通过电生理场记录研究跨体海马CA1的长期突触可塑性

摘要

我们在纵向海马脑切片中使用记录和刺激电极,并在体内背海马区中纵向定位记录和刺激电极,以唤起细胞外的显微电位并演示沿纵向间层 CA1 的长期突触可塑性。

摘要

海马突触可塑性的研究主要集中在CA3-CA1层状网络的使用上。对纵向间层CA1-CA1网络的关注较少。然而,最近,CA1-CA1金字塔神经元之间的关联连接被显示出来。因此,有必要研究海马的纵向间层CA1-CA1网络是否支持突触可塑性。

我们设计了一个协议,利用体内和体外电生理场记录,研究海马间CA1网络中是否存在长期突触可塑性。对于体内细胞外场记录,记录和刺激电极被放置在背海马的隔音-时间轴以纵向的角度,以唤起场内兴奋的后分感电位。对于体外细胞外场记录,海马纵向切片被切割平行于隔膜-时间平面。记录和刺激电极被放置在沿纵轴的海马层或地层(S.R)和地层辐射(S.R) 中。这使我们能够研究诱发兴奋性脱发潜能的方向和层特异性。已经建立的协议用于诱导体内和体外的长期强效(LTP)和长期抑郁症(LTD)。我们的结果表明,纵向间层CA1网络支持N-甲基-D-阿斯巴酸酯(NMDA)受体依赖性长期强效(LTP),没有方向或层特异性。然而,与横向层状层网络相比,间层网络没有出现任何显著的长期抑郁症(LTD)。

引言

海马在认知研究1,2,3中被广泛应用。横轴中的海马层状网络形成由倒角陀螺、CA3 和 CA1 区域组成的三突触电路。层网络被认为是一个平行和独立的单元4,5。这种层状的观点影响了海马体体内和体外电生理学研究的横向方向和横片的使用。根据新兴的研究,正在重新评估层状假说,并关注海马的间层网络。关于海马间海马网络,CA3区域早已被调查7,8,9,10,但纵向CA1海马区域已收到直到最近,人们很少关注。关于CA1间间层网络,大鼠的多索文拉纵向海马CA1轴线的短期突触特性已被证明^变化11。此外,发现对相和地点作出反应的海马细胞簇被系统地排列在大鼠的海马的纵轴上,完成短期记忆^任务12。此外,癫痫发作活动被发现沿整个海马沿着纵^轴13同步。

然而,大多数对纵向CA1海马区域的研究,都利用了从CA3到CA1区域11、14、15的输入。使用独特的协议来制作纵向脑切片,我们以前的工作证明了CA1金字塔神经元沿纵轴的关联连通性,并牵连到其有效处理神经元信号^{的能力16。}然而,需要确定没有横向输入的沿纵轴的CA1金字塔神经元是否能支持长期突触可塑性。这一发现可以为调查与海马有关的神经问题增加另一个角度。

神经元适应信息传递功效的能力称为突触可塑性。突触可塑性被牵连为认知过程的基础机制,如学习和记忆17,18,19,20。长期突触可塑性表现为长期强效(LTP),代表神经元反应的增强,或长期抑郁(LTD),代表神经元反应的减弱。在海马的横轴上研究了长期突触可塑性。然而,这是第一次研究证明CA1金字塔神经元的海马纵向轴的长期突触可塑性。

根据杨^等人16日使用的一个协议,我们设计了该协议,以在CA1金字塔神经元的海马纵轴中演示LTP和LTD。我们使用年龄介于5-9周之间的C57BL6雄性小鼠进行体外实验,使用6-12周大的雄性小鼠进行体内实验。本详细文章展示了如何从小鼠获得纵向海马脑切片进行体外记录,以及如何在纵轴中记录体内记录。对于体外记录,我们研究了纵向CA1突触可塑性的方向特异性,通过瞄准海马的隔膜和时间端。我们还通过记录海马的地层或层和地层辐射,研究了纵向CA1突触可塑性的层特异性。对于体内记录,我们研究了与海马的纵向方向最对应的角度。

