Elektrofizyolojik Alan Kaydı ile Interlamellar Hipokampus CA1'de Uzun Süreli Sinaptik Plastisitenin Araştırılması

Özet

Biz postitudinal hipokampal beyin dilimleri ve uzunlamasına konumlandırılmış kayıt ve stimülasyon elektrotlar in vivo hücre dışı postinaptik potansiyelleri uyandırmak ve göstermek için kullanılan kayıt ve stimülasyon elektrotlar uzunlamasına interlamellar CA1 boyunca uzun vadeli sinaptik plastisite.

Özet

Hipokampus sinaptik plastisite çalışma CA3-CA1 lamellar ağ kullanımı üzerinde duruldu. Uzunlamasına interlamellar CA1-CA1 ağına daha az dikkat edilmiştir. Ancak son zamanlarda CA1-CA1 piramidal nöronlar arasında ilişkisel bir bağlantı gösterilmiştir. Bu nedenle hipokampusuzundaki interlamellar CA1-CA1 ağının sinaptik plastisiteyi destekleyip desteklemediğini araştırmak gerekir.

İnlamellar hipokampal CA1 ağında ki uzun süreli sinaptik plastisitenin varlığını veya yokluğunu hem in vivo hem de in vitro elektrofizyolojik alan kayıtlarını kullanarak araştırmak için bir protokol tasarladık. In vivo ekstrasellüler alan kayıtları için, kayıt ve stimülasyon elektrotları uzunlamasına açıyla dorsal hipokampusun septal-temporal eksenine yerleştirildi, alan uyarıcı postsinaptik potansiyelleri uyandırmak için. İn vitro ekstrasellüler alan kayıtları için hipokampal boylamsal dilimler septal-temporal düzleme paralel olarak kesildi. Kayıt ve stimülasyon elektrotları uzunlamasına eksen boyunca hipokampus un stratum oriens (S.O) ve stratum radiatum (S.R) yerleştirildi. Bu bize uyarılmış uyarıcı postsinaptik potansiyellerin yön ve katman özgüllüğünü araştırmak için etkin. Zaten kurulan protokoller uzun vadeli potentiation (LTP) ve uzun vadeli depresyon (LTD) hem in vivo ve in vitro neden kullanılmıştır. Sonuçlarımız, uzunlamasına interlamellar CA1 ağının yön veya tabaka özgüllüğü olmayan N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptöre bağımlı uzun vadeli potansiyasyonu (LTP) desteklediğini göstermiştir. Interlamellar ağ, ancak, enine lamellar ağ aksine, herhangi bir önemli uzun vadeli depresyon (LTD) ile mevcut değildi.

Giriş

Hipokampus yaygın bilişsel çalışmalarda kullanılmıştır^1,2,3. Enine eksendeki hipokampal lamellar ağı, dentat girus, CA3 ve CA1 bölgelerinden oluşan tri-sinaptik devreyi oluşturur. Lamellar ağ paralel ve bağımsız birim⁴,⁵olarak kabul edilir. Bu lamellar bakış açısı hipokampusun hem in vivo hem de in vitro elektrofizyolojik çalışmaları için enine oryantasyon ve enine dilimlerin kullanımını etkilemiştir. Ortaya çıkan araştırmalar ışığında lamellar hipotezi⁶ yeniden değerlendirilmekte ve hipokampusun interlamellar ağına da önem verilmektedir. Hipokampal interlamellar ağ ile ilgili olarak, CA3 bölge uzun araştırılmıştır^7,8,9,10, ancak uzunlamasına CA1 hipokampal bölge aldı yakın zamana kadar nispeten az dikkat. CA1 interlamellar ağı ile ilgili olarak, sıçanların dorsoventral longitudinal hipokampal CA1 ekseni boyunca kısa vadeli sinaptik özellikleri¹¹değişir gösterilmiştir . Ayrıca, hipokampal hücre kümeleri faz ve yer yanıt sıçanlarda hipokampus uzunlamasına eksen boyunca sistematik olarak düzenlenmiş olduğu tespit edilmiştir, kısa süreli bellek görevi geçiyor¹². Ayrıca, epileptik nöbet aktiviteleri uzunlamasına eksen boyunca tüm hipokampus boyunca senkronize olduğu bulunmuştur¹³.

