) na maioria dos outros organismos. Ao mesmo tempo, abordagens evolutivas e comparativas dependem de uma exploração da função gênica em muitas espécies diferentes, necessitando do desenvolvimento e adaptação de técnicas para manipular a expressão fora do momento geneticamente tratável Espécie. Este protocolo descreve um método para injetar reagentes em ovos do grilo para ensaiar os efeitos de uma manipulação dada no desenvolvimento embrionário ou larval. Instruções sobre como coletar e injetar ovos com agulhas chanfradas são descritas. Esta técnica relativamente simples é flexível e potencialmente adaptável a outros insetos. Pode-se reunir e injetar dezenas de ovos em um único experimento, e as taxas de sobrevivência para injeções de buffer-only melhorar com a prática e pode ser tão alto quanto 80%. Esta técnica apoiará vários tipos de abordagens experimentais, incluindo a injecção de agentes farmacológicos, o mRNA tampado in vitro para expressar genes de interesse, RNA duplo-encalhado (dsRNA) para alcançar a interferência do RNA, o uso de aglomerados regularmente repetições palindrômicas curtas interespaçadas (CRISPR) em concerto com reagentes de proteína 9 (Cas9) associados à CRISPR para modificação genômica e elementos transponíveis para gerar linhas transgênicas transitórias ou estáveis.

Introdução

A capacidade de modificar o genoma ou influenciar a expressão gênica em organismos é a base para o projeto de muitos tipos de experimentos que testam a causalidade funcional. Também é fundamental para o trabalho comparativo e evolutivamente relevante que técnicas de modificação genômica e não-genômica estejam disponíveis em organismos fora dos sistemas de modelo animal de laboratório genético tradicional (por exemplo, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans). Se é o desejo de compreender a diversidade organizosa¹ ou a adesão ao princípio de Krogh, que para cada questão biológica há um organismo mais adequado à sua solução^{2,3, a}capacidade de modificar genomas ou influência da expressão gênica é essencial para projetos experimentais modernos.

O grilo Gryllus bimaculatus é um sistema emergente de modelo. Usado para o século passado em experimentos de Neurologia⁴, as duas últimas décadas testemunharam um aumento do interesse experimental no críquete, particularmente focado na evolução e desenvolvimento deste organismo⁵. O grilo é um inseto hemimetábolos que ramifica basalmente aos insetos holometábolos well-estudados, tais como D. melanogaster e castaneum do Tribolium⁶. Devido à sua posição útil na árvore evolutiva, os cientistas estão interessados em fazer perguntas experimentais modernas e sofisticadas neste inseto, o que levou a um crescente interesse em adaptar ferramentas moleculares para o uso em G. bimaculatus.

Injeções de reagentes moleculares em ovos de críquete podem ser usadas para experimentos de modificação genômica, bem como manipulações não-genômica da expressão gênica em embriões. Por exemplo, G. bimaculatus transgênica carregando inserções de EGFP foram criadas usando a peptídeo piggybac^7,8. Os investigadores criaram com sucesso o Knockout G. bimaculatus usando nucleases do zinco-dedo (ZFNs) e a transcrição ativador-como (tal) nucleases efetoras (Talens) para introduzir rupturas dobro-encalhados em regiões genomic específicas⁹. Embora ZFNs e TALENs permitam segmentação local específica em animais além dos quatro grandes sistemas de modelos, esses reagentes foram rapidamente ultrapassados pelo sistema CRISPR/Cas9, que é mais simples de usar, mais eficiente e altamente flexível¹⁰. Crispr tem sido usado em G. bimaculatus para produzir knock-out¹¹ , bem como Knock-in linhas^12,13 além de modificação genômica, dsRNA pode ser injetado em ovos para derrubar a expressão de mRNA no desenvolvimento embriões, permitindo que os investigadores compreendam o papel das transcrições específicas ao longo do desenvolvimento^14,15. Alguns detalhes limitados sobre como injetar ovos de críquete foram publicados anteriormente¹².

Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para injetar ovos adiantados do G. bimaculatus . Este protocolo é eficaz e facilmente adaptável a vários ajustes do laboratório, materiais da injeção, e possivelmente a outros insetos. Embora detalhes adicionais para projetar e implementar experimentos de modificação e knockdown genômica tenham sido publicados em outro lugar^12,13, essas^{abordagens, em}última análise, dependem do protocolo de injeção detalhado aqui.

Protocolo

1. configuração de hardware e preparação de materiais

Nota: Consulte a tabela 1 e a tabela de materiais para preparação de soluções, reagentes e detalhes do equipamento.

1. Configurar um microscópio de dissecação para ver os ovos e guiar a agulha de injeção. (Figura 1a mostra um microscópio de dissecação equipado com fluorescência.) A capacidade de fluorescência é vantajosa, mas não necessária.
2. Posicione um micromanipulador de 3 eixos para manobrar a agulha de injeção no lugar (Figura 1a).
3. Configurar um microinjector com tubo e um suporte de agulha para injetar pequenas quantidades de material (Figura 1a). Opcionalmente, use um pedal que não é mostrado na figura.
4. Projete e crie um carimbo para criar poços para ovos (Figura 1C) imprimindo o inverso do padrão desejado, seja com uma impressora 3D ou com um gravador a laser.
   Nota: O carimbo de amostra impresso em 3D mostrado é 4,5 cm x 5 cm com 128, 3 cm x 1 cm x 1 mm saliências para a criação de poços individuais. Detalhes sobre como fazer uma variedade de moldes personalizáveis foram publicados em outros lugares¹⁶.
5. Prepare o tampão de injeção 10x, o soro fisiológico tamponado de HEPES (HBS), e uma solução de estoque da tintura do Dextran de Tetramethylrhodamine e armazene em 4 ° c.
6. Preparar soluções experimentais a serem injetadas, tais como dsRNA, crispr/Cas9¹², elementos transposáveis, in vitro tampado mRNA^{7,8, agentes}farmacológicos¹⁷, zfns, ou Talens⁹.
7. Coloc a fita da dobro-vara em diversas camadas de fita padrão do laboratório em uma corrediça de vidro do microscópio a fim criar uma plataforma 1 milímetro ou assim acima da corrediça de vidro, que será usada segurando agulhas para a avaliação.
8. Prepare um recipiente do grilo aproximadamente 40 cm x 60 cm no tamanho com uma tampa que possui uma abertura mesh-covered para a circulação de ar.
9. Adicione alimentos, água e materiais de abrigando.
10. Adicione várias dúzias de grilos adultos masculinos e femininos saudáveis. Identifique o grilo adulto pela presença de asas.
    Nota: Uma escala de idades do borne-imaginal pode aumentar Rendimentos do ovo. A densidade de grilos deve ser relativamente alta, a fim de ser capaz de coletar ovos suficientes para uma experiência, mas não tão lotado que o canibalismo ocorre. Por exemplo, cerca de duas dúzias de grilos saudáveis, com uma proporção aproximadamente igual de macho para fêmea, em um recipiente do tamanho mencionado acima deve ser suficiente para coletar cerca de 200 ovos em um período de um a dois h. Os grilos podem ser mantidos à temperatura ambiente, mas o desenvolvimento e o comportamento serão ótimos se os grilos forem mantidos em uma incubadora morna (23,5 – 26 ° c), úmida (40-60% de umidade relativa).