使用体内和体外细胞外场外记录,我们观察到纵向连接的CA1金字塔神经元呈现LTP,而不是LTD。然而,涉及CA3和CA1神经元的横向方向同时支持LTP和LTD。海马的横向和纵向之间的突触能力区别可能推测表明其功能连通性的差异。需要进一步的实验来破译其突触能力的差异。

研究方案

所有动物都按照国家卫生研究院动物护理和使用实验室的准则和条例进行治疗。所有方法均获香港城市大学和仁川国立大学动物护理及使用委员会(IACUC)批准。

1. 体内现场记录

1. 动物制剂
   1. 在腹内注射聚氨酯(每25克重量0.06克)给麻醉小鼠。补充肌内注射阿托品(0.05毫克/千克)。保持鼠标在一个黑暗的安静点,直到完全麻醉生效。
      注意:聚氨酯具有致癌潜力。小心处理,并穿防护服,避免接触暴露的皮肤。
      注:另外,子胶可用作麻醉。
   2. 检查麻醉的深度间歇性,直到麻醉的完全手术平面生效。通过执行脚趾捏、耳捏、尾部捏合和角膜触摸测试,检查麻醉深度,以观察小鼠对身体刺激的反应。
      注:当小鼠处于麻醉的完全手术平面时,不应观察到反射或自愿运动。
   3. 对于脚趾捏测试,伸展鼠标的后腿或前腿,用一对钝钳或手指用力紧紧捏紧。如果小鼠退出腿部或摇动身体、呼吸速率可观察到的增率或发出声音,则不确认为完全麻醉。
   4. 对于耳部捏合测试,用一对钝钳或手指用力夹紧夹钳的末端。如果小鼠向前移动胡须、摇头、发出声音或呼吸速率明显增加,则无法确认完全麻醉。
   5. 对于尾部捏合测试,轻轻握住鼠标的尾部,用钝力或手指用力牢牢捏住。在完全麻醉外科手术时,不应观察到尾部运动、声响或观察到呼吸速率增加。
   6. 对于角膜触摸测试,用棉芯轻轻触摸鼠标的角膜。当完全麻醉用于手术时,不应观察到眼睑运动、胡须运动或呼吸速率的可观察到的增加。
   7. 把头发在老鼠的脖子和头骨上。
   8. 将完全麻醉的鼠标放在设置为 37°C 的加热垫上,并将直肠温度探头插入直肠。这使得加热垫产生的热量能够根据小鼠体温的变化进行调整。
   9. 涂抹眼凝胶润湿小鼠的眼睛。
   10. 用钳子轻轻地将舌头拉到嘴唇的一侧,并将两颗前牙固定到立体定向仪器的第二或第三个齿孔中。用眼夹牢固地固定鼠标的头骨。
       注:或者,也可以使用立体定向耳钳。
   11. 在显微镜下观察,用手术刀将小鼠的间间骨和胸骨末端的皮下组织和肌肉分开,以暴露囊根状。用棉签擦干杜拉母体。
   12. 用锋利的锋利的手术刀轻轻刺穿水塞,以排出脑脊液(CSF)。安装棉签,继续排干 CSF。
2. 开颅 术
   1. 用钳子将皮肤放在头皮上,用一把手术剪刀切割和取出皮肤。切割足够的皮肤,以暴露头皮上的胸膜和羔羊纹。保持暴露区域干燥。
   2. 调整鼠标的夹紧头骨,使胸膜和 lambda 点在类似高度的水平水平上对齐。避免头部在前后位置或中侧位置倾斜。
   3. 使用 Vernier 卡钳的辅助标记与海马区域对应的点。使用立体定向坐标簿中的鼠标大脑作为参考,以帮助确定确切的坐标。
      注: 标明海马切口的位置为 1 mm x 3 mm,在中线称为前后体 (AP)上,使用 bregma 作为参考点,3 mm x 3 mm 垂直于中线 (ML) 以连接中线上的点。立体定向坐标为(AP:1,3 和 ML:3,3)。
   4. 在显微镜下观察时,使用手术刀或高速钻头沿标记点沿海马的背区域在头骨上方进行切口。
      注:切口后应获得尺寸为 2 mm x 3 mm 的矩形开口。保持暴露区域清洁,避免对大脑造成伤害。
   5. 小心地拿出松散的头骨与钳子暴露杜拉母体,并使用注射器或滴管轻轻地应用生理盐水溶液,以保持表面湿润。
   6. 用针或锋利的尖钳小心地拆下杜拉母体。
      注意:注意不要在颅内切除术期间对脑组织造成任何损害。这将导致大脑肿胀,并影响结果。
   7. 使用滴管或注射器涂抹生理盐水或惰性油,保持暴露的脑组织湿润。