Ancak uzunlamasına CA1 hipokampal bölgenin çoğu çalışmalar, CA3 CA1 bölgeleri 11,^14,15giriş kullandık. Uzunlamasına beyin dilimleri yapmak için benzersiz bir protokol kullanarak, önceki çalışmamız uzunlamasına eksen boyunca CA1 piramidal nöronların derneksel bağlantı gösterdi ve etkili nöronal sinyal işleme yeteneğini dahil¹⁶. Ancak, enine giriş olmadan uzunlamasına eksen boyunca CA1 piramidal nöronların uzun vadeli sinaptik plastisiteyi destekleyip destekleyemeyeceğini belirlemek gerekir. Bu bulgu hipokampus ile ilgili nörolojik sorunların araştırılmasına başka bir açı ekleyebilir.

Nöronların bilgi aktarımının etkinliğini adapte etme yeteneği sinaptik plastisite olarak bilinir. Sinaptik plastisite öğrenme ve bellek gibi bilişsel süreçler için altta yatan mekanizma olarak ima edilir^17,18,19,20. Uzun süreli sinaptik plastisite ya uzun vadeli potentiation olarak gösterilmiştir (LTP), hangi nöronal yanıt Güçlendirilmesi temsil eder, ya da uzun süreli depresyon (LTD), hangi nöronal yanıtın zayıflamasını temsil eder. Hipokampusun enine ekseninde uzun süreli sinaptik plastisite incelenmiştir. Ancak, Bu CA1 piramidal nöronların hipokampal uzunlamasına ekseninde uzun vadeli sinaptik plastisite göstermek için ilk çalışmadır.

Yang ve ark.¹⁶tarafından kullanılan bir protokolden bina, biz CA1 piramidal nöronların hipokampal uzunlamasına ekseninde LTP ve LTD göstermek için protokol tasarlanmıştır. Biz in vitro deneyler için 5-9 hafta eski ve 6-12 hafta in vivo deneyler için eski yaşları arasında değişen C57BL6 erkek fareler kullanılır. Bu ayrıntılı makale, farelerden gelen uzunlamasına hipokampal beyin dilimlerinin in vitro kayıtlar için nasıl elde edildiğini ve in vivo kayıtların boylamsal eksende nasıl kaydedildiğini göstermektedir. İn vitro kayıtlar için hipokampusun septal ve temporal ucunu hedef alarak uzunlamasına CA1 sinaptik plastisitenin yönlü özgüllüğünü araştırdık. Ayrıca hipokampusun stratum oriens ve stratum radiatum'undan kayıt yaparak uzunlamasına CA1 sinaptik plastisitenin tabaka özgüllüğünü araştırdık. In vivo kayıtları için, hipokampusuzun uzunlamasına yönüne en iyi karşılık gelen açıları araştırdık.

Hem in vivo hem de in vitro hücre dışı alan kayıtlarını kullanarak, uzunlamasına bağlı CA1 piramidal nöronların LTD ile değil LTP ile sunulduğunu gözlemledik. Ancak hem CA3 hem de CA1 nöronlarını içeren enine oryantasyon hem LTP hem de LTD'yi destekler. Enine ve hipokampus uzunlamasına yönelim arasındaki sinaptik yetenekleri ayrım spekülatif fonksiyonel bağlantı farklılıkları anlamına gelebilir. Sinaptik yeteneklerindeki farklılıkları çözmek için başka deneylere ihtiyaç vardır.

Protokol

Tüm hayvanlar, Ulusal Sağlık Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Laboratuvarı'nın yönergeleri ve yönetmelikleri uyarınca tedavi edildi. Burada açıklanan tüm yöntemler, Hong Kong City Üniversitesi ve Incheon Ulusal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. In vivo alan kaydı