2. fazendo agulhas para injeção

1. Use capilares de vidro de borosilicate com filamento (veja a tabela de materiais para detalhes do tamanho). Prepare as agulhas de tração no mesmo dia, ou até alguns dias antes de as injeções estarem concluídas.
2. Coloc um vidro capilar no extrator, centram o vidro no filamento, e apertam os botões para fixar o vidro no lugar.
3. Ajuste a temperatura do extrator perto do Temp da rampa de vidro (-5 ° c a + 10 ° c).
4. Use um único-passo, alto-protocolo de calor para puxar um longo cone com uma pequena abertura, mas evitar derreter as extremidades fechadas.
   Nota: Por exemplo, ao usar o extrator de micropipeta detalhado na tabela de materiais equipados com um filamento de caixa, use os seguintes parâmetros para vidro com uma temperatura de rampa de 478: Heat 478; Puxe 45; Vel. 75; Del 120. As condições ideais para a produção de uma agulha com a forma mostrada na Figura 2b devem ser determinadas empiricamente por cada usuário.
5. Pontas da agulha chanfrada na preparação para as injeções.
6. Molhe o plano do moedor giratório do chanfrador (Figura 2a) com água pingando. Use a osmose reversa (RO) ou o de (DEPC)-água destilada tratada.
7. Coloque a agulha puxada no Biseladora cantos e rode para um ângulo de 20 °.
8. Abaixe a agulha até que ele apenas toca o plano de moagem e bisel para 2 a 3 min.
9. Avalie o chanfro coloc a agulha chanfrada na fita da dobro-vara que foi aderida a uma corrediça de vidro do microscópio.
10. Coloque o slide segurando a agulha no palco de um microscópio composto equipado com uma câmera e software de aquisição de imagem.
11. Adquira uma imagem da ponta da agulha usando um objetivo 20x.
12. Utilize o software de imagem para medir o diâmetro do lúmen interior da agulha apenas proximal à abertura chanfrada (Figura 2C). O tamanho ideal é de 10 μm + 2 μm.
13. Descarte as agulhas com uma abertura inferior a 8 μm e acima de 12 μm.
14. Guarde as agulhas em um recipiente com uma tampa para evitar ficar empoeirado. Use uma tira de cera ou material similar para elevar as agulhas da parte inferior do recipiente para evitar quebrar as pontas (Figura 2D).

3. coleta e preparação de ovos

1. Maximize o número de ovos colocados privando grilos de qualquer material úmido (frascos de água, pratos de ovos) durante a noite ou por pelo menos 8 – 10 h antes de tentar coletar ovos.
   Nota: Desde que as fêmeas têm a habilidade de armazenar internamente o esperma, um procedimento cronometrado diferentemente pode ser necessário se a fecundação com cuidado cronometrada é experimentalmente essencial¹⁸.
2. Faça 40 mL de agarose de 1% em água e despeje em um prato de Petri de 10 cm.
3. Coloc um selo do ovo-poço na superfície do agarose antes que solidifies.
4. Retire o carimbo, uma vez que o agarose é solidificado, para revelar os poços (Figura 1C).
5. Encha a placa de poço de agarose com HBS contendo 1% de penicilina/estreptomicina.
6. Coloque a tampa no prato, enrole no parafilm e armazene a 4 ° c.
   Nota: Os pratos podem ser armazenados por alguns dias a 4 ° c, mas devem ser aquecidos até à temperatura ambiente antes da utilização para evitar a condensação.
7. Faça um prato de coleta de ovos para os grilos para colocar o ovo, preenchendo um prato de Petri de 35 mm com areia branca playground (Figura 1b).
   Nota: A areia especificada na tabela de materiais é do tamanho de grão apropriado. Se os grãos de areia são muito grandes, a areia vai danificar os ovos.
8. Cubra o prato de ovo com um quadrado de papel toalha cortada para ser de aproximadamente 18 cm x 18 cm, e coloque na parte superior do prato com areia. Através desta toalha de papel cobrir o prato cheio com água da torneira.
9. Incline o prato de Petri e aperte suavemente a parte superior para remover o excesso de água.
10. Dobre os cantos do quadrado de papel toalha o prato e coloque o prato de ovo na tampa invertida, que vai ajudar a manter a tampa de toalha de papel no lugar.
11. Coloque o prato de ovo no escaninho de críquete e permitir que as fêmeas adultas para ovipositar ovos para um a dois h.
    Nota: O tempo relativamente curto aqui garante que todos os ovos serão semelhantes no estágio de desenvolvimento no momento da injeção. Se a injeção antes da celularização for importante, as injeções devem ocorrer dentro de 14 h de ovos que colocam¹⁹.
12. Enquanto isso, permitir que o prato de agarose (a partir do passo 3,6) para aquecer a temperatura ambiente em preparação para a realização de ovos para injeção.
13. Retire o prato de coleta de ovos, agora contendo ovos recém-colocados, a partir do escaninho de críquete, e retire a tampa de toalha de papel. Coloque um filtro com um tamanho de poros de 0,5 – 1 mm sobre uma taça de pelo menos 500 mL de capacidade (Figura 1b).
14. Enxágüe o conteúdo do prato de ovos (areia e ovos) no filtro a água da torneira suavemente running deixando os grãos de areia cair através da malha do filtro na água na Taça abaixo, mas deixando os ovos de críquete na cesta do filtro.
15. Encha um recipiente com água RO e coloque-o numa bandeja. Inverta o filtro sobre o recipiente e bata-o contra o prato para desalojar os ovos na água. Os ovos vão afundar para o fundo do recipiente.
16. Corte a ponta de uma ponta de pipeta P1000 com uma tesoura para fazer uma abertura de aproximadamente 3 mm de diâmetro. Coloc esta ponta em um pipetador P1000 e use-a para transferir os ovos do recipiente ao prato do molde do ovo do agarose, transferindo tão pouca água como possível.
17. Use pinças de plástico para a linha de ovos em poços de agarose preenchido com HBS mais 1% penicilina/estreptomicina. Cada ovo vai afundar para o fundo de um indivíduo bem. Cubra com a tampa do prato de Petri até estar pronto para injetar.

