成年斑马鱼端脑中疟原虫DNA在活体传递的电穿孔方法

摘要

这里介绍的是一种在成年斑马鱼端脑中进行质粒DNA传递和脑细胞标记的电穿孔方法。该协议是一种快速而有效的方法，用于可视化和跟踪单个细胞，并开辟了将电穿孔应用于各种基因操作的新的可能性。

摘要

电穿孔是一种转染方法，其中电场应用于细胞，在细胞膜中产生临时孔隙，提高渗透性，从而允许将不同的分子引入细胞。本文采用电穿孔技术将质粒引入脑膜细胞，使成年斑马鱼的腹室区域划线。这些细胞的一小部分显示了干细胞的特性，并在斑马鱼大脑中产生新的神经元;因此，研究他们的行为对于确定他们在神经发生和再生中的作用至关重要。通过电穿孔引入质粒，可以长期标记和跟踪单个细胞。此外，Cre重组酶或Cas9等质粒可输送到单个细胞，从而实现基因重组或基因编辑，并为在受控、自然中评估细胞的自主基因功能提供了独特的机会环境。最后，采用这种详细的分步电穿孔方案，成功地将质粒引入大量单细胞。

引言

斑马鱼是优秀的动物模型，用于检查刺伤后的大脑再生。与哺乳动物相比，在进化阶梯上，斑马鱼等进化较少的物种通常表现出较高的形成性神经发生率和成人神经干细胞栖息的更广区域，导致在整个过程中不断产生新的神经元成人生活中的大多数大脑区域。与^{哺乳动物1}相比，这一特征似乎与斑马鱼的再生能力显著提升有关，因为斑马鱼在所研究的大多数脑损伤模型中具有显著的潜力，能够有效地产生新的^神经元。 3，4，5，6，7，8 。在这里，斑马鱼端脑研究，因为它是一个大脑区域与突出的神经发生在成年。这些成年神经发生区与成年哺乳动物脑^中神经原发生^{区9、10、11}同源。

由于存在径向胶质细胞或脑细胞等径向胶质，斑马鱼端脑素中存在丰富的神经原发生区。Ependymoglial细胞作为常驻的成人神经干细胞，负责在完整和再生^{的大脑3，5}中产生新的神经元。系骨追踪实验表明，心室叶膜对损伤有反应，然后增殖并产生新的神经细胞，迁移到病变^部位5。由于斑马鱼端脑的电化性质，腹腔细胞排列在心室表面，并建造心室壁。背叶心室壁由背端阴膜细胞层形成（图1A）。重要的是，斑马鱼叶黄体体现了哺乳动物径向胶质和阴叶细胞的特征。长径向过程是径向胶质细胞的典型特征，而细胞延伸和紧密结（及其心室位置）是阴囊^{细胞12、13、14}的典型特征。因此，这些细胞被称为阴叶细胞。

为了在再生过程中遵循单个阴叶细胞的体内行为，需要可靠地标记它们。荧光显微镜的体内细胞标记方法已经描述过，如内源性报告剂或亲脂^染料15。与电穿孔相比，这些方法可能需要较长的时间，而且通常无法提供单细胞标记或永久长期跟踪的可能性。然而，电穿孔（除了单细胞标记）提供了将新的DNA引入宿主细胞的可能性。此外，与其他DNA移植到细胞的方法相比，电穿孔已被证明是最有效的方法之一16，17，18，19。

这里介绍的是一个电穿孔协议，已细化，以标记在成年斑马鱼端脑中的单一脑细胞。该协议允许标记单个细胞，以便长期跟踪^它们20或操纵特定途径在细胞自主^{的方式21，22。}

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研究方案

本议定书中使用的所有动物均按标准饲养条件饲养，实验均按照欧盟和上巴伐利亚州政府的处理准则和条例进行（AZ 55.2-1-54-2532-0916）。

1. 用于电穿孔的质粒混合物的制备

1. 稀释无菌水中感兴趣的质粒，并加入快速的绿色染色剂溶液[1毫克/mL]。确保质粒的最终浓度为±1 μg/μL。以不超过3%的浓度添加污渍，因为它的唯一目的是给溶液着色和可视化心室注射。
2. 制备后，通过上下移液或手指敲击，混合质粒溶液。在室温 （RT） 下储存，直到使用。
   注:对于将两个质粒共电到同一细胞中，请确保混合物中使用的每个单个质粒的浓度至少为 0.8 纳克/μL，摩尔比为 1:1，以获得 80%-90% 共电效率。

2. 注射和电穿孔程序的准备

1. 准备针拔装置中注射所需的玻璃毛细管（外径 1 mm，内径 0.58 mm）。
2. 为了注入正确的质粒量（见上文），在 68.5°C 的温度下用两个轻重和两个重物拉毛细管（参见拉拔器规格的材料表）。
   注:在使用不同的拉拔器时，校准毛细管以提供适当体积的电穿孔组合。
3. 手动将喷射设备设置为 200 hPa 的喷射压力（通过转动 Pi 旋钮）和 0 hPa 的恒定压力。手动将喷射时间设置为手动模式，并用脚踏板控制压力。
4. 将电穿孔装置设置为"LV 模式"，54-57 V（每个脉冲 25 ms，间隔为 1 秒），带五个脉冲。将电极连接到设备。
5. 用干净的鱼水准备一个鱼缸，在电穿孔程序后，鱼将被麻醉唤醒。在整个回收期间，将空气石固定在空气泵上，直到鱼完全苏醒。
6. 采取一个普通的厨房海绵，并在海绵中做纵向切割，以在注射和电穿孔过程中将鱼放入水中（见上一份^{出版物3）。}
   注:厨房海绵应定期清洗或更换，以去除潜在的有毒化学品。
7. 在注射和电穿孔设置旁边放置少量高导电性多用途超声凝胶。
   注:这将确保足够的导电性，因此，电化电池在整个端脑中分布。

