成年小鼠数字截肢和再生:研究哺乳动物暴发体形成和内膜性细胞化的简单模型

摘要

在这里,我们提出了一个成人小鼠端程phalanx截肢的协议,以研究哺乳动物的气肿形成和膜内性渗透,通过荧光免疫组织化学和连续体内微计算断层扫描进行分析。

摘要

在这里,我们提出了成人小鼠远端咽喉(P3)截肢的协议,一个程序简单和可重复的哺乳动物表皮再生模型,其中涉及气肿形成和膜内性内性性荧光免疫组织化学和连续体内微计算断层扫描(μCT)。哺乳动物再生仅限于截肢,横断端法兰克斯(P3) 的远端区域;在更接近的水平上被截肢的数字不能再生,并经历纤维化愈合和疤痕形成。再生反应由增殖性爆发性气肿的调解,然后通过宫内骨质再生来恢复被截肢的骨骼长度。P3截肢是研究哺乳动物表皮再生的临床前模型,是设计治疗策略的有力工具,用成功的再生反应取代纤维化愈合。我们的方案使用荧光免疫组织化学 1) 识别早期和晚期的囊肿细胞群,2) 在再生环境中研究再血管化,3) 无需复杂骨骼即可研究膜内渗透稳定装置。我们还演示了使用连续体在体内μCT来创建高分辨率图像来检查截肢后的形态变化,以及量化再生过程中相同数字的体积和长度变化。我们相信,该协议为研究哺乳动物的表型和组织再生反应提供了巨大的效用。

引言

哺乳动物,包括人类和小鼠,在端法兰克斯(P3)1,2,3的远端截肢后,有能力再生其数字的尖端。在小鼠中,再生反应是截肢水平依赖;越来越近的数字截肢显示逐渐衰减的再生反应,直到完全再生失败在截肢横断和近端的P3指甲矩阵4,5,6^,7,8.P3再生由形成大爆炸体介导,定义为通过形态形成来再生被截肢结构的增殖细胞群9。形成大爆炸体以再生截肢失去的结构,这个过程称为表皮再生,将多组织级P3再生反应与损伤后的传统组织修复区分^开来。 10.P3再生是一个可重复和程序简单的模型,研究复杂的再生过程,包括伤口愈合11,12,骨质变11,12,再血管^化13,外周神经^再生14,并通过宫内骨化15向骨转化。

以前使用免疫性化学的研究表明,气肿是异质的,血管,缺氧,和高度增殖11,13,15,16。在远端P3截肢后,早期大发肿最初与P3型骨质和内膜有关,其特征是骨^表面15附近有旺盛的增殖和新生的成骨。在骨降解和伤口闭合之后,异质性大爆发肿由围锁细胞和内窥镜相关细胞的合并形成,然后通过膜内骨化^{分化包括骨骼在内的囊肿成分分化15}.

骨修复对损伤的反应通常发生内肠骨化,即通过初始的软骨,形成一个模板,为后续的骨形成17,18 。长骨内膜化,即骨形成无软骨中间体,通常诱导使用复杂的分心装置或手术固定19,20。数字再生反应是一种临床前模型,与传统的膜内沉降模型相比具有优势:1) 它不需要外部或内部固定损伤后刺激膜内沉降,2)使用每只动物的 4 位数字进行,从而在最大程度地减少动物使用的同时最大化样品,并且 3) 可轻松、快速地执行体内连续微计算断层扫描 (μCT) 分析。

在本研究中,我们展示了标准化的P3截肢平面,以实现可重复和强健的再生反应。此外,我们演示了优化的荧光免疫组织化学方案,使用石蜡部分来可视化气肿形成、再生环境中的再血管化,以及通过膜内向骨的气管转换骨化。我们还演示了在再生过程中使用连续体内-CT来识别同一数字的骨骼形态、体积和长度的变化。该协议的目的是研究截肢后的哺乳动物气肿形成,并演示2种技术,荧光免疫组织化学和连续体内-CT,用于研究宫内骨再生。