4. Prepare o Microinjector

1. Fixe o microinjector a uma fonte de ar comprimido ou de gás (este protocolo foi otimizado usando ar comprimido ou N₂).
   Nota: Se estiver usando um tanque de ar portátil, preencha pelo menos 75 psi. O tanque perderá a pressão do ar durante todo as injeções e pode precisar de ser reenchido; as injeções tornam-se difíceis abaixo de 40psi.
2. Ligue o microinjector. Defina o tempo de injeção para 0,17 s e a pressão para 10 – 15 psi.
   Nota: A pressão exata necessária dependerá da abertura da agulha e deve ser determinada empiricamente para cada rodada de injeção e/ou agulha nova usada.
3. Certifique-se de que o botão BALANCE do microinjector está virado para 0 (normalmente totalmente no sentido anti-horário) e que o microinjector está pressurizado e no modo de injecção .

5. injeções de

1. Filtre cerca de 500 μL de tampão de injecção 10x utilizando uma seringa de 1 mL e um filtro de seringa de 0,45 μm.
2. Misture os reagentes da injeção (os detalhes que se seguem são para a injeção de dsRNA preparado como descrito em¹²).
   Nota: Pode ser aconselhável projetar e executar vários controles, especialmente quando se aprende primeiro esta técnica. Poking ovos sem injetar, injetando buffer + corante sozinho, ou injetando buffer + corante + um reagente de controle (como eGFP dsRNA) são todos bons testes de como disruptivas vários elementos do protocolo de injeção pode ser. Veja a Figura 3 para a capacidade de sobrevivência de vários controles diferentes.
3. Comece com uma alíquota de 4 mL de dsRNA.
4. Adicione 0,5 mL do tampão de injeção 10x filtrado à alíquota de dsRNA.
5. Adicionar 0,5 ml de 50 mg/ml tetramethyl rodamina Dextran Dye Stock Solution. Se trabalhar em um espaço de dissecação sem fluorescência, use o vermelho do phenol preferivelmente.
6. Mantenha todos os materiais no gelo durante a duração do período de injeção.
7. Coloque a solução de injeção em uma agulha de injeção usando pontas de carga de 20 mL e um Pipet P10.
8. Elaborar uma solução injetável de 1,5 mL e inserir a ponta de carga na extremidade larga da agulha de injecção.
9. Ejecte a solução tão distante para baixo na agulha como possível e elimine bolhas de ar sacudendo delicadamente; tenha cuidado para não quebrar a agulha.
10. Coloque o prato de ovos o microscópio de dissecação e selecione uma baixa ampliação de cerca de 10x (1x ampliação visto através de 10x olho objetivos).
11. Insira a agulha na carcaça de injecção e aperte.
    Nota: Tenha cuidado para que a agulha esteja correctamente e firmemente inserida na carcaça. Para fazer isso, puxe a extremidade larga da agulha para fora da carcaça metálica, trazendo a tubulação de silício na carcaça com ele. Ajuste a tubagem de silicone de modo a que a extremidade de vidro da agulha se saliente apenas para além do silício. Se isso não for feito, o tubo de silício pode ser beliscado entre o vidro ea carcaça de metal, bloqueando a extremidade da agulha.
12. Insira cuidadosamente a carcaça de injeção com uma agulha acoplada no micromanipulador. Esteja ciente da extremidade afiada da agulha e tenha cuidado que não é colidido em superfícies e quebrado.
13. Ao olhar ambos os ovos e a agulha através do microscópio, mova a agulha perto dos ovos no canto esquerdo superior da grade do prato.
14. Abaixe a agulha até a ponta entrar no HBS mais 1% de solução tamponada de penicilina/estreptomicina no prato.
15. Centrar a agulha no campo de visão e mover o prato de ovo para que a agulha é de alguns mm mais perto da borda do prato do que os ovos.
16. Não obstrua a vista da grelha dos ovos com a agulha.