3. 斑马鱼麻醉

1. 麻醉前，在蒸馏水中制备0.2%MS222的麻醉液，用Tris-HCl缓冲液将pHH调整为7。用鱼水稀释此库存 1:10（即 0.02% MS222）。
2. 麻醉鱼，保持他们在这个工作的解决方案，直到身体和刺的运动消退（通常几分钟）。

4. 质粒溶液注射

1. 使用微装载机尖端将制备的玻璃毛细管填充 10 μL 质粒溶液。避免毛细管内形成气泡。
2. 按注射设备上的菜单/更换毛细管。将针头插入针头，并将其固定到针架中。
3. 在放大倍率为 3.2 倍或 4 倍的立体显微镜下，仅使用细端钳切割毛细管的尖端。将注射设备从"改变毛细管"模式切换到注射模式，然后用脚踏板施加压力，以确保质粒溶液在针头中轻松流出且不受阻碍。
4. 用麻醉液将鱼从养殖罐转移到容器（塑料盒）。等待几分钟，直到刺的移动消退。
5. 将鱼放入预湿海绵中，背侧朝上。在立体显微镜下执行以下所有注射步骤，以确保程序的准确性。
6. 使用不锈钢的解剖微刀，具有40毫米切削刃和0.5毫米厚度，在端脑后侧的鱼头骨上形成一个小洞（图1B），紧邻与光学技术的边界。
   注:这一步应该小心执行，因为孔应该非常小和肤浅，穿透只头骨，以避免脑损伤。
7. 根据需要倾斜鱼，以正确角度将玻璃毛细管的尖端朝向头骨，以方便毛细管尖端穿透孔。
8. 小心地将毛细管的尖端插入颅骨的孔中，直到到达脑心室（参见图1B）。这将需要穿透背端阴膜细胞层。特别小心不要将毛细管插入太深，以免与脑组织接触。将毛细管精确地保持在半球之间，在刺穿背端下阴层后留在心室内。
   注:这是一个非常微妙的步骤。使用色素化突变线（如^黄铜24）提高此过程的准确性，从而在注射过程中更好地可视化玻璃毛细管位置。
9. 在心室内的毛细管尖端时，通过用脚踏板施加约 10 s 的压力来注入质粒溶液，这相当于大约 1 μL 的质粒溶液。
   注:如果更换针拔器、毛细血管或注射器，应校准系统，以便始终提供 1 μL 质粒溶液。校准可以通过测量排入矿物油（如石蜡油）的质粒滴的直径，然后计算滴的体积来进行校准。注射10小时后，应有±1 μL的质粒液体排入矿物油。
10. 通过观察液体在整个心室的传播，确认上一步的成功。

5. 电穿孔

1. 将鱼从注射设置中取出，同时仍将其放在海绵中。
2. 将电极尖端的内侧浸入超声波凝胶中。
3. 用少量的超声波凝胶盖住鱼端膜。
4. 将鱼头放在电极之间，将正极放在鱼头的腹侧，负极放在背侧（图1C），同时仍将鱼的身体放在海绵中。这设定了在心室区域电化叶黄酮所需的电流方向。
5. 轻轻地将电极精确地压在端脑上（图1C）。使用脚踏板管理电流。将电极固定到位，直到所有五个脉冲都完成。

6. 鱼类恢复

1. 让鱼在先前准备好的连续加气罐中恢复，直到它醒来。利多卡因凝胶可以涂在头骨上，以减轻任何可能发展的痛苦。

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结果

所述电穿孔方法允许将质粒DNA输送到脑细胞中，这些细胞表面位于斑马鱼端脑素和背端脑细胞层（图1A）。

如果电穿孔的结果为阳性，可以在其他阴极细胞中观察到标记的单阴白细胞（图2A，B中的红细胞）（图2A，B中为白色）。根据电穿孔过程的效率，可以标记更高（

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讨论

这种电穿孔方案是一种可靠的体内方法，用于标记单个细胞。该协议可能需要进一步适应，以标记其他细胞类型，如神经元或寡核苷酸细胞。为了获得成功的标签，可以使用含有不同促进剂的质粒。鸡-β蛋白促进剂，eF1α，CMV和泛素促进剂以前曾被用来驱动不同转基因在ependyglia及其^后代23的表达。然而，观察到了不同转基因表达的动力学，这应当加以考虑。例如，CMV启动子驱动?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258-25G	For coloring plasmid solution
MS222	Sigma-Aldrich	A5040-25G	MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light
Ultrasound gel	SignaGel, Parker laboratories INC.	15-60	Electrode Gel
Equipment
Air pump	TetraTec APS 50, 10l-60l		Can be bought in the pet shops
BTX Tweezertrodes Electrodes	Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus	45-0486	1 mm diameter
Electroporation device	BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus	45-0662
Injection device	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013
Standard Wall Borosillicate Glass Capillary	Warner Instruments	64-0766	Model No: G100-4
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micro-knife	Fine Science Tools	10056-12
Joystick micromanipulator	Narishige Japan	MN - 151
Needle holder	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013	Needle holder comes together with the injection device
Needle pulling device	Narishige Japan	Model No: PC-10	The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100
Petri dishes	Greiner Bio-One International	633161