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研究方案

所有动物使用和技术都符合得克萨斯A&M大学机构动物护理和使用委员会的标准操作程序。

1. 成年小鼠下肢截肢 P3

1. 麻醉8至12周大的CD-1小鼠(材料表),在氧气中使用非氧气体;最初在腔室中麻醉3%,随后在手术期间由诺塞酮提供2%的配苯。在眼睛上涂上眼药膏,防止麻醉时干燥。
   注:在我们的实验室中标准化的成人P3截肢研究是在8至12周大的小鼠身上进行的,所有测试菌株都保存了再生反应。
2. 在10倍解剖显微镜下,用外科的波维多尼碘和70%乙醇对后肢的数字进行消毒。使用微剪刀修剪远离手术部位的头发。在当地应用1 μL局部局部的布比瓦卡因对手术部位进行麻醉。
3. 使用无菌#10手术刀(图1A)在各后肢2和4位上截肢的远端法兰克斯(P3)。截肢必须在无菌条件下进行,包括手术器械的绝育。在解剖显微镜下,轻轻涂抹后爪,露出中位表面。持手术刀与脂肪板平行的角度执行图1B所示的截肢手术。在截肢部位应用1μL局部布比瓦卡因。
   注:截肢横切指甲器官,真皮,P3骨,血管和神经,但不转直骨髓腔或数字脂肪垫。如果观察到出血,请使用无菌棉尖施用器直接施加压力。
4. 标准P3远端截肢平面可去除P3骨^量21的约15%~20%。可以执行微CT扫描(见下文),以确认正确的截肢长度。
5. 将鼠标返回到干净的笼子,让伤口愈合,无需敷伤。监视鼠标 3 天,以确保鼠标恢复正常活动。

2. 数字采集和组织制备

1. 在封闭的腔室中使用二氧化碳(CO2)对小鼠实施安乐死,然后是宫颈脱位。
2. 使用手术刀将数字切断中间穿过相邻的骨段,中间法兰克斯 (P2) 骨骼,大约在第二个腹腔脂肪垫缩进处。将数字转移到含有10 mL新鲜缓冲锌甲苯固定剂的20 mL闪烁小瓶中,这是一种18%的甲醛溶液(见材料表)。固定体积应至少是组织体积的20倍。
   注:在截肢后的各个时间点收集数字,以调查完全再生反应。一般来说,对于早期爆发性形成、骨组织裂散和伤口闭合,收集时间点是截肢后4~8天(DPA)。为了研究早期骨质增生,收集时间点是 9 和 10 DPA,并可视化骨再生和矿化,收集时间点是 14、21 和 28 DPA。收集未显示的数字。
3. 在室温下,将数字固定为 24-48 小时,并在摇床上轻轻混合。
4. 在室温下,在 5 x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的 5 mL 中去除固定值并洗涤数字 2x 5 分钟。
5. 将10 mL的新鲜分压剂I(见材料表),一个10%的酸溶液,放入闪烁小瓶中,在室温下轻轻混合在摇摇器上2小时。2 小时后,用新鲜溶液更换十进制I,并在室温下过夜,在摇床上温和混合。
6. 取出十进制 I,在室温下在 5 mL 的 1x PBS 中清洗数字 2x 5 分钟。
7. 通过分级乙醇系列处理数字。此过程可在 20 mL 闪烁小瓶中手动执行,如果总数字小于 40,则使用每液体的 10 mL。
   1. 在室温下将2次浸入新鲜70%乙醇,在摇床上轻轻混合1小时,随后在室温下将2次浸入新鲜95%乙醇中,在摇床上轻轻混合1小时。
   2. 在室温下用2次新鲜100%乙醇进行2次灌扫,在摇床上温和混合,每次1小时,完成数字脱水。最后的100%乙醇清洗可以留过夜。
8. 在同一闪烁小瓶中,用10 mL的新鲜二甲苯替换100%乙醇,并在室温下将小瓶置于化学烟气罩中1.5小时。在室温下,在化学烟气罩中重新清洗二甲苯1.5小时,共洗2次。
9. 用液石蜡将二甲苯更换至68°C,并将小瓶置于68°C的培养箱中2小时2次。在石蜡中浸泡4个总h后,嵌入石蜡切片的数字。
   注:可以按照这些相同的准则,在自动处理器中执行公司学的数字处理。
10. 使用微缩器在 4~5 μm 厚度下分段数字。将切片样品放在胶合幻灯片上,使用 38°41 °C 水浴,辅以组织粘性粘合剂溶液,以确保样品粘附在滑道上。将幻灯片放在 37 °C 的滑道加热器上晾干。