1. Hayvan hazırlığı
   1. Fareyi anesteziye intraperitoneal olarak üretan (25 g ağırlıkta 0,06 g) enjekte edin. Atropin intramüsküler enjeksiyon (0.05 mg /kg) ile ek. Tam anestezi yürürlüğe kadar karanlık sessiz bir noktada fare tutun.
      DİkKAT: Üretan kanserojen potansiyele sahiptir. Dikkatli bir şekilde takın ve açıkta kalan ciltle temasından kaçınmak için koruyucu giysiler giyin.
      NOT: Alternatif olarak, isoflurananestezi anestezi olarak kullanılabilir.
   2. Tam bir cerrahi anestezi düzlemi etkili olana kadar aralıklı olarak anestezi derinliğiolup deliyi kontrol edin. Fiziksel uyaranlara farenin tepkisini gözlemlemek için parmak tutam, kulak çimdik, kuyruk tutam ve kornea dokunma testleri gerçekleştirerek anestezi derinliği için kontrol edin.
      NOT: Fare tam cerrahi anestezi düzlemindeyken refleks veya gönüllü hareket gözlenmemelidir.
   3. Ayak ucutu testi için, farenin arka veya ön ayağını uzatın ve bir çift künt forseps veya parmakla sıkıca çimdikle kısın. Fare, bacağı geri çekerse veya vücudu sallarsa, solunum hızı artarsa veya ses çıkarırsa tam anestezi için onaylanmaz.
   4. Kulak çimdik testi için pinnanın uçlarını bir çift künt forseps veya parmakla sıkıca çimdikle. Fare bıyıkları ileri doğru hareket ettirirse, başını sallarsa, ses çıkarırsa veya gözlemlenebilir solunum hızına sahipse tam anestezi onaylanmaz.
   5. Kuyruk kıskaç testi için farenin kuyruğunu hafifçe tutun ve künt bir forcep veya parmakla sıkıca kıstın. Cerrahi işlemler için tamamen anestezi yapıldığında kuyruk hareketi, ses sesi veya solunum hızında gözlenmemelidir.
   6. Kornea dokunmatik testi için farenin korneasına pamuk fitili ile hafifçe dokunun. Ameliyat için tamamen anestezi yapıldığında göz kapağı hareketi, bıyık hareketi veya solunum hızında gözlenebilir artış gözlenmemelidir.
   7. Farenin boynundaki ve kafatasındaki saçı tıraş edin.
   8. Tamamen anestezili fareyi 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığına yerleştirin ve rektuma rektal sıcaklık probu yerleştirin. Bu, ısıtma yastığı tarafından üretilen ısının farenin vücut ısısındaki değişikliklere tepki olarak ayarlanmasını sağlar.
   9. Farenin gözlerini nemlendirmek için göz jeli uygulayın.
   10. Dili pİştiler kullanarak dudakların yan tarafına çekin ve iki ön dişi stereotaktik aletin ikinci veya üçüncü diş deliğine doğru düzeltin. Göz kıskacını kullanarak farenin kafatasını sıkıca düzeltin.
       NOT: Alternatif olarak stereotaktik kulak kelepçesi kullanılabilir.
   11. Bir mikroskop altında gözlemleyerek, sarnıç magna ortaya çıkarmak için bir neşter ile farenin interparietal ve oksipital kemik sonunda deri altı doku ve kasları ayırın. Bir pamuklu bez ile kuru dura mater leke.
   12. Yavaşça beyin omurilik sıvısı (BOS) drenaj için keskin sivri neşter bıçak ile sığ bir kesim yaparak sarnıç magna delin. BOS drenaj tutmak için bir pamuklu bez takın.
2. Kraniyotomi
   1. Forceps ile kafa derisi üzerinde cilt tutulması, kesilmiş ve cerrahi makas bir çift ile cilt çıkarın. Kafa derisi üzerinde bregma ve lambda işaretleri ortaya çıkarmak için yeterli deri kesin. Maruz kalan bölgeyi kuru tutun.
   2. Bregma ve lambda noktalarının benzer yükseklikte yatay bir düzeyde hizalanmasını sağlamak için farenin kenetlenmiş kafatasını ayarlayın. Başın ön-posterior pozisyonda veya medial lateral pozisyonda eğilmesini önleyebilirsiniz.
