Metodo di elettroporazione per in vivo Consegna del DNA plasmide nel Telencephalon del pesce zebra adulto

Riepilogo

Presentato qui è un metodo di elettroporazione per la consegna di DNA plasmide e l'etichettatura delle cellule ependymoglial nel telecefalo di pesce zebra adulto. Questo protocollo è un metodo rapido ed efficiente per visualizzare e tracciare singole cellule ependymoglial e apre nuove possibilità di applicare l'elettroporazione a un'ampia gamma di manipolazioni genetiche.

Abstract

L'elettroporazione è un metodo di trasfezione in cui un campo elettrico viene applicato alle cellule per creare pori temporanei in una membrana cellulare e aumentarne la permeabilità, consentendo così l'introduzione di diverse molecole nella cellula. In questo documento, l'elettroporazione viene utilizzata per introdurre il plasmidia alle cellule ependymoglial, che allineano la zona ventricolare del telencephalon del pesce zebra adulto. Una frazione di queste cellule mostra le proprietà delle cellule staminali e genera nuovi neuroni nel cervello del pesce zebra; Pertanto, studiare il loro comportamento è essenziale per determinare i loro ruoli nella neurogenesi e rigenerazione. L'introduzione di plasmidi tramite elettroporazione consente l'etichettatura e il tracciamento a lungo termine di una singola cellula ependymoglial. Inoltre, plasmidi come Cre ricombinase o Cas9 possono essere consegnati a singole cellule ependymoglial, il che consente la ricombinazione genica o l'editing genico e fornisce un'opportunità unica per valutare la funzione genica autonoma della cellula in un l'ambiente. Infine, questo protocollo dettagliato di elettroporazione passo-passo viene utilizzato per ottenere l'introduzione di successo di plasmidi in un gran numero di singole cellule ependymoglial.

Introduzione

I pesci zebra sono eccellenti modelli animali per esaminare la rigenerazione cerebrale dopo una lesione da taglio. Rispetto ai mammiferi, sulla scala evolutiva, le specie meno evolute come il pesce zebra mostrano generalmente tassi più elevati di neurogenesi costitutiva e aree più ampie di residenza delle cellule staminali neurali adulte, portando a una generazione costante di nuovi neuroni in tutto la maggior parte delle aree cerebrali nella vita adulta. Questa caratteristica sembra correlare con una capacità rigenerativa significativamente più elevata del pesce zebra rispetto ai mammiferi¹, poiché i pesci zebra hanno un notevole potenziale per generare in modo efficiente nuovi neuroni nella maggior parte dei modelli di lesioni cerebrali studiati^{2, 3,4,5,6,7,8}. Qui, il telecefalo del pesce zebra è studiato, poiché è una zona del cervello con neurogenesi prominente in età adulta. Queste zone di neurogenesi adulta sono omologhe alle zone neurogeniche nel cervello dei mammiferi adulti^9,10,11.

Abbondanti aree neurogeniche nel telencephalon del pesce zebra sono presenti a causa dell'esistenza di glia radiali come cellule o cellule ependymoglia. Le cellule ependymogliali agiscono come cellule staminali neurali adulte residenti e sono responsabili della generazione di nuovi neuroni sia nel cervello intatto che in quello rigenerante^3,5. Esperimenti di tracciamento del lignaggio hanno dimostrato che l'ependymoglia ventricolare reagisce alle lesioni, quindi prolifera e genera nuovi neuroblasti che migrano al sito di lesione⁵. A causa della natura eversadela del telecefalo del pesce zebra, le cellule ependymogliali allineano la superficie ventricolare e costruiscono la parete ventricolare ventrale. La parete ventricolare dorsale è formata da uno strato di cellule ependymal dorsale (Figura 1A). È importante sottolineare che il pesce zebra ependymoglia incarna le caratteristiche della glia radiale dei mammiferi e delle cellule ependymal. I lunghi processi radiali sono una caratteristica tipica delle celle radiali glia, mentre le estensioni cellulari e le giunzioni strette (così come le loro posizioni ventricolari) sono caratteristiche tipiche delle cellule ependymal^12,13,14. Pertanto, queste cellule sono indicate come cellule ependymoglial.

