成体マウスの解離と再生:哺乳類のブラステマ形成と腸内形成を調べるための簡単なモデル

要約

ここでは、哺乳類のブラセマ形成と内皮形成を調べ、蛍光免疫組織化学と順次生体内マイクロコンピュータ断層撮影により分析した成体マウス末端ファランクス切断のプロトコルを提示する。

要約

ここでは、成体マウス遠位末端ファランクス(P3)切断のプロトコルを提示し、皮炎形成とイントラメブラヌス系化を含むエピモーフィック再生の手続き的に単純で再現可能な哺乳類モデルを提示する。蛍光免疫組織化学および順次生体内マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)。哺乳類の再生は、末端ファランクス(P3)の遠位領域を伝える切断に限定される。より近位レベルで切断された数字は、再生に失敗し、線維性治癒および瘢痕形成を受ける。再生応答は、増殖性芽細胞の形成によって媒介され、続いて骨の骨再生を経て、切断された骨格の長さを回復させる。P3切断は、哺乳類のエピモーフィック再生を調査する前臨床モデルであり、線維性治癒を正常な再生応答に置き換える治療戦略の設計のための強力なツールである。我々のプロトコルは、蛍光免疫組織化学を使用して1)早期および後期のブラセマ細胞集団を同定し、2)再生の文脈における再血管化の研究、および3)複雑な骨を必要とせずに内膜骨化を調査する安定化デバイス。また、生体内μCTでシーケンシャルを用いて、切断後の形態変化を調べる高解像度画像を作成し、再生過程で同じ数字の体積と長さの変化を定量化することも実証しています。このプロトコルは、哺乳類におけるエピモーフィック応答と組織再生応答の両方を調査する上で大きな有用性を提供していると考えています。

概要

ヒトおよびマウスを含む哺乳動物は、末端ファランクス(P3)1、2、3の遠位切断後に自分の桁の先端を再生する能力を有する。マウスでは、再生応答は切断レベルに依存します。ますます近位桁切断は、P3爪マトリックス4、5、6に近接および近接切断で完全な再生障害が完全になるまで、徐々に減衰した再生応答を示す^,7,8.P3再生は、ブラステマの形成によって媒介され、切断された構造9を再生するために形態形成を受ける増殖細胞の集団として定義される。切断によって失われた構造を再生するブラステマの形成は、エピモーフィック再生と呼ぶプロセスで、傷害後の従来の組織修復から多組織レベルのP3再生応答を区別^{する6、 10.}P3再生は、創傷治癒11、12、骨の有面性を含む複雑な再生プロセスを調査するための再現性と手続き的に単純なモデルです 11,^12,血管化13、末梢神経再生14、および骨へのブラステマル変換は、内膜神経^化15を介して行う。

免疫組織化学を用いたこれまでの研究では、ブラステマが不均一、血管、低酸素、および高増殖性11、13、15、16であることが実証されている。遠位P3切断に続いて、初期の芽細胞は、最初にP3骨膜および内皮に関連し、骨^表面15に隣接する堅牢な増殖および新生骨形成によって特徴付けされる。骨の劣化と創傷の閉鎖に続いて、異種芽細胞は、骨膜細胞とエンドストール関連細胞の結合によって形成され、続いて骨を含むブラステマル成分の分化^{が起こる。15}.

傷害に対する骨修復は、典型的には、内軟骨骨化によって、すなわち、その後の骨形成17、18のためのテンプレートを形成する初期軟骨カルスを介して起こる。長い骨内皮形成、すなわち、軟骨中間体を持たない骨形成は、一般的に複雑な気晴らし装置または外科的固定を用いて誘導される19、20である。数字の再生応答は、従来のトラメランブラス系化モデルに対する利点を提供する前臨床モデルである:1)内皮骨化を刺激するために外部または内部固定後損傷を必要としない、2)それは各動物から4桁の数字を用いて行い、動物の使用を最小限に抑えながらサンプルを最大化し、3)生体内マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)解析を容易かつ迅速に行うことができる。