17. Ajuste o microscópio ao filtro apropriado para o RHODAMINE assim que é possível observar a fluorescência na agulha e centrar-se sobre a ponta da agulha.
18. No microinjetor, gire lentamente o botão BALANCE no sentido horário até que a solução de injeção comece a vazar da agulha para a solução de suspensão. O número de saldo na tela do microinjector começará a aumentar, embora o valor numérico não seja importante. Em seguida, gire o botão para trás no sentido anti-horário ligeiramente apenas até que o corante pare de vazar da agulha.
    Nota: É crítico ajustar este contrapeso cada vez que uma agulha nova é usada. Sem o equilíbrio ajustado apropriadamente, o microinjector continuará a injetar por algum tempo depois que a injeção é disparada. É mesmo possível que um único impulso do botão de injeção com uma agulha desequilibrada resultará na expulsão de todo o conteúdo da agulha carregada.
19. Com a agulha centrada no campo de visão, mova o prato de ovo para que a agulha é destinada ao ovo a ser injetado primeiro. Recomenda-se que as injeções comecem em um canto da grade de ovos arranjados, por exemplo, o canto esquerdo superior.
20. Ajuste a ampliação para cerca de 50x; nesta ampliação, um único ovo preencherá a maior parte do campo de visão.
21. Use tanto o micromanipulador e uma mão sobre o prato de ovo para mover a agulha em posição para a injeção.
22. Avance a agulha utilizando o micromanipulador e insira a ponta da agulha no primeiro ovo a ser injetado.
23. Insira a agulha a 20 – 30% de comprimento do ovo da extremidade posterior (blunter) do ovo (Figura 1e), perpendicular ao eixo longo do ovo.
24. Injete a solução com o pedal de injecção ou com o botão de injecção no microinjector. Um bolus pequeno do material fluorescente dentro do ovo indicará uma injeção bem sucedida (Figura 1D).
    Nota: Não é incomum que algumas gemas sejam ejetadas do ovo durante a injeção (Figura 1F), e isso não indica necessariamente que o óvulo injetado será inviável.
25. Retraia a agulha do ovo. Se o ovo é levantado involuntariamente fora de seu poço em cima da retração da agulha, use o fórceps pequeno para empurrar o ovo de volta em seu poço ao retrting a agulha.
26. Se a agulha obstruir durante a injeção, retire a agulha do ovo e, mantendo a agulha submersa no HBS mais 1% solução de penicilina/estreptomicina cobrindo os ovos, limpe a agulha entupida usando a função Clear ou empurrando a injeção Botão.
27. Continuando a usar a mesma agulha, repita o procedimento de injeção para o maior número possível de ovos. No início, este pode ser apenas cerca de 20 ou 30 ovos, mas vai aumentar para mais de 100 com a prática.
28. Se a agulha ficar entupida e não puder ser apagada, descarte a agulha, encha uma nova agulha e comece novamente (ou seja, retorne à etapa 5,7).
29. Guarde o prato de ovos injetados em uma incubadora quente (23,5 – 26 ° c) que é levemente úmido (para minimizar a evaporação) até que os embriões tenham atingido o estágio desejado de desenvolvimento para a análise.
30. Pelo menos a cada 24 h, remover os ovos que não são mais viáveis (Figura 3a, B), e substituir a solução de suspensão com HBS fresco mais 1% penicilina/estreptomicina.
31. Dois a três dias após a injeção, transfira os ovos pela pipetagem delicada ou com o fórceps plástico às toalhas de papel umedecidas com HBS mais 1% penicilina/Streptomycin em um prato de Petri lidded para continuar o desenvolvimento na incubadora morna, úmida.
32. Monitore os ovos e remova os ovos que não são mais viáveis a cada dia (Figura 3a, B).