Per seguire il comportamento in vivo delle singole cellule ependymoglial durante la rigenerazione, devono essere etichettate in modo affidabile. Sono stati descritti in precedenza vari metodi di etichettatura cellulare in vivo per la microscopia fluorescente, come i giornalisti endogeni o i coloranti lipofili¹⁵. Questi metodi, a differenza dell'elettroporazione, possono richiedere periodi di tempo più lunghi e spesso non offrono la possibilità di etichettatura a cella singola o di tracciamento permanente a lungo termine. L'elettroporazione, tuttavia (oltre all'etichettatura a singola cellula), offre la possibilità di introdurre nuovo DNA nella cellula ospite. Inoltre, rispetto ad altri metodi di trasferimento del DNA nelle cellule, l'elettroporazione è stata dimostrata essere uno dei metodi più efficienti^16,17,18,19.

Presentato qui è un protocollo di elettroporazione che è stato perfezionato allo scopo di etichettare singole cellule ependymoglial nel telecefalo di zebra per adulti. Questo protocollo consente l'etichettatura di singole cellule ependymoglial per seguirle per un periodo²⁰ a lungo termine o per manipolare percorsi specifici in modo cellulare-autonomo^21,22.

Protocollo

Tutti gli animali utilizzati in questo protocollo sono stati tenuti in condizioni di allevamento standard, e gli esperimenti sono stati effettuati secondo le linee guida e i regolamenti di gestione dell'UE e del governo della Baviera superiore (Az 55.2-1-54-2532-0916).

1. Preparazione della miscela di plasmide per l'elettroporazione

1. Diluire il plasmide di interesse per l'acqua sterile e aggiungere veloce soluzione di scorta di macchie verdi [1 mg/mL]. Assicurarsi che la concentrazione finale del plasmipro sia di 1 g/l. Aggiungere la macchia ad una concentrazione non superiore al 3%, poiché il suo unico scopo è colorare la soluzione e visualizzare l'iniezione ventricolare.
2. Una volta preparata, mescolare la soluzione plasmide pipetting su e giù più volte o toccando il dito. Conservare a temperatura ambiente (RT) fino all'utilizzo.
   NOT: Per la coelettroporrazione di due plasmidi nella stessa cellula, assicurarsi che la concentrazione di ogni singolo plasmide utilizzato nella miscela sia di almeno 0,8 ng/L con un rapporto molare di 1:1 per ottenere un'efficienza di coelettrolazione 80%–90%.

2. Preparativi per la procedura di iniezione ed elettroporazione

1. Preparare i capillari di vetro (diametro esterno 1 mm, diametro interno 0,58 mm) necessari per l'iniezione nell'apparato di trazione dell'ago.
2. Al fine di iniettare la giusta quantità di plasmide (vedi sopra), tirare il capillare ad una temperatura di 68,5 gradi centigradi con due pesi leggeri e due pesanti (vedere Tabella dei materiali per le specifiche dell'emittente).
   NOT: Nel caso in cui venga utilizzato un tiratore diverso, calibrare il capillare per fornire il volume appropriato della miscela di elettroporazione.
3. Impostare manualmente il dispositivo di iniezione su una pressione di iniezione di 200 hPa (ruotando la manopola Pi) e una pressione costante di 0 hPa. Impostare manualmente il tempo di iniezione in modalità manuale e controllare la pressione con il pedale del piede.
4. Impostare il dispositivo di elettroporazione su "modalità LV" con cinque impulsi a 54-57 V (25 ms ciascuno con intervalli di 1 s). Collegare gli elettrodi al dispositivo.
5. Preparare un acqua di pesce con acqua di pesce pulita, dove il pesce sarà risvegliato dall'anestesia dopo la procedura di elettroporazione. Aerare l'acqua mantenendo la pietra d'aria attaccata alla pompa dell'aria per l'intero periodo di recupero fino a quando il pesce è completamente risvegliato.
6. Prendere una normale spugna da cucina e fare un taglio longitudinale nella spugna per tenere i pesci durante la procedura di iniezione ed elettroporazione (vedi precedente pubblicazione³).
   NOT: La spugna da cucina deve essere regolarmente lavata o sostituita al fine di rimuovere potenziali sostanze chimiche tossiche.
7. Posizionare una piccola quantità di gel ad ultrasuoni multiuso altamente conduttivo accanto alla configurazione di iniezione ed elettroporazione.
   NOT: Ciò garantirà un'adeguata conduttività elettrica e, di conseguenza, la distribuzione delle cellule elettroporate in tutto il telecefalo.