本研究では、再生可能で堅牢な再生応答を達成するために標準化されたP3切断面を示す。さらに、我々は、視芽細胞の形成、再生のコンテキストでの再血管化、および皮骨内形成による骨へのブラステマル変換を可視化するためにパラフィンセクションを使用して最適化された蛍光免疫組織化学プロトコルを実証する。骨化。また、順次生体内μCTを用いて、再生過程における骨形態、体積、長さの変化を同じ桁で同定する方法も示す。このプロトコルの目的は、切断後の哺乳類の芽細胞形成を調査し、イントラメブラヌス骨再生の研究のために、生体内μCTにおける蛍光免疫組織化学および順次2つの技術を実証することである。

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プロトコル

すべての動物の使用と技術は、テキサスA&M大学の機関動物ケアおよび使用委員会の標準的な操作手順に準拠していました.

1. アダルトマウス後肢遠位P3切断

1. 酸素中のイソルランガスを用いて8~12週齢のCD-1マウス(材料表)を麻酔する。最初はチャンバー内で3%で麻酔を行い、続いて手術期間中にノセコーンによって供給される2%のイソファルランが続く。麻酔下での乾燥を防ぐために、眼科の目に眼のチントを適用します。
   注:私たちの研究室で標準化された成人P3切断研究は、8〜12週齢のマウスで行われ、再生応答はすべての試験された株で保存される。
2. 10倍の解剖顕微鏡の下で、外科ポビドネヨウ素および70%のエタノールと後肢の数字を殺菌する。マイクロハサミを使用して外科部位から髪をトリミングします。局所的なブピヴァカインの1 μLを局所的に適用し、手術部位を麻酔する。
3. 滅菌#10メスを用いて、各後肢の2桁目と4桁上の末端ファランクス(P3)の遠位先端を切断する(図1A)。切断は、手術器具の殺菌を含む無菌条件下で行われなければならない。解剖顕微鏡の下で、後ろ足をそっと軽くこたえて中間桁面を露出させる。脂肪パッドに平行な角度でメスを保持し、図 1Bに示す切断を実行します。局所ブピバカインの1 μLを切断部位に塗布する。
   注:切断は、爪器官、真皮、P3骨、血管系、神経を透過させるが、骨髄腔または数字脂肪パッドを透過しない。出血が観察される場合は、無菌綿先端アプリケーターを使用して直接圧力を加える。
4. 標準的なP3遠位切断機はP3骨容^積21のおよそ15%-20%を取除く。マイクロCTスキャン(下記参照)は、正しい切断長を確認するために行うことができる。
5. マウスを清潔なケージに戻し、創傷のドレッシングなしで傷口を治癒させます。マウスを 3 日間監視して、マウスが通常の動作に戻ることを確認します。