   3. Bir Vernier kaliper yardımı kullanarak hipokampal bölgeye karşılık gelen noktaları işaretleyin. Tam koordinatları belirlemeye yardımcı olmak için bir referans olarak stereotaktik koordinat kitabında fare beyin kullanın.
      NOT: Hipokampus için kesi için işaretlemek için işaretlemek için yer 1 mm x 3 mm ön-posterior olarak adlandırılan orta hat üzerinde (AP) referans noktası olarak bregma kullanarak, ve 3 mm x 3 mm orta hatta (ML) orta hat noktaları bağlamak için dik. Stereotaktik koordinatlar (AP: 1,3 ve ML: 3,3) olarak verilmiştir.
   4. Bir mikroskop altında gözlemlerken bir neşter veya yüksek hızlı matkap kullanarak işaretli noktaları boyunca hipokampus sırt bölgesi üzerinde kafatasında bir kesi olun.
      NOT: Kesiden sonra 2 mm x 3 mm büyüklüğünde dikdörtgen şeklinde bir açıklık elde edilmelidir. Beyin yaralanmasını önlemek için maruz kalan bölgeyi temiz tutun.
   5. Dura mater'i ortaya çıkarmak için gevşek kafatasını forsepslerle dikkatlice dışarı çekin ve yüzeyi nemli tutmak için fizyolojik tuzlu çözeltiyi nazikçe uygulamak için şırınga veya damlalık kullanın.
   6. Dura mater'i iğne veya sivri uçlu püf noktalarıyla dikkatlice çıkarın.
      NOT: Kraniyotomi sırasında beyin dokusunda herhangi bir hasara yol açmamaya dikkat edin. Bu beynin şişmesine yol açacak ve sonuçları etkileyecektir.
   7. Bir damlalık veya şırınga kullanarak fizyolojik salin veya inert yağ uygulayarak maruz beyin dokusu nemli tutun.
3. In vivo kayıt
   1. Uyarımı ve kayıt elektrodu stereotaktik tutucusunda sıkıca düzeltin ve yerleştirin. Stereotaktik aleti, CA1 dorsal hipokampus üzerindeki uyarım ve kayıt elektrotları için ilgili AP ve ML koordinatlarının konumuna göre ayarlayın.
      NOT: Dorsal longitudinal CA1 hipokampal bölgesinin koordinatlarını bulmada bir kılavuz olarak stereotaktik koordinatlarda fare beynini kullanın. Örneğin, CA1 hipokampal bölgesi için stereotaktik koordinat kayıt elektrodu için (AP 1.5, ML 1.0) ve stimülasyon elektrodu için (AP 1.7, ML 1.5) olacaktır.
   2. Uzunlamasına yönde kayıt elektrot uyarıcı elektrot lateral bulun.
      NOT: Kullanımdan önce hem stimülasyon hem de kayıt elektrotlarının temiz olduğundan emin olun. Bu, kayıt yaparken gürültünün oluşmasını önler.
   3. Kayıtlar için çok kanallı elektrotlar kullanın. İlk olarak, ilk kanalı kullanarak CA1 hipokampal bölgesinin stereotaktik koordinatlarını bulun. Geri kalan elektrotları, uyarım ve kayıt elektrotlarının açısının bregma noktasından orta hatla ilişkili olarak 30° ile 60° aralığında olması gibi yerleştirin.
      NOT: Bu açı CA1 hipokampal bölgesinin boylamsal yönelimine karşılık gelir.
   4. Kontrol olarak, CA1 bölgesinin üzerindeki kayıt elektrotunu ve dorsal hipokampusun CA3 bölgesi üzerindeki stimülasyon elektrotunu bulun. Örneğin, bir kılavuz olarak stereotaktik koordinatlarda fare beyin kullanarak, CA1-CA3 hipokampal bölge için stereotaktik koordinat (AP 1.8, ML 1.0) kayıt elektrodu için ve (AP 1.5, ML 1.5) stimülasyon elektrodu için olacaktır.
      NOT: Bu adım alternatif bir denetimdir ve ayrı bir denemede yapılmalıdır.
   5. Referans elektrodu maruz kalan beyin bölgesinin distal bir kısmına veya farenin derisinin altına yerleştirin.
   6. Kayıt sistemini açın.