3. 体内录音
   1. 将刺激和记录电极牢固地固定在立体定向支架中。根据CA1背海马上方的刺激和记录电极的相应AP和ML坐标位置调整立体定向仪器。
      注:使用立体定向坐标中的小鼠大脑作为定位背纵向CA1海马区域坐标的指南。例如,CA1 海马区域的立体定向坐标将为记录电极(AP 1.5,ML 1.0),刺激电极的立体声定向坐标为(AP 1.7,ML 1.5)。
   2. 沿纵向定位刺激电极横向到记录电极。
      注:在使用前,确保刺激电极和记录电极清洁。这样可以防止在录制时引入噪音。
   3. 对于录像,请使用多通道电极。首先,使用第一个通道定位CA1海马区域的立体定向坐标。将剩余的电极放置,使刺激和记录电极的角度相对于从布雷格马点的中线在 30° 到 60° 的范围内。
      注:此角度对应于 CA1 海马区域的纵向。
   4. 作为控制,将记录电极定位在 CA1 区域上方,将刺激电极定位在背海马的 CA3 区域上方。例如,在立体定向坐标中使用小鼠大脑作为参考,CA1-CA3 海马区域的立体定向坐标将为记录电极(AP 1.8,ML 1.0)和刺激电极(AP 1.5,ML 1.5)。
      注: 此步骤是替代控件,应在单独的实验中完成。
   5. 将参考电极放在暴露的大脑区域的远端部分或小鼠皮肤下。
   6. 打开录制系统。
   7. 打开用于记录和数据采集的软件。
      注:不同的实验室有他们的首选软件来记录和数据采集。
   8. 在显微镜下观察,使用微操作器缓慢降低记录和刺激电极,直到它触及大脑表面。将点标记为零点,开始计算海马区域的精确深度。
      注: 微操作器可用于监控电极在任何给定时间插入的深度。当电极接触大脑表面时,观察阻抗的增加。
   9. 缓慢地将电极降低到与 CA1 海马所选择的立体定向坐标对应的近似深度。
      注:使用鼠标大脑中的立体定向坐标作为参考,以获得与所选立体定向坐标对应的近似深度。
   10. 给予刺激(100 μs持续时间,以30秒的间隔重复),并调整电极深度,步数为50μm或更少,直到观察到稳定的引起场兴奋性分片电位(fEPSP)。
       注:20 μA的刺激通常足以引起可观察的反应。
   11. 确保通过改变刺激强度来唤起稳定的 fEPSP。应随着每次增加的刺激强度,观察到 fEPSP 的斜率或振幅显著增加。这称为输入-输出曲线。创建输入输出 (I-O) 曲线,以检测在所唤起的 fEPSP 的斜率不再增加的最大刺激强度(图6)。
       注:如果光纤在实验过程中消失,请丢弃数据并更改电极位置。
   12. 使用输入-输出曲线将基线强度设置为最大值的 40 - 50%。使用相应的刺激强度进行基线记录。
   13. 将本地字段潜力记录为 20 - 30 分钟的基线。
   14. 使用相同的输入输出曲线将激发高频刺激 (HFS) 或破伤风的刺激强度设置为最大强度的 75%。或者,当诱发长期抑郁时,在引发低频刺激(LFS)时,保持用于记录基线的相同刺激强度。
   15. 在10秒的间隔内4次使用100 Hz脉冲的破伤风刺激诱导LTP。
       注:仅在进行长期电位化实验时使用此协议。
   16. 应用低频刺激 5 Hz(3 分钟内 900 刺激)、1 Hz LFS(15 分钟内 900 次刺激)或 1 Hz 配对脉冲(50 ms 配对脉冲间隔,15 分钟内 900 对刺激),根据已建立的协议诱导 LTD。
       注意:仅在进行长期抑郁症实验时使用这些协议。
   17. 在 HFS 或 LFS 之后记录本地场电位 1 小时。
   18. 使用软件导出数据并进行分析。
   19. 通过刺激10μA电流30s对记录区域进行病变,验证记录和刺激电极的位置。跨心注入小鼠4%的甲醛和收获的大脑切片和染色与克雷西尔紫罗兰根据。
   20. 实验后通过宫颈脱位或注射致命麻醉剂对小鼠实施安乐死。