3. 成年小鼠数字的免疫组织化学染色,以研究囊肿形成和宫内性性奥西化

1. 加热切片在65°C下滑动45分钟,随后在37°C加热不少于15分钟,以确保样品粘附在幻灯片上。
2. 脱氧乙酰和再水化滑片2x,用5分钟的二甲苯,分级乙醇系列,并浸入水中。将幻灯片放入 50~100 mL 容量的染色罐中,并浸入 1x Tris 缓冲盐水中,带 Tween 20 (TBST)。
   注:请勿让样品在整个染色过程中干燥。在任何 TBST 步骤中,幻灯片的孵育时间可达 2 小时。
3. 准备一个加湿室。一个1英寸深的盖塑料滑动盒,底部有湿润的纸巾就足够了。
4. 为 Runx2、Osterix (OSX) 和增殖细胞核抗原 (PCNA) 准备热回收解决方案。对于早期骨原体标记物 Runx2 的抗原检索,准备 Tris-EDTA 的 1x 溶液,pH 8。对于成骨标记 OSX,准备 1x 的齐特缓冲液溶液 pH 6。PCNA 免疫染色可在任一溶液中执行。
5. 为胚片标记 CXCR4²²和内皮细胞标记器 von Willebrand 因子 8 (vWF) 准备蛋白酶 K 抗原检索溶液,将 100 μL 蛋白酶 K 溶液置于微离心管中,并加热至 37°C(约5 分钟)。
   注:使用热检索对 Runx2、OSX 和 PCNA 执行抗原检索,通过蛋白酶 K 处理执行 CXCR4 和 vWF 抗原检索。
6. 对于需要加热的抗体检索,在适当的抗原检索溶液中浸入染色罐中。加热至 95°C 25 分钟,确保不发生沸腾。从热源中取出染色罐,在室温下冷却 35 分钟。
7. 对于蛋白酶 K 抗原检索,将幻灯片平放在加湿室中,并将 100 μL 的预加热蛋白酶 K 放在幻灯片上。用一小块片状薄膜盖住幻灯片,以确保幻灯片不会变干。在 37°C 下孵育幻灯片 12 分钟。
8. 在抗原回收后,在染色罐中清洗3次,在1xTBST中5分钟。
9. 从染色罐中取出滑片,放入加湿室。在幻灯片上放置 6-7 滴阻隔溶液(材料表),用新鲜的石蜡薄膜覆盖幻灯片,以确保幻灯片不会变干。在室温下孵育幻灯片1小时。
10. 通过将抗体稀释成抗体稀释剂(材料表)来制备主要抗体。涡旋每个初级抗体溶液为3s.初级抗体从不同的宿主物种可以组合。
    注:Runx2 的免疫组织化学染色(兔子抗 Runx2 抗体,1:250 稀释,最终浓度为 4 μg/mL)与 PCNA(单克隆小鼠抗 PCNA 抗体,1:2,000 稀释,最终浓度为 0.5 μg/mL)和 OSX(兔子抗 OSX)抗体,1:400稀释,最终浓度为0.125微克/mL)与PCNA结合,如图2所示。本研究中使用的小鼠抗PCNA抗体是高度特异性的,不需要超出本协议中概述的阻塞步骤。使用CXCR4(大鼠抗CXCR4抗体,1:500稀释,最终浓度为2微克/mL)和vWF(兔子抗人vWF VIII抗体,1:800稀释,最终浓度为41.25微克/mL)的免疫组织化学染色如图2所示。初级抗体由我们的实验室根据该协议的条件下进行优化和测试,并列在材料表中。
11. 小心地取出石蜡薄膜,然后轻轻地将幻灯片排到纸巾上,以去除多余的阻滞溶液。将100~200 μL的原发抗体溶液放在幻灯片上,更换副膜盖,然后返回加湿室。在4°C的封闭加湿室中孵育幻灯片过夜。
    注:排空堵塞溶液时,不要让滑片变干。此步骤执行速度很快。
12. 小心地取出副膜,然后轻轻地从幻灯片中排出原抗体溶液。将幻灯片放入含有新鲜 1X TBST 的染色罐中。用新鲜的1xTBST清洗5分钟3次。
13. 通过与抗体稀释剂(材料表)结合制备二级抗体。涡旋的二级抗体溶液为3s.二级抗体结合不同的荧光团派生从不同物种可以组合。
    注:荧光二级抗体对光敏感。Alexa Fluor 488-偶联山羊抗兔子IgG (H+L) 用于 Runx2, OSX 和 vWF,针对 CXCR4 的 Alexa Fluor 568 偶联山羊抗鼠 IgG (H+L),以及用于 PCNA 的 Alexa Fluor 647 偶联山羊抗小鼠 IgG (H+L),在 1:500 稀释,最终浓度为 4 μg/mL,如图2所示。
14. 将200 μL的二级抗体溶液放在幻灯片上,用新鲜的石蜡薄膜覆盖幻灯片,然后返回到加湿室。在室温下在封闭的加湿室中孵育幻灯片45分钟。确保加湿室关闭,以避免光线照射。
15. 小心地取出石蜡薄膜,然后轻轻地从滑道中排出二级抗体溶液。将幻灯片放入含有新鲜 1x TBST 的染色罐中。用新鲜的1xTBST清洗5分钟3倍。避免光线。
16. 准备核污点将 20 μL 的 DAPI(库存 DAPI 溶液在 H₂O 中为 5 mg/mL)添加到 200 mL 的 1x PBS 中,并大力摇动以确保均质性。在 DAPI-PBS 解决方案中浸泡幻灯片 5 分钟。避免光线。
17. 在 dH₂O 中清洗滑轨 3 分钟,将水解欢庆,让滑轨风干或轻轻地吸出滑道中的水,确保吸尘时样品不会受到干扰。避免光线。
18. 使用 100 μL 防褪色安装介质(材料表)小心地盖上干滑片;避免在安装步骤期间在滑轨上形成气泡。将滑片平放,让安装介质在室温下在防光容器中过夜干燥。安装介质干燥后,将幻灯片平放在 4°C 的防光容器中,直到准备查看。
    注:如果安装后存在不可接受的气泡水平,则可将安装的滑轨轻轻放置在 1x PBS 中,可以拆下盖玻片,一旦滑片在水中再次冲洗并重新干燥,即可重新安装。