   7. Kayıt ve veri toplama için yazılımı açın.
      NOT: Farklı laboratuvarlar kayıt ve veri toplama için tercih ettikleri yazılıma sahiptir.
   8. Mikroskop altında gözlemleyerek, mikromanipülörü kullanarak kayıt ve stimülasyon elektrotlarını beynin yüzeyine dokunana kadar yavaşça düşürün. Hipokampal bölgeye doğru derinliği hesaplamaya başlamak için sıfır noktası olarak nokta işaretleyin.
      NOT: Mikromanipülatör, herhangi bir zamanda elektrotun yerleştirildiği derinliği izlemek için kullanılabilir. Elektrot beyin yüzeyine dokunduğunda empedansta bir artış gözlemleyin.
   9. Elektrotları CA1 hipokampusu için seçilen stereotaktik koordinatlara karşılık gelen yaklaşık derinliğe yavaşça indirin.
      NOT: Seçilen stereotaktik koordinatlara karşılık gelen yaklaşık derinliği elde etmek için fare beynini stereotaktik koordinatlarda kılavuz olarak kullanın.
   10. Stimülasyon verin (100 μs süre, 30 s aralıklarla tekrarlanan) ve kararlı bir uyarılmış alan uyarıcı postsinaptik potansiyeli (fEPSP) gözlenene kadar 50 μm veya daha az adımlarla elektrot derinliğini ayarlayın.
       NOT: 20 μA'lık bir uyarıcı genellikle gözlemlenebilir bir tepki uyandırmak için yeterlidir.
   11. Uyarıcı yoğunluğunu değiştirerek kararlı bir fEPSP'nin uyarıldığından emin olun. FEPSP'nin eğiminde veya genliğinde belirgin bir artış her bir uyarıcı yoğunluğunda gözlenmelidir. Bu giriş-çıkış eğrisi olarak denir. Uyarılmış fEPSP'nin eğiminde daha fazla artış olmayan maksimum uyarıcı yoğunluğunu tespit etmek için bir giriş çıkışı (I-O) eğrisi oluşturun (Şekil6).
       NOT: Deney sırasında fiber vole kaybolursa verileri atın ve elektrot konumunu değiştirin.
   12. Taban çizgisi yoğunluğunu maksimumun %40 -50'sine ayarlamak için giriş-çıkış eğrisini kullanın. Temel kayıt için ilgili uyarıcı yoğunluğunu kullanın.
   13. Yerel alan potansiyelini 20 - 30 dakika için bir temel olarak kaydedin.
   14. Yüksek frekanslı stimülasyon (HFS) veya tetanozun maksimum yoğunluğun %75'ine uyarma için uyarıcı yoğunluğunu ayarlamak için aynı giriş-çıkış eğrisini kullanın. Alternatif olarak, uzun süreli depresyona neden olurken, düşük frekanslı stimülasyon (LFS) çağrıştırırken taban çizgisini kaydetmek için kullanılan aynı uyarıcı yoğunluğunu koruyun.
   15. LTP'yi indüklemek için 10 s aralıklı olarak 4 kez 100 Hz bakliyat tetanik stimülasyon uygulayın.
       NOT: Bu protokolü yalnızca uzun vadeli bir potansiyon denemesi üzerinde çalışırken kullanın.
   16. Zaten kurulmuş protokollere göre LTD'yi ikna etmek için 5 Hz (3 dk boyunca 900 uyaran), 1 Hz LFS (15 dk boyunca 900 uyaran) veya 1 Hz eşleştirilmiş darbe (50 ms eşleştirilmiş darbe aralığı, 15 dk boyunca 900 çift uyaran) düşük frekanslı stimülasyon uygulayın.
       NOT: Bu protokolleri yalnızca uzun süreli bir depresyon deneyi üzerinde çalışırken kullanın.
   17. Alternatif olarak, HFS veya LFS'den sonra yerel alan potansiyelini 1 saat olarak kaydedin.
   18. Verileri dışa aktarın ve yazılımı kullanarak analiz edin.
   19. Kaydedilen alanlara 30 s için 10 μA akım uyarma vererek kayıt ve stimülasyon elektrotkonumunu doğrulayın. Transkardial% 4 paraformaldehit ile fare perfuse ve göre Cresyl Violet ile dilimleme ve boyama için beyin hasat.
   20. Deneyden sonra servikal çıkığı veya öldürücü anestezik doz enjeksiyonu ile fare ötenazi.