2. 体外现场记录

1. 制备含氧切片和人工脑脊液 (ACSF) 解决方案
   1. 对于 2 L 切片溶液,在体积烧瓶中加入约 1 L 的双蒸馏水,并在搅拌板上大力搅拌。
   2. 添加以下切片溶液组件(以 mM 表示):87.0 NaCl、2.5 KCl、1.3 NaH₂PO₄、25.0 NaHCO₃、25.0 葡萄糖、75.0 蔗糖、7.0 MgCl₂.6H₂O 和 0.5 CaCl₂+2H₂O (表 1)。
      注: 或者,MgCl₂+6H₂O 和 CaCl₂+2H₂O 可以在此阶段排除,并在稍后添加在准备使用卷中。
   3. 用双蒸馏水顶至2 L,同时大力搅拌。
   4. 对于 2 L 的 ACSF,在体积烧瓶中加入约 1 L 的双蒸馏水,并在搅拌板上大力搅拌。
   5. 添加以下 ACSF 溶液组件(以 mM 表示):125.0 纳Cl、2.5 KCl、1.3 NaH₂PO₄、25.0 NaHCO₃、25 葡萄糖、1.0 MgCl₂+6H₂O 和 2.0 CaCl₂+2H₂O (表 1)。
      注: 或者,MgCl₂.6H₂O 和 CaCl₂+2H₂O 可以在此阶段排除,并在稍后添加在准备使用卷中。
   6. 用双蒸馏水顶至2 L,同时大力搅拌。
2. 设置和大脑切片
   1. 将400 mL的已制备切片溶液倒入单独的烧瓶和氧合(95% O₂/5%CO 2)约 20 分钟。
   2. 将其余 1.6 L 溶液存放在 4°C 冰箱中。保持溶液长达1周,之后必须丢弃,如果不用于避免真菌生长。
   3. 将200 mL的含氧切片溶液倒入烧瓶中,用底片盖住,并转移到-80°C冷冻室约20分钟,以进行泥浆。
   4. 将剩余的200 mL切片溶液倒入脑切片保持室中,并保存在32°C水浴中,并连续冒泡。
   5. 准备切片的长凳。将纸巾放下,手术工具放在长凳上。按照使用顺序排列手术工具,以促进快速高效的手术过程(图7)。
   6. 从冰柜中取出冷冻切片溶液,在烧杯中倒入约 50 mL。倒入含有滤纸的培养皿中约 10 mL 以滋润。把它们放在冰上解剖区域。
   7. 将其余的粉碎切片溶液倒入切片室,并将其固定在振动体上。
   8. 利用国家卫生研究院动物护理及实验室使用指南和条例,以及香港城市大学和仁川国家研究所机构动物使用与护理委员会批准的方法,用异黄体麻醉小鼠大学。
   9. 用剪刀将麻醉小鼠斩首,并将头放在纸巾上。切下覆盖老鼠头骨的皮肤,用剪刀切开皮肤肌肉。用手术剪刀将颅板沿着中线切到骨骼。
   10. 用钝钳打开头骨,露出大脑。用铲子轻轻挖出大脑,放入烧杯中的冷冻切片溶液中。等大约30s。
   11. 用勺子拿出大脑,小心地将其放在培养皿中先前湿润的滤纸上。
   12. 用手术刀将两个大脑半球沿着中线分开。用铲子轻轻地将其从皮层分离,并小心地放在湿润的滤纸上,从而分离出海马。使用手术刀切掉孤立的海马的隔膜和时间末端。
   13. 用钝的铲子和刷子捡起孤立的海马。轻轻涂抹在纸巾上的铲子,以去除多余的水。
   14. 在振动体的切片板上涂抹少量胶水。
   15. 对于纵向 CA1 海马切片,用胶水将海马的 CA3 区域连接到切片板上。快速而小心地将其放入含有冷冻含氧切片溶液的振动体切片室中。
   16. 对于将用作控制的横向切片,将海马的腹端连接到振动体的切片板。快速而小心地将其放入含有冷冻含氧解剖溶液的切片室中。
       注: 此步骤是上述步骤的替代方法,应单独执行。
   17. 将刀片角度定位为 90°。将振动参数设置为 0.05 mm/s、振幅 1.20 mm 和切片厚度 400 μm。
   18. 用颤音片片附的海马。