2. 桁の回収と組織の調製

1. 閉じたチャンバー内の二酸化炭素(CO2)を用いてマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。
2. メスを使用して、隣接する骨セグメントである中央ファランクス(P2)骨を通して、ほぼ2番目の腹部脂肪パッドのインデントで桁を切断します。10 mLの新鮮な緩衝亜鉛ホルマリン固定液を含む20 mLシンチレーションバイアルに桁を移し、18%ホルムアルデヒド溶液(材料の表を参照)。固定体積は、存在する組織の体積の少なくとも20倍であるべきである。
   注:完全な再生応答を調査するために、切断後のさまざまな時点で数字が収集されます。一般に、初期の芽細胞形成、骨組織組織、および創傷閉鎖の収集時間点は切断後4~8日(DPA)である。初期の骨芽細胞を調査するために、収集時間ポイントは9と10 DPAであり、継続的な骨再生および鉱物化を可視化するために、収集時間は14、21、および28 DPAである。アンプされていない数字も収集されます。
3. シェーカーに穏やかな混合で室温で24-48時間の数字を修正します。
4. 固定液を取り外し、室温で1xリン酸緩衝生理食生(PBS)の5 mLで5分間2xを洗浄します。
5. 10mLの新鮮なデカルシフィエI(材料の表を参照)を10%ギ酸溶液をシンチレーションバイアルに入れ、室温で2時間シェーカーに優しく混ぜます。2時間後、デカルシフィエIを新鮮な溶液に交換し、シェーカーで穏やかな混合で室温で一晩数字をデカールします。
6. デカルシフィエIを取り外し、室温で1x PBSの5 mLで5分間2xを洗います。
7. 等級付きエタノールシリーズを通して数字を処理します。このプロセスは、合計桁数が40桁未満の場合、各液体の10 mLを使用して、20 mLシンチレーションバイアルで手動で行うことができます。
   1. シェーカーに穏やかな混合で室温で新鮮な70%エタノールで2浸漬から始め、続いて、シェーカーで穏やかに混合して室温で新鮮な95%エタノールで2つの浸漬を、それぞれ1時間。
   2. 温度で新鮮な100%エタノールを2度洗い、シェーカーで穏やかに混合し、それぞれ1時間ずつ脱水を完了します。最後の100%エタノール洗浄は一晩残すことができます。
8. 同じシンチレーションバイアルで、100%エタノールを10mLの新鮮なキシレンに置き換え、室温で1.5時間の化学ヒュームフードにバイアルを入れます。化学ヒュームフードにキシレンを1.5時間室温で2回繰り返します。
9. キシレンを68°Cに溶かした液体パラフィンワックスに置き換え、バイアルを68°Cのインキュベーターに2時間、2回置きます。パラフィンワックスに浸漬の4合計hの後、パラフィン断面化のための数字を埋め込みます。
   注:ヒスロジーのディジット処理は、これらの同じガイドラインに従って、自動化されたプロセッサで実行できます。
10. マイクロトームを使用して4~5μmの厚さの断面桁。粘着スライドに断面サンプルを置き、38~41°Cの水浴を組織学用接着剤溶液で補い、サンプルがスライドに付着していることを確認します。スライドを37°Cのスライドウォーマーに置き、乾燥させます。