2. In vitro alan kaydı

1. Oksijenli dilimleme ve yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) çözeltilerinin hazırlanması
   1. Dilimleme çözeltisinin 2 L'si için, hacimsel bir şişeye yaklaşık 1 L çift distile su ekleyin ve bir karıştırıcı tabağıüzerinde şiddetle karıştırın.
   2. Aşağıdaki dilimleme çözeltisi bileşenlerini ekleyin (mM): 87.0 NaCl, 2.5 KCl, 1.3 NaH₂PO₄, 25.0 NaHCO₃, 25.0 glikoz, 75.0 sakkaroz, 7.0 MgCl₂.6H₂O ve 0.5 CaCl₂,2H₂O (Tablo 1).
      NOT: Alternatif olarak, MgCl₂,6H₂O ve CaCl₂,2H₂O bu aşamada hariç tutulabilir ve daha sonra kullanıma hazır bir hacim olarak eklenebilir.
   3. Şiddetle karıştırırken çift distile su ile 2 L kadar top.
   4. ACSF 2 L için, bir hacimsel şişe de çift distile su yaklaşık 1 L ekleyin ve bir karıştırıcı plaka üzerinde şiddetle karıştırın.
   5. Aşağıdaki ACSF çözelti söktüre bileşenlerini (mM olarak): 125.0 NaCl, 2.5 KCl, 1.3 NaH₂PO₄, 25.0 NaHCO₃, 25 glikoz, 1.0 MgCl₂,6H₂O ve 2.0 CaCl 20 2H₂O (Tablo 1)ekleyin.
      NOT: Alternatif olarak, MgCl₂.6H₂O ve CaCl₂,2H₂O bu aşamada hariç tutulabilir ve daha sonra kullanıma hazır bir hacim olarak eklenebilir.
   6. Şiddetle karıştırırken çift distile su ile 2 L kadar top.
2. Kurulum ve beyin dilimleme
   1. 400 mL önceden hazırlanmış dilimleme çözeltisini ayrı bir şişeye dökün veyaklaşık 20 dakika boyunca oksijenat (% 95 O 2/5% CO₂₎dökün.
   2. 1,6 L çözeltinin geri kalanını 4 °C'lik bir buzdolabında saklayın. Mantar büyümesini önlemek için kullanılmadığı takdirde 1 haftaya kadar çözeltiyi atmalısınız.
   3. Şişeye oksijenli dilimleme çözeltisinin 200 mL'sini dökün, parafilm ile kaplayın ve yaklaşık 20 dakika boyunca -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın.
   4. Kalan 200 mL dilimleme çözeltisini bir beyin dilimi tutma odasına dökün ve sürekli köpürerek 32 °C'lik bir su banyosunda tutun.
   5. Tezgahı dilimleme için hazırlayın. Kağıt havluları ve cerrahi aletleri bankın üzerine yerleştirin. Hızlı ve verimli bir süreci kolaylaştırmak için cerrahiaraçları kullanım sırasına göre düzenleyin (Şekil 7).
   6. Soğutulmuş dilimleme solüsyonunu dondurucudan alın ve bir kabın içine yaklaşık 50 mL dökün. Nemlendirmek için filtre kağıdı içeren bir Petri kabına yaklaşık 10 mL dökün. Diseksiyon alanı nın yanında buza yerleştirin.
   7. Slushed dilimleme çözeltisinin geri kalanını dilimleme odasına dökün ve vibratome düzeltin.
   8. Hayvan Bakımı ve Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün laboratuvar kullanımı ile ilgili kurallar ve düzenlemeler ve Hong Kong City Üniversitesi ve Incheon National Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakım Komitesi onaylı yöntemleri kullanarak izofluran e-posta ile fare anestezik Üniversitesi.
   9. Anestezili fareyi bir makasla kesin ve başı kağıt mendil üzerine yerleştirin. Farenin kafatası kapsayan deri kesin ve makas ile kutanöz kasları kesti. Cerrahi makas kullanarak oksipital kemiğe orta hat boyunca kafatası plakaları kesin.
   10. Beyni ortaya çıkarmak için kafatasını künt çözgülerle aç. Yavaşça bir spatula ile beyin dışarı kepçe ve kabın soğutulmuş dilimleme çözeltisi yer. 30'ları bekleyin.
   11. Kaşığı kullanarak beyin alın ve dikkatle Petri çanak daha önce nemlendirilmiş filtre kağıt üzerine yerleştirin.
   12. Orta hattaki iki beyin yarıküresini neşter bıçağıyla ayırın. Hipokampusu hafifçe bir spatula ile korteksten ayırarak izole edin ve dikkatlice nemlendirilmiş filtre kağıdına yerleştirin. Neşter kullanarak izole hipokampus septal ve temporal ucunu kesip.
   13. Künt bir spatula ve fırça kullanarak izole hipokampus almak. Yavaşça fazla su kaldırmak için bir mendil kağıt üzerinde spatula dab.
   14. Vibratom dilimleme plakası yapıştırıcı küçük bir miktar uygulayın.
   15. Uzunlamasına CA1 hipokampal dilim için, yapıştırıcı ile dilimleme plakasına hipokampus CA3 bölge takın. Hızlı ama dikkatlice soğutulmuş oksijenli dilimleme çözeltisi içeren vibratom dilimleme odasına yerleştirin.
   16. Bir kontrol olarak hizmet verecek enine dilim için, vibratom dilimleme plakahipokampus ventral ucunu takın. Hızlı ama dikkatlice soğutulmuş oksijenli diseksiyon çözeltisi içeren dilimleme odasına yerleştirin.
       NOT: Bu adım yukarıdaki adıma alternatiftir ve ayrı olarak yapılmalıdır.
   17. Bıçak açısını 90°'ye yerleştirin. Vibratom parametrelerini 0,05 mm/s hıza, genliği 1,20 mm'ye ve 400 μm'lik dilim kalınlığına ayarlayın.
   18. Bağlı hipokampusu vibratomla dilimleyin.