       注:良好的纵向CA1海马脑切片将有一层CA1和2层登树陀螺。最多可以获得 2 块好的海马切片。或者,横向海马脑切片将保持不变的倒肠陀螺、CA3 和 CA1 区域。
   19. 用移液器将纵向海马脑切片从振动管中移移,并在水浴室的脑切片保持室中孵育。
   20. 在水浴中孵育切片20分钟,温度为32°C,并带出室温30分钟的恢复。
       注 : 或者 , 当离开水浴时转移脑切片 , 并将其轻轻放入记录室 , 在32°C温度动含氧 ACSF , 恢复 30 分钟。
   21. 在水浴中孵育时,将400 mL的ACSF溶液倒入单独的烧瓶和氧合(95%O₂/5%CO 2)中,约20-30分钟,然后将脑切片转移到记录室。以 2 mL/min 的速度连续将 ACSF 超级注入记录室。
   22. 打开温度控制器,将流动的 ACSF 加热到 32°C。
   23. 将其余 1.6 L 溶液存放在 4°C 冰箱中。保持溶液长达一个星期后,它必须丢弃,如果不用于避免真菌生长。
3. 体外记录
   1. 通过打开所有需要的硬件来设置录制设备。
   2. 将脑切片从切片保持室转移到记录室。用钝钳调整大脑切片的位置,用竖琴将其保持到位。允许 ACSF 运行至少 20 分钟。这使得大脑切片在记录前保持稳定。
   3. 将记录移液器作为内部解决方案填充。
   4. 使用指定的软件检查记录移液器电阻。记录移液器电阻应在 3-5 MΩ 范围内。
   5. 打开用于数据采集的软件。该软件应具有类似的功能,使数据采集的方式与前面显示的体内记录类似。
   6. 将录音和刺激电极牢固地固定在立体定向仪器支架中。将参考电极放在记录室的 ACSF 中。
   7. 对于纵向切片,将刺激和记录电极放置在地层或层(S.O.)中。将电极之间的距离保持在约300至500μm。将刺激电极放在脑切片的隔膜或时间侧,并从同一层进行记录(图8)。
   8. 或者,将刺激和记录电极放置在地层辐射层(S.R.)。将刺激电极放在脑切片的隔膜或时间侧。
   9. 对于横向切片作为对照,将刺激电极放置在 CA3(舍弗辅助通路)区域,将记录电极置于 CA1 区域(图 9)。
      注: 这是一个替代控制步骤,应在单独的实验中执行。
   10. 打开孤立的刺激发生器并给予刺激(100 μs 持续时间,以 30 秒的间隔重复)。调整记录电极深度和/或位置,直到观察到稳定的兴奋性射贴后场电位。
   11. 确保通过改变刺激强度来唤起稳定的 fEPSP。每次刺激强度的变化都应观察到 fEPSP 斜率的显著变化。这称为输入-输出曲线。创建输入输出 (I-O) 曲线,以检测 FEPSP 斜率不再增加的最大刺激强度(图 6)。
       注:如果光纤在实验过程中消失,请丢弃数据并更改电极位置。
   12. 使用输入-输出曲线将刺激强度设置为基线记录和激发高频刺激 (HFS) 或破伤风到最大调用 fEPSP 的 30-40%。
   13. 或者,对于有关 LTD 的实验,使用输入-输出曲线设置基线记录的基线强度,并将低频刺激 (LFS) 激发到最大调用 fEPSP 的 70%。
   14. 将本地字段潜力记录为 20 - 30 分钟的基线。
   15. 在 30 秒的间隔内两次应用 100 Hz 脉冲的 HFS 以诱导 LTP。
   16. 或者,对于 LTD 实验,应用 5 Hz(3 分钟时 900 次刺激)或 1 Hz LFS(15 分钟内 900 次刺激)或 1 Hz 配对脉冲(50 ms 配对脉冲间隔,15 分钟内 900 对刺激)的低频刺激,根据已成的已建立的协议。
   17. 在 HFS 或 LFS 之后记录本地场电位 1 小时。
   18. 导出数据并进行分析。