3. Anestesia di pesce zebra

1. Prima dell'anestesizzazione, preparare una soluzione di riserva di anestesia con 0,2% MS222 in acqua distillata e regolare il pH a 7 con buffer Tris-HCl. Diluire questo stock 1:10 (cioè a 0,02% MS222) utilizzando acqua di pesce.
2. Anestesizzare i pesci tenendoli in questa soluzione di lavoro fino a quando il movimento del corpo e delle branchie non si placa (tipicamente per un paio di minuti).

4. Iniezione di soluzione Plasmid

1. Riempire il capillare di vetro preparato con 10 gradi l di soluzione plasmide utilizzando punte di microloader. Evitare la formazione di bolle d'aria all'interno del capillare.
2. Premere Menu/Cambia Capillare sul dispositivo di iniezione. Inserire e fissare l'ago nel supporto dell'ago.
3. Sotto uno stereoscopio con un ingrandimento di 3.2x o 4x, tagliare solo la punta del capillare utilizzando pinze fine-end. Cambia il dispositivo di iniezione dalla modalità Cambia Capillary in modalità Iniettare, quindi applica la pressione con un pedale per assicurarti che la soluzione plasmide esca facilmente dall'ago e senza ostacoli.
4. Trasferire il pesce dalla vasca di allevamento al contenitore (scatola di plastica) con soluzione anestetica. Attendere qualche minuto fino a quando il movimento delle branchie si placa.
5. Posizionare il pesce nella spugna pre-bagnata con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Eseguire tutte le seguenti fasi di iniezione sotto lo stereomicroscopio per garantire l'accuratezza della procedura.
6. Utilizzando un microcoltello dissezionante in acciaio inossidabile con un tagliente di 40 mm e uno spessore di 0,5 mm, creare un piccolo foro nel cranio del pesce sul lato posteriore del telencephalon (Figura 1B), proprio accanto al bordo con tectum ottico.
   NOT: Questo passaggio deve essere eseguito con attenzione poiché il foro dovrebbe essere molto piccolo e superficiale, penetrando esclusivamente nel cranio, per evitare danni cerebrali.
7. Inclinare il pesce in base alle esigenze e orientare la punta del vetro capillare verso il cranio nell'angolo corretto per facilitare la penetrazione della punta capillare attraverso il foro.
8. Inserire la punta del capillare attraverso il foro nel cranio con attenzione fino a raggiungere il ventricolo telencefalico (vedere Figura 1B). Ciò richiederà penetrazione attraverso lo strato cellulare ependymal dorsale. Prestare particolare attenzione a non inserire il capillare troppo profondamente per evitare il contatto con il tessuto cerebrale. Mantenere il capillare esattamente tra gli emisferi, rimanendo all'interno del ventricolo subito dopo aver perforato lo strato ependilmale dorsale.
   NOT: Questo è un passo molto delicato. L'accuratezza di questa procedura è migliorata utilizzando linee mutanti di pigmentazione come brassy²⁴, consentendo una migliore visualizzazione della posizione capillare del vetro durante l'iniezione.
9. Con la punta capillare all'interno del ventricolo, iniettare la soluzione plasmide applicando pressione con il pedale per circa 10 s, che corrisponde a circa 1 -L di soluzione plasmide.
   NOT: Se si cambia l'ape puller, i capillari o l'iniettore, il sistema deve essere calibrato in modo da fornire sempre 1 l'impianto di soluzione plasmide. La calibrazione può essere eseguita misurando il diametro della goccia plasmide espulsa in un olio minerale (ad esempio, l'olio di paraffina) e successivamente calcolando il volume della goccia. Dopo 10 s di iniezione, ci dovrebbe essere 1 l di liquido plasmide espulso nell'olio minerale.
10. Confermare il successo del passo precedente osservando la diffusione del liquido in tutto il ventricolo.