       NOT: İyi bir uzunlamasına CA1 hipokampal beyin dilimi CA1 bir tabaka ve dentat girus 2 katmanları olacaktır. En fazla 2 iyi hipokampal dilim elde edilebilir. Alternatif olarak, bir enine hipokampal beyin dilimi dentat girus olacak, CA3 ve CA1 bölgeleri bozulmamış.
   19. Bir pipet ile vibratom uzunlamasına hipokampal beyin dilimleri aktarın ve su banyosunda beyin dilimi tutma odasında kuluçka.
   20. 32 °C sıcaklıkta 20 dakika su banyosunda inküblenmiş dilimler ve 30 dk geri kazanım için oda sıcaklığına getirmek.
       NOT: Alternatif olarak, beyin dilimini su banyosundan çıkarken aktarın ve 30 dk iyileşme için 32 °C sıcaklıkta akan oksijenli ACSF ile yavaşça kayıt odasına yerleştirin.
   21. Su banyosunda kuluçkaya yatarken, beyin dilimini kayıt odasına aktarmadan önce yaklaşık 20 - 30 dakika boyunca ayrı bir şişeye 400 mL ACSF çözeltisi dökün ve oksijenlendirin (%95 O 2/5% CO₂₎dökün. ACSF'yi 2 mL/dk hızda kayıt odasına sürekli olarak aşındırın.
   22. Akan ACSF'yi 32 °C'ye ısıtmak için sıcaklık kontrol cihazını açın.
   23. 1,6 L çözeltinin geri kalanını 4 °C'lik bir buzdolabında saklayın. Mantar büyümesini önlemek için kullanılmadığı takdirde çözeltiyi bir haftaya kadar bekletin.
3. In vitro kayıt
   1. Gerekli tüm donanımları açarak bir kayıt donanımı ayarlayın.
   2. Beyin dilimini dilim tutma odasından kayıt odasına aktarın. Künt forceps ile beyin diliminin konumunu ayarlayın ve bir arp ile yerinde tutun. ACSF'nin en az 20 dakika çalışmasına izin verin. Bu, kayıt yapmadan önce beyin diliminin stabil olmasını sağlar.
   3. Dahili bir çözüm olarak kayıt pipetini ACSF ile doldurun.
   4. Belirlenen yazılımla kayıt pipet direncini kontrol edin. Kayıt pipet direnci 3-5 MΩ aralığında olmalıdır.
   5. Veri toplama için yazılımı açın. Bu yazılım, daha önce gösterilen in vivo kayıtları gibi benzer bir şekilde veri toplama sağlayan benzer özelliklere sahip olmalıdır.
   6. Stereotaktik alet tutucuda kaydı ve uyarım elektrotlarını sıkıca düzeltin. Referans elektrotunu ACSF'ye kayıt odasına yerleştirin.
   7. Uzunlamasına dilimler için, stimülasyon ve kayıt elektrotunu stratum oriens (S.O.) olarak yerleştirin. Elektrotlar arasındaki mesafeyi yaklaşık 300 ila 500 m'ye tutun. Stimülasyon elektrodu beyin diliminin septalveya temporal tarafına yerleştirin ve aynı katmandan kaydedin (Şekil 8).
   8. Alternatif olarak, stimülasyon ve kayıt elektrotunu stratum radyatosuma (S.R.) yerleştirin. Beyin diliminin septal veya temporal tarafına stimülasyon elektrodu yerleştirin.
   9. Kontrol olarak enine dilimler için uyarıcı elektrotu CA3 (Schaffer teminat yolu) bölgesine ve CA1bölgesindeki kayıt elektrotunu konumlandırın (Şekil 9).
      NOT: Bu alternatif bir denetim adımıdır ve ayrı bir denemede yapılmalıdır.
   10. İzole uyarıcı jeneratörü açın ve stimülasyon verin (100 μs süre, 30 s aralıklarla tekrarlanan). Kararlı bir uyarılmış uyarıcı postsinaptik alan potansiyeli gözlenene kadar kayıt elektrot derinliğini ve/veya konumunu ayarlayın.
   11. Uyarıcı yoğunluğunu değiştirerek kararlı bir fEPSP'nin uyarıldığından emin olun. FEPSP'nin eğiminde belirgin bir değişiklik uyarıcı yoğunluğunun her değişimi ile gözlenmelidir. Bu giriş-çıkış eğrisi olarak denir. FEPSP'nin eğiminde daha fazla artış olmayan maksimum uyarıcı yoğunluğunu tespit etmek için bir giriş çıkışı (I-O) eğrisi oluşturun (Şekil 6).
       NOT: Deney sırasında fiber vole kaybolursa verileri atın ve elektrot konumunu değiştirin.
   12. Temel kayıt için uyarıcı yoğunluğunu ayarlamak ve yüksek frekanslı stimülasyon (HFS) veya tetanoyu maksimum uyarılmış fEPSP'nin %30-40'ına çıkarmak için giriş-çıkış eğrisini kullanın.
   13. Alternatif olarak, LTD ile ilgili deneylerde, temel kayıt için temel yoğunluğu ayarlamak ve düşük frekanslı stimülasyon (LFS) için maksimum uyarılmış fEPSP'nin %70'ine çağrıştırmak için giriş-çıkış eğrisini kullanın.
   14. Yerel alan potansiyelini 20 - 30 dk temel olarak kaydedin.
   15. LTP'yi indüklemek için 100 Hz darbenin HFS'sini 30 s aralıkla iki kez uygulayın.
   16. Alternatif olarak, LTD deneyleri için, 5 Hz (3 dk boyunca 900 uyaran) veya 1 Hz LFS (15 dk boyunca 900 uyaran) veya 1 Hz eşleştirilmiş darbe (50 ms eşleştirilmiş darbe aralığı, 15 dk boyunca 900 çift uyaran) düşük frekanslı stimülasyon uygulayın protokol oluşturuldu.
   17. Yerel alan potansiyelini HFS veya LFS'den sonra 1 saat olarak kaydedin.
   18. Veri aktarın ve analiz edin.