结果

我们利用体内和体外细胞外场记录,探索了海马纵向CA1金字塔神经元的长期突触可塑性。LTP 和 LTD 是长期突触可塑性的方面,在海马的横轴中已被证明是单向的。

我们在这里表明,使用纵向海马脑切片,在海马的CA1纵轴中有LTP。我们沿着垂直于横切切片的乘法轴制备了海马的纵向切片(图1)。使用来自海马的CA1区域的录音,我们显示了LTP的存在,这是不特定方向?...

讨论

该方案演示了在体外海马的纵向CA1-CA1轴中诱导体内和脑切片的长期突触可塑性的方法。概述的步骤为实验者提供了足够的细节,以便他们研究纵向海马CA1-CA1连接中的LTP和LTD。需要练习来磨练成功记录现场兴奋潜力所需的技能。

除了需要练习外,还有几个关键步骤对于取得良好结果至关重要。首先,它之前显示,大脑切片的角度可以截截或保留金字塔神经元的纵向投影在CA1-CA1区域?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atropine Sulphate salt monohydrate, ≥97% (TLC), crystalline	Sigma-Aldrich	5908-99-6	Stored in Dessicator
Axon Digidata 1550B
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10035-04-8
Clampex 10.7
D-(+)-Glucose ≥ 99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	50-99-7
Eyegel	Dechra
Isoflurane	RWD Life Sciences	R510-22
Magnesium chloride hexahydrate, BioXtra, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	7791-18-6
Matrix electrodes, Tungsten	FHC	18305
Multiclamp 700B Amplifier
Potassium chloride, BioXtra, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Potassium phosphate monobasic anhydrous ≥99%	Sigma-Aldrich	7778-77-0	Stored in Dessicator
Pump	Longer precision pump Co., Ltd	T-S113&JY10-14
Silicone oil	Sigma-Aldrich	63148-62-9
Sodium Bicarbonate, BioXtra, 99.5-100.5%	Sigma-Aldrich	144-55-8
Sodium Chloride, BioXtra, ≥99.5% (AT)	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Sodium phosphate monobasic, powder	Sigma-Aldrich	7558-80-7
Sucrose, ≥ 99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	57-50-1
Temperature controller	Warner Instruments	TC-324C
Tungsten microelectrodes	FHC	20843
Urethane, ≥99%	Sigma-Aldrich	51-79-6
Vibratome	Leica	VT-1200S
Water bath	Grant Instruments	SAP12