5. Elettroporazione

1. Rimuovere il pesce dal set-up iniezione mentre ancora tenendolo nella spugna.
2. Immergere il lato interno della punta degli elettrodi nel gel ad ultrasuoni.
3. Coprire il telecefalo di pesce con una piccola quantità di gel ad ultrasuoni.
4. Posizionare la testa di pesce tra gli elettrodi, posizionando l'elettrodo positivo sul lato ventrale della testa del pesce e l'elettrodo negativo sul lato dorsale (Figura 1C), pur tenendo il corpo del pesce nella spugna. Questo imposta la direzione del flusso della corrente necessaria per elettropolirare ependymoglia posizionata in zona subventricolare.
5. Premere gli elettrodi delicatamente e con precisione contro il telencephalon (Figura 1C). Amministrare la corrente con il pedale. Tenere gli elettrodi in posizione fino a quando tutti e cinque gli impulsi sono finiti.

6. Recupero del pesce

1. Lascia che il pesce recuperi nel serbatoio precedentemente preparato e continuamente aerato fino a quando non si sveglia. Gel lidocaina potrebbe essere applicato sul cranio al fine di alleviare qualsiasi dolore eventualmente sviluppato.

Risultati

Il metodo di elettroporazione descritto consente la consegna di DNA plasmide in cellule ependymogliali, che si trovano superficialmente nel telecefalo del pesce zebra e appena sotto lo strato cellulare ependymal dorsale (Figura 1A).

Se il risultato dell'elettroporazione è positivo, è possibile osservare le singole celle ependymoglial (cellule rosse nella figura 2A,B) tra le altre ...

Discussione

Questo protocollo di elettroporazione è un metodo affidabile in vivo per etichettare le singole cellule ependymoglial. Il protocollo potrebbe essere necessario un ulteriore adattamento per etichettare altri tipi di cellule come neuroni o oligodendrociti. Per ottenere un'etichettatura di successo, è possibile utilizzare plasmidi contenenti diversi promotori. Pollo-beta actin promotore, eF1alpha, CMV e promotore di ubiquitina sono stati precedentemente utilizzati per guidare l'espressione di diversi transgeni in ependymo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258-25G	For coloring plasmid solution
MS222	Sigma-Aldrich	A5040-25G	MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light
Ultrasound gel	SignaGel, Parker laboratories INC.	15-60	Electrode Gel
Equipment
Air pump	TetraTec APS 50, 10l-60l		Can be bought in the pet shops
BTX Tweezertrodes Electrodes	Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus	45-0486	1 mm diameter
Electroporation device	BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus	45-0662
Injection device	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013
Standard Wall Borosillicate Glass Capillary	Warner Instruments	64-0766	Model No: G100-4
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micro-knife	Fine Science Tools	10056-12
Joystick micromanipulator	Narishige Japan	MN - 151
Needle holder	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013	Needle holder comes together with the injection device
Needle pulling device	Narishige Japan	Model No: PC-10	The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100
Petri dishes	Greiner Bio-One International	633161