Resultados

Os grilos prontamente colocam ovos no material úmido, e fornecendo material adequado, como areia úmida ou sujeira, induz-os a colocar um grande número de ovos. Isto é especialmente eficaz se os grilos são primeiro privados de material de postura de ovos para 8 – 10 h. os ovos colocados em areia limpa podem ser facilmente separados, recolhidos (Figura 1b) e colocados em poços de ovos concebidos medida para injeção (Figura 1C

Discussão

Os dois desafios principais com esta técnica são as edições relacionadas do tamanho e do survivability óptimos da agulha. Embora as agulhas menores melhorem o survivability, as agulhas com lúmens mais estreitos têm um maior grau de forças capilares no trabalho, que o faz mais provável que o gema se mova na agulha que causa o entupir. Na melhor das casos, os bloqueios podem ser limpos simplesmente injetando outro ovo ou limpando a agulha como descrito acima. Um pode igualmente tentar aumentar a pressão do contra...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent dissecting microscope	Leica	M165 FC	Stereomicroscope with fluorescence
External light source for fluorescence	Leica	EL 6000
Microinjector	Narishige	IM-300	-Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-
mCherry filter cube	Leica	M205FA/M165FC	Filter cube for mCherry or similar red dye will work
Micromanipulator	World Precision Instruments, Inc.	M3301R	Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)
Magnetic stand	Narishige	MMO-202ND
Pipette Holder (Needle holder)	Narishige	HD-21
Tubing to connect air source to microinjector
Egg well stamp	3D printed	custom	3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic
Microwave	various
Incubator or temperature controlled room	various		Temperatures of 23.5-26 °C are needed.
Cricket food	various		cat food or fish flakes are appropriate food.
Cricket water	vairous		Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls
Cricket shelter	arious		Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons
Glass capillary tubes	World Precision Instruments, Inc.	Item no. 1B100F-4	Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament
Micropipette puller	Flaming/Brown	Model P-97	Distributed by Sutter Instrument Co.
Beveller/Micro grinder	Narishige	Model EG-45/EG-400	EG-400 includes a microscope head
Petri dishes	CellTreat	Product code 229693	90 mm diameter
Play Sand	Sandtastik Products Ltd.	B003U6QLVS	White play sand
Agarose	American Bioanalytical	AB000972	Agarose GPG/LE ultrapure
Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers	US Kitchen Supply	Model SS-C123	Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm
Penicillin Streptomycin	Gibco by Life Technologies	Ref 15070-063	Pen Strep
Plastic tweezers	Sipel Electronic SA	P3C-STD	Black Static Dissipative, 118 mm
Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm	Nalgene	725-2545	Use with 1 mL syringe
1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip	Becton Dickinson	309602	Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work
Air tank (optional)	Midwest Products	Air Works®	Portable air tank
Rhodamine dye	Thermofisher	D-1817	dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,
20 mL loading tips	Eppendorf	Order no. 5242 956.003	epT.I.P.S. 20 μL Microloader
Compound microscope	Zeiss	Axioskope 2 plus
20x objective	Ziess	Plan-Apochromat 20x/0.75 M27
Camera	Leica	DMC 5400
Leica Application Suite  software	Leica	LAS	Version 4.6.2 used here