4. 显微镜和图像分析

注:本实验使用荧光去卷积显微镜和相关软件进行成像和分析,配备 3 个荧光过滤器(用于可视化 Alexa Fluor 488、568 和 647 nm 信号),以及 DAPI(419 nm)。

1. 以 10 倍放大倍率拍摄幻灯片,以捕获整个大爆炸区。
   注:增殖性成骨原抗体检测利用二级抗体(Alexa Fluor 488 和 647)具有非重叠发射光谱,以尽量减少对共标记细胞的错误识别。可以使用 568 nm 滤波器执行自荧光信号的背景减法,以确保 488 或 647 信号的完整性。Blastema 原抗体检测利用二级抗体(Alexa Fluor 488 或 568)。如果使用 488 结合抗体,可以使用 568 滤波器执行自荧光信号的背景减法,488 滤波器使用 568 偶联抗体。自荧光信号通常与整个数字中的指甲板和红细胞相关,并在 488、568 和 647 滤波器中观察到。

5. 连续在Vivo微计算断层扫描(+CT)

1. 本实验中使用 vivaCT 40(材料表)在截肢前1天(未截肢)、1 DPA 和不同时间点再生同一动物的位数,直到使用 vivaCT 40(材料表)在 28 DPA 处完全再生,图 3A.
2. 将 μCT 与油管配合,使氧气流入和流出 μCT 动物室,确保流出的氧气配备活性炭过滤器,以捕获异二苯。
   注:确保 _CT 动物室紧密封闭;这样,在扫描过程中,动物鼻锥不需要向小鼠提供异类胶。
3. 准备 μCT 扫描参数。通过连续旋转,以 10.5 μm、55 kVp、145 uA 和 1000 个投影(每 180°)进行扫描,集成时间为 200 毫秒,每次扫描最多可扫描 213 片。在此实验中执行的扫描时间约为 9 分钟。电流降低可以通过按比例增加的积分时间进行补偿,但会导致更长的扫描时间。
4. 使用胶质麻醉成年小鼠;最初在腔室中以3%麻醉,随后在扫描期间向_CT动物室供应1.5%异二苯。轻轻地将鼠标放在 μCT 动物室中,后肢数字排列在紧密关联、扁平、腹腔侧向,左侧爪位于扫描平台的左侧,右侧的右爪位于扫描平台上,然后用手术将数字轻轻固定到位磁带。在眼睛上涂上眼药膏,防止麻醉时干燥。
5. 将鼠标返回到干净的笼子并监视鼠标直到唤醒。继续在双周到每周时间点扫描同一鼠标,以可视化整个骨骼再生响应。
6. 扫描后,允许长达几个小时进行 _CT 图像重建。使用随 _CT 提供的软件,将文件转换为一系列 dicom 文件;每个 dicom 文件将对应于扫描的一个切片,因此,如果扫描了 213 个切片,将生成 213 个 dicom 文件并上载到公司的服务器。
7. 使用 Web 浏览器中的批处理文件下载器在单个文件夹中下载 dicom 系列。
8. 下载 BoneJ 插件²³并将文件拖到 ImageJ 插件文件夹中。在 ImageJ 中,通过将文件夹拖放到 ImageJ 栏,将 dicom 文件系列作为堆栈打开。将打开一个显示所有灰色值的 16 位图像堆栈。要仅显示骨骼,请执行图像阈值(I理算 > 调整 > 阈值)。
   注:查看 ImageJ 文件时,ImageJ 输出将对应于数字的倒影;即,数字排列在扫描平台的通风侧向上,左爪在平台左侧,右爪在平台右侧,将显示为背侧向上,右爪在左侧,左爪在图像J图像堆栈的右侧。
9. 打开阈值对话框后,将与上阈值相对应的底部栏向右滑动,并调整与下阈值相对应的顶部栏,直到仅将骨骼突出显示为红色。最低阈值约为 10,000~13,000,最大信号强度为 32,767。单击"应用",并在新对话框中单击黑色背景。单击"确定"。
10. 将生成显示黑白值的 8 位图像,其中白色对应于骨骼。通过在它周围绘制一个矩形来选择 P3 骨骼,然后复制堆栈。生成 3D 图像 (插件> 3D 查看器)要从图像中裁剪任何不必要的骨骼,请单击手绘选择工具,然后圈出要删除的骨骼。右键单击,然后选择"填充选择"以删除骨骼。
    注:上述步骤适用于 ImageJ 1.52h、Java 8,在使用不同版本的 ImageJ 时可能略有不同。对于阈值,我们建议确定最优值并一致地使用该值。