3. ブラステマ形成と腸内形成を調べるための成体マウス数字の免疫組織化学染色

1. 65°Cで45分間断熱し、続いて37°Cで15分以上加熱し、サンプルがスライドに付着していることを確認します。
2. 脱パラフィン化し、キシレンの5分の洗い流し、等級のエタノールシリーズ、および水中の浸漬でスライド2xを水分補給します。スライドを50~100mLの容量染色瓶に入れ、Tween 20(TBST)で1xトリスバッファド生理生理に浸しておきます。
   注:染色プロセス全体を通してサンプルを乾燥させないようにしてください。TBSTのステップでは、スライドは2時間までインキュベートすることができる。
3. 加湿室を準備します。ベースに湿ったティッシュペーパーが付いている1インチの深い覆われたプラスチックスライド箱は十分である。
4. Runx2、オステリックス(OSX)、増殖細胞核抗原(PCNA)の熱検索溶液を準備します。早期オステオプロゲニターマーカーRunx2の抗原検索のために、トリス-EDTA、pH8の1x溶液を調製する。骨芽球マーカー、OSXについて、クレートバッファー、pH6の1x溶液を調出す。PCNA免疫染色は、いずれの溶液でも行うことができる。
5. ブロステママーカーCXCR4²²および内皮細胞マーカーフォン・ヴィレブランド因子8(vWF)に対するプロテパネーゼK抗原検索液を、マイクロ遠心管内のスライドあたり100μLのプロテインサーゼK溶液を配置し、37°C(約37°C)に加熱することにより、プロテインサーゼK抗原検索液を調剤する。5分)。
   注:Runx2、OSX、およびPCNAに対する抗原検索は熱検索を用いて行われ、CXCR4およびvWF抗原検索はプロテネーゼK処理を介して行われる。
6. 熱を必要とする抗体検索の場合は、適切な抗原検索溶液中の染色瓶にスライドを浸漬する。25分間95°Cに熱スライドし、沸騰が起こらないようにします。熱源から染色瓶を取り出し、室温で35分間冷やします。
7. プロテインセK抗原検索の場合は、加湿室にスライドを平らに置き、スライド上に予め温められたプロテインパーセKの100 μLを配置します。スライドが乾燥しないように、パラフィルムの小さなストリップでスライドをカバーします。37 °Cで12分間スライドをインキュベートします。
8. 抗原検索後の染色瓶で1x TBSTで5分間スライドを3回洗います。
9. 染色瓶からスライドを取り出し、加湿室に置きます。スライド上に6~7滴のブロッキング溶液(材料の表)を置き、スライドが乾燥しないように新鮮なパラフィンフィルムでスライドを覆います。室温で1時間スライドをインキュベートします。
10. 抗体を抗体希釈剤に希釈して一次抗体を調作する(材料の表)。異なる宿主種に由来する3s.一次抗体に対する各一次抗体溶液のボルテックスを組み合わせてもよい。
    注:Runx2(ウサギの抗Runx2抗体、1:250希釈、4μg/mLの最終濃度で)とPCNA(モノクローナルマウス抗PCNA抗体、1:2,000希釈、0.5μg/mL)の最終濃度で、OSX(ウサギ抗OSX)の免疫組織化学染色抗体は、1:400希釈、PCNAと組み合わせた0.125 μg/mLの最終濃度で、図2に示す。本研究で使用されるマウス抗PCNA抗体は非常に特異的であり、このプロトコルで概説されているもの以外の追加のブロッキングステップを必要としない。CXCR4を用いた免疫組織化学染色(ラット抗CXCR4抗体、2μg/mLの最終濃度で1:500希釈)およびvWF(ウサギ抗ヒトvWFVIII抗体、1:800希釈、41.25 μg/mLの最終濃度で)を用いた免疫組織化学染色を図2に示す。一次抗体は、このプロトコルの条件下で当社のラボによって最適化され、テストされ、材料の表に記載されています。
11. 慎重にパラフィンフィルムを取り除き、余分なブロッキング溶液を除去するためにティッシュペーパーにスライドを穏やかに排出します。一次抗体溶液の100~200μLをスライド上に置き、パラフィルムカバーを交換し、加湿室に戻します。閉鎖された加湿室のスライドを4°Cで一晩インキュベートする。
    注:ブロッキング溶液を排出している間、スライドが乾燥しないようにしてください。この手順は、迅速に実行されます。
12. 慎重にパラフィルムを取り外し、スライドから一次抗体溶液を穏やかに排出します。スライドを新鮮な1X TBSTを含む染色瓶に入れます。新鮮な1x TBSTで5分3回洗います。
13. 抗体希釈剤(材料表)と組み合わせて二次抗体を調記する。3s.二次抗体に対する二次抗体溶液のボルテックスは、異なる種に由来する異なる蛍敵に結合してもよい。
    注:蛍光二次抗体は光感受性である。Runx2のアレクサフルオール488-共役ヤギアンチウサギIgG(H+L) OSX、およびvWF、Alexa Fluor 568-共役ヤギ対ラットIgG(H+L)、PCNA用のアレクサフルーサ647結合ヤギ抗マウスIgG(H+L)、最終濃度4μg/mLで1:500に希釈を図 2で使用しました。
14. スライド上に200 μLの二次抗体溶液を置き、新鮮なパラフィンフィルムでスライドをカバーし、加湿室に戻ります。室温で45分間、閉じた加湿室でスライドをインキュベートします。加湿室が光を避けるために閉まっていることを確認してください。
15. パラフィンフィルムを慎重に取り出し、スライドから二次抗体溶液を穏やかに排出します。スライドを新鮮な1x TBSTを含む染色瓶に入れます。新鮮な1x TBSTで5分3倍洗います。光を避けてください。
16. 核染色を準備しろDAPIの20 μL(ストックDAPI溶液はH2Oで5mg/mL)を1x PBSの200 mLに加え、均質性を確保するために激しく振ります。DAPI-PBS溶液で5分間スライドを浸します。光を避けてください。
17. dH₂Oでスライドを3分間洗浄し、スライドを空気乾燥またはスライドから穏やかに吸引させ、真空中にサンプルが乱れていないことを確認します。光を避けてください。
18. アンチフェード取り付け媒体(材料のテーブル)の100 μLを使用して慎重にカバースリップドライスライド。取り付けステップの間にスライドの気泡の形成を避ける。スライドを平らに保管し、取り付け媒体を室温で一晩乾かします。取り付け媒体が乾燥した後、4°Cの防水容器に平らにスライドを保管し、表示する準備が整うまで保管してください。
    注:取り付け後に許容できないレベルの気泡が存在する場合、取り付けられたスライドは1x PBSに穏やかに置くことができ、カバースリップを取り外し、スライドが再び水ですすいで再乾燥したら、再取り付けすることができる。