Sonuçlar

Hipokampusun uzunlamasına CA1 piramidal nöronlarının uzun süreli sinaptik plastisitesini hem in vivo hem de in vitro hücre dışı alan kayıtlarını kullanarak araştırdık. LTP ve LTD, hipokampusun enine ekseninde tek yönlü olarak gösterildiği uzun vadeli sinaptik plastisitenin yönleridir.

Burada boylamsal hipokampal beyin dilimleri kullanılarak hipokampusun CA1 boylamsal ekseninde LTP olduğunu gösterdik. Enine dilimlere dik olan septotemporal eksen boyunca hipokampusun uzunl...

Tartışmalar

Protokol, hipokampus in vitro uzunlamasına CA1-CA1 ekseninde beyin dilimlerinin yanı sıra in vivo'da uzun süreli sinaptik plastisiteyi tetikleme yöntemini göstermektedir. Özetlenen adımlar, bir deneycinin LTP ve LTD'yi uzunlamasına hipokampal CA1-CA1 bağlantısında araştırmasına yetecek kadar ayrıntı verir. Alan uyarıcı potansiyellerini başarılı bir şekilde kaydetmek için gereken becerileri geliştirmek için pratik yapmak gerekir.

Uygulamaya ihtiyaç duymanın yanı sı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atropine Sulphate salt monohydrate, ≥97% (TLC), crystalline	Sigma-Aldrich	5908-99-6	Stored in Dessicator
Axon Digidata 1550B
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10035-04-8
Clampex 10.7
D-(+)-Glucose ≥ 99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	50-99-7
Eyegel	Dechra
Isoflurane	RWD Life Sciences	R510-22
Magnesium chloride hexahydrate, BioXtra, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	7791-18-6
Matrix electrodes, Tungsten	FHC	18305
Multiclamp 700B Amplifier
Potassium chloride, BioXtra, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Potassium phosphate monobasic anhydrous ≥99%	Sigma-Aldrich	7778-77-0	Stored in Dessicator
Pump	Longer precision pump Co., Ltd	T-S113&JY10-14
Silicone oil	Sigma-Aldrich	63148-62-9
Sodium Bicarbonate, BioXtra, 99.5-100.5%	Sigma-Aldrich	144-55-8
Sodium Chloride, BioXtra, ≥99.5% (AT)	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Sodium phosphate monobasic, powder	Sigma-Aldrich	7558-80-7
Sucrose, ≥ 99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	57-50-1
Temperature controller	Warner Instruments	TC-324C
Tungsten microelectrodes	FHC	20843
Urethane, ≥99%	Sigma-Aldrich	51-79-6
Vibratome	Leica	VT-1200S
Water bath	Grant Instruments	SAP12