11. 使用 BoneJ 体积分数插件 (插件> BoneJ >体积分数) 从 3D 渲染中量化骨骼体积。将显示一个结果窗口,骨骼体积 (BV) 将以 mm³显示。
12. 使用 ImageJ 多点工具量化 3D 渲染中的骨骼长度。
    注:骨骼长度在P3再生过程中是动态的;长度在与骨细胞介导的骨降解相关的7-10 DPA之间^减少11,然后是14-28 DPA之间的远骨再生期(图3B)。长度从 P2/P3 接头的中央基部到远端骨尖处的矿化最远点进行测量,但不包括已完全分离的退化骨骼(图 3B)。BoneJ 允许对骨骼结构进行全面的 3D 评估;因此,扫描骨骼的角度不会改变测量长度的能力。
13. 通过单击"查看"并拍摄快照来捕获3D 渲染的图像。将图像另存为 tif 或 jpeg 文件。

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结果

成年小鼠在 6/7 DPA(图2A-D)、9 DPA(图 2E-H)和 10 DPA(图 2I-L)时重新生成 P3 位数字,免疫中带有 Runx2、OSX 和 PCNA 的抗体,以可视化膜内骨骼再生,免疫染色与抗体CXCR4和vWF可视化爆发性形成。在截肢前和再生过程中不同时间点扫描的数字的代表性CT渲染(图3A,B)和用于识?...

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讨论

该协议描述了成人小鼠远端P3截肢的标准化程序,荧光免疫组织化学染色,以可视化和调查气肿形成和膜内性渗透,并连续在体内进行_CT扫描到识别截肢后的骨形态、体积和长度变化。P3截肢是一种独特的,程序简单,可重复的模型,以分析一个促进再生的伤口环境,触发出血形成。此外,P3数字模型具有许多优点,比传统的骨损伤模型,以研究膜内骨化。

为确保此协议的成功,必须执行完整...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein Block Serum Free	DAKO	X0909	Ready to use
Mouse anti-PCNA antibody	Abcam	ab29	1:2000 dilution
Rat anti-CXCR4 antibody	R&D Systems	MAB21651	1:500 dilution
Rabbit anti-human vWF XIII antibody	DAKO	A0082	1:800 dilution
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody	Abcam	ab22552	1:400 dilution
Rabbit anti-Runx2 antibody	Sigma-Aldrich Co.	HPA022040	1:250 dilution
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A21235	1:500 dilution
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11008	1:500 dilution
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Invitrogen	A11077	1:500 dilution
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930	Ready to use
Surgipath Decalicifier 1	Leica Biosystems	3800400	Ready to use
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative	Anatech LTD	174	Ready to use
CD-1 Female Mouse	Envigo	ICR(CD-1)	8-12-weeks-old
vivaCT 40	SCANCO Medical