4. 顕微鏡検査と画像解析

注:蛍光破壊顕微鏡と関連ソフトウェアを用いた画像解析では、3つの蛍光フィルタ(Alexa Fluor 488、568、および647 nm信号を可視化する)を備え、さらにDAPI(419nm)を使用します。

1. スライドを 10 倍の倍率でイメージして、ブラセマ領域全体をキャプチャします。
   注:増殖骨芽細胞一次抗体検出は、二次抗体(Alexa Fluor 488および647)を非重なり的な発光スペクトルで利用し、共標識細胞の誤った同定を最小限に抑えます。自己蛍光信号のバックグラウンド減算は、488または647信号の完全性を確保するために568 nmフィルタを使用して行うことができます。Blastema一次抗体検出は二次抗体(Alexa Fluor 488または568)を利用する。自己蛍光シグナルのバックグラウンド減算は、488結合抗体を用いた場合に568フィルタを用いて行うことができ、488フィルタは568結合抗体を用いている。自己蛍光信号は、典型的には、数字全体の爪板および赤血球に関連し、488、568、および647フィルタで観察される。

5. ビボマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)におけるシーケンシャル

1. 切断の1日前にスキャンした同じ動物の再生成(未切断)、1 DPA、およびvivaCT 40(材料表)を用いて28 DPAで完全再生するまでの様々な時点で、この実験で示す図 3A.
2. μCT動物室に出入りする酸素の流れを可能にするチューブでμCTを装着し、流出する酸素にイソファルランを捕捉する活性炭フィルターが装備されていることを確認します。
   注:μCT動物室がしっかりと囲まれていることを確認してください。このようにして、動物の鼻コーンは、スキャン中にマウスにイソファランを供給するために必要とされない。
3. μCT スキャン パラメータを準備します。桁数は、連続回転を使用して 180° あたり 1000 投影で 105 kVp、145 uA のボクセル サイズでスキャンされ、積分時間は 200 ミリ秒で、スキャンあたり最大 213 スライスになります。この実験で行われたスキャンは約9分の長さです。減少した電流は、比例して増加した積分時間で補正できますが、スキャン時間が長くなります。
4. イソファランを使用して成人マウスを麻酔する;最初はチャンバー内で3%で麻酔を行い、続いてスキャン期間中にμCT動物室に供給される1.5%のイソファランが続く。後肢の数字を近い関連付け、平らな、腹部のサイドアップで、スキャンプラットフォームの右側に左足を配置し、その後、外科的に使用して適切な場所に数字を静かに固定して、μCT動物室にマウスを静かに置きます。テープ。麻酔下での乾燥を防ぐために、眼科の目に眼のチントを適用します。
5. マウスをきれいなケージに戻し、目が覚めるまでマウスを監視します。同じマウスを隔週から毎週の時点でスキャンし続け、骨の再生応答全体を視覚化します。
6. スキャン後、μCT画像の再構成が発生するまで最大数時間を許容します。μCTに付属のソフトウェアを使用して、ファイルを一連のディコムファイルに変換します。各ディコムファイルはスキャンの1つのスライスに対応するため、213枚のスライスがスキャンされた場合、213個のdicomファイルが生成され、会社のサーバーにアップロードされます。
7. Web ブラウザでバッチ ファイル ダウンローダを使用して、単一のフォルダーに dicom シリーズをダウンロードします。
8. BoneJ^{プラグイン23}をダウンロードし、ImageJプラグインフォルダにファイルをドラッグします。ImageJ で、フォルダを ImageJ バーにドラッグ アンド ドロップして、ディコム ファイル シリーズをスタックとして開きます。すべての灰色の値を表示する 16 ビット イメージ スタックが開きます。ボーンのみを表示するには、イメージしきい値を実行します (Image > 調整 > しきい値)。
   注:ImageJ ファイルを表示する場合、ImageJ 出力は数字の反転イメージに対応します。すなわち、スキャンプラットフォームの腹部側に配置された数字は、プラットフォームの左側に左足、プラットフォームの右側に右足で、ImageJイメージスタックの右側に背側のサイドアップ、左側の右足、左足として表示されます。
9. しきい値ダイアログ ボックスを開いたら、上限に対応する下のバーを右端にスライドさせ、下限に対応する上部バーを調整します。下限しきい値は、最大信号強度 32,767 で約 10,000 ~ 13,000 になります。[適用]をクリックし、新しいダイアログ ボックスで[黒の背景]をクリックします。[OK]をクリックします。
10. 白黒の値を表示する 8 ビット画像が生成され、ボーンに対応する白色が表示されます。P3 ボーンの周囲に長方形を描画して選択し、スタックを複製します。3D 画像 (プラグイン> 3D ビューア)を生成します。画像から不要なボーンをトリミングするには、フリーハンド選択ツールをクリックし、削除するボーンを丸で囲みます。右クリックし、[塗りつぶし選択]を選択してボーンを削除します。
    注:上記の手順は ImageJ 1.52h、Java 8 に適用され、別のバージョンの ImageJ を使用する場合は若干異なる場合があります。しきい値の場合は、最適な値を決定し、その値を一貫して使用することをお勧めします。
11. BoneJ ボリューム分数プラグイン (プラグイン > BoneJ >ボリューム分数)を使用して、3D レンダリングからボーン ボリュームを定量します。結果ウィンドウが表示され、骨ボリューム(BV)がmm³で表示されます。
12. ImageJ マルチポイント ツールを使用して、3D レンダリングからボーンの長さを定量化します。
    注:骨の長さはP3再生の過程で動的である;長さは、破骨を媒介する骨^分解11に関連する7〜10 DPAの間で減少し、その後、14〜28 DPA(図3B)の間の遠位骨再成長の期間が続く。長さは、P2/P3関節の中心基部から遠位骨頂点での鉱物化の最も遠い点まで測定されるが、完全に剥離された分解された骨は含まれていない(図3B)。BoneJは骨の建築の完全な3D査定を可能にする;したがって、ボーンをスキャンする角度は、長さを測定する能力を変更しません。
13. [ビュー]をクリックして 3D レンダリングのイメージをキャプチャし、スナップショットを作成します。画像を tif ファイルまたは jpeg ファイルとして保存します。

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結果

6/7 DPA(図2A-D)、9DPA(図2E-H)、および10 DPA(図2I-L)でP3桁を再生する成体マウスは、Runx2、OSX、およびPCNAに対する抗体を用いて免疫染色し、骨内骨を可視化した。再生し、CXCR4およびvWFに対する抗体で免疫染色し、ブラステマ形成を可視化する。切断前および再生過程における様々な時点でスキ?...

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ディスカッション

このプロトコルは、成体マウス遠位P3切断の標準化された手順、蛍光免疫組織化学染色を視覚化し、ブラステマ形成および内膜神経化を調査し、シーケンシャルインビボμCTスキャンを記述する。切断後の骨形態、体積、および長さの変化を識別する。P3切断は、ブラセマ形成を引き起こす再生創傷環境を分析するユニークで手続き的にシンプルで再現可能なモデルです。さらに、P3の数字モデ...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein Block Serum Free	DAKO	X0909	Ready to use
Mouse anti-PCNA antibody	Abcam	ab29	1:2000 dilution
Rat anti-CXCR4 antibody	R&D Systems	MAB21651	1:500 dilution
Rabbit anti-human vWF XIII antibody	DAKO	A0082	1:800 dilution
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody	Abcam	ab22552	1:400 dilution
Rabbit anti-Runx2 antibody	Sigma-Aldrich Co.	HPA022040	1:250 dilution
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A21235	1:500 dilution
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11008	1:500 dilution
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Invitrogen	A11077	1:500 dilution
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930	Ready to use
Surgipath Decalicifier 1	Leica Biosystems	3800400	Ready to use
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative	Anatech LTD	174	Ready to use
CD-1 Female Mouse	Envigo	ICR(CD-1)	8-12-weeks-old
vivaCT 40	SCANCO Medical