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摘要

我们向对乙酰氨基酚（APAP）暴露了含有肠道和肝脏器官的微生理系统（MPS）。本文介绍了MPS中器官生产和APAP药代动力学和毒理学属性评估的方法。它还描述了验证结果所需的组织功能分析。

摘要

最近引进的培养人体器官的微生理系统（MPS）在药物开发过程的临床前测试阶段有望比动物表现更好，因为它们是遗传人类，并重述组织之间的相互作用。在这项研究中，将人类肠道屏障（由Caco-2和HT-29细胞的共培养物模拟）和肝脏当量（由分化的肝细胞和人类肝硬质细胞的球类模拟）整合到双器官芯片（2-OC）微流体装置中，以评估一些乙酰氨基酚（APAP）药理动力学（PK）和毒理学特性。MPS有三个组件:肠道只有2-OC，肝脏只有2-OC，和肠/肝脏2-OC与相同的介质细读两个器官。对于 PK 评估，我们在通过肠道屏障（模拟口腔路线）或介质（模拟静脉路线）后，在介质中以预设的时间点对 APAP 进行加注，分别值 12 μM 和 2 μM。通过反相高压液相色谱（HPLC）对介质样品进行分析。对器官分析为基因表达，TEER值，蛋白质表达和活性，然后收集，固定，并提交一组形态学评估。MTT 技术在评估器官生存能力方面表现良好，但高含量分析 （HCA） 能够检测出非常早期的毒性事件，以响应 APAP 治疗。我们验证，介质流没有显著影响APAP吸收，但它显著改善肝脏等效功能。APAP人类肠道吸收和肝代谢可以在MPS中模拟。MPS 数据与硅建模之间的关联在提高体外方法的可预测性方面有很大的潜力，并且比在药代动力学和毒理学研究中的动物模型具有更高的准确性。

引言

由于基因组和蛋白质组的差异，动物模型对几种人类结果的预测价值有限。此外，它们既费时又昂贵，而且在道德上也值得怀疑。MPS 是一项相对较新的技术，旨在提高预测能力，减少临床前测试的成本和时间。它们是在媒体流下培养器官（器官的人工模仿功能单元）的微流体装置，促进器官-器官通信。由人类细胞制造的有机体增加转化相关性2，3，4。MPS 预期性能优于动物试验，因为它们是基因人类，并重述组织之间的相互作用。当完全正常运行时，MPS 将提供更有意义的结果，以更高的速度和更低的成本和风险 4。许多团体正在开发MPS，用于多种目的，特别是疾病模型，以测试药物的疗效。

暴露水平是评估药物疗效和毒性的最关键参数之一5，6，7，8，9，10，11，12。MPS 允许有机体整合，模拟全身暴露，预期性能优于传统的 2D 人体组织培养。该技术可显著提高复合肠道吸收和肝代谢的预测。

考虑到这两个器官在药物生物利用度和全身暴露13、14、15等的中心作用，整合肠道和肝脏等量模型的MPS是一个很好的起点。APAP是一种有吸引力的药物，用于研究没有肾脏等价物的MPS，因为它的代谢主要由肝脏16，17完成。

2-OC是一种双室微流体装置，适用于由微通道16连接的两种不同人体等效组织/器官的培养。为了模拟体外人类口服/静脉注射药物，并评估肠道和肝脏等价物之间的交代对APAP药代动力学的影响， 除了器官的功能和生存能力外，还进行了三种不同的MPS组件:（1） 一个"肠2-OC MPS"，由一个肠道等效物组成，其培养物中含有一个包含Caco-2+HT-29细胞共培养的培养物，并集成到2-OC装置中;（2） 由肝球类组成、由 HepaRG + HHSteC （人类肝状斯特拉特细胞） 组成的"肝脏 2-OC MPS"，集成在 2-OC 器件中;和 （3） 由一个设备隔间中的肠道等效物组成的"肠/肝脏 2-OC MPS"，通过介质流经微流体通道与肝脏等效物通信。

由于机械刺激（压缩、拉伸和剪切）对细胞的生存能力和功能18、19、20的影响，所有测定都是在静态（无流动）和动态（带流量）条件下进行的。本文介绍了APAP口服/静脉注射给药模拟的方案，以及含有人类肠道和肝脏等效模型的2-OC MPS中各自的吸收/代谢和毒理学分析。

研究方案

1. 生产组织等价物，用于2-OC的栽培

  1. 小肠屏障当量生产
    1. 使用肠道等效介质维持 Caco-2 和 HT-29 细胞:DMEM 辅以 10% FBS、1% 青霉素和链霉素，以及 1% 非必需氨基酸，本手稿中称为"DMEM S"。
    2. 取出培养基，用1x DPBS洗涤两次，并加入8 mL的0.25%的尝试素/EDTA，以分离细胞培养瓶中生长的Caco-2细胞（175厘米2）。在37°C下孵育5分钟，通过添加至少双量的三辛抑制剂来停止反应。对HT-29细胞执行相同的程序，调整试剂体积，因为需要少量的这些细胞，并且它们保持在较小的烧瓶中（75 厘米2）。
    3. 在250 x g下 离心5分钟，从两个管中去除上清液，并在10 mL的DMEM S. 计数细胞中重新产生细胞颗粒，确保细胞生存能力高于80%。无菌整合细胞培养插入在24井板以前充满400μL的DMEM S每井在基底侧（代表人类血液）。
    4. 以9:1 21的比例共同培养Caco-2和HT-29细胞。使用 2.25 x 105 Caco-2 和 2.5 x 104 HT-29 细胞到每个肠道当量，最终体积为 200 μL 的 DMEM S. 根据所需的器官数量调整细胞数和体积。仔细混合。
    5. 移液 200 μL 的细胞溶液进入每个插入的 apical 侧 （代表人类肠道流明侧）， 每个插入播种 250，000 个细胞。共同培养插入中的细胞三周22。每周至少更换三次介质，用无菌的巴斯德移液器从脂肪和基础两侧吸气，注意不要损坏完整的细胞屏障。
      注:继续在细胞侧的渴望，以便不接触细胞屏障（通过支撑细胞插入件塑料边缘上的巴斯德移液器吸气）。
    6. 根据制造商的说明，每三天使用电压计23测量 TEER（跨地电阻）来检查紧固的单层形成。
      1. 执行空白，测量无细胞的细胞培养插入的电阻，但使用相同的细胞介质和相同的细胞板。
      2. 通过从组织等效电阻中减去空白电阻来计算组织电阻，并乘以过滤膜的有效表面积（0.6 厘米2）。良好的肠阻屏障阻力在150至400 Ω厘米2。
        注:21天后，细胞必须完全分化，肠道屏障形成，因此肠道等效物可以整合到MPS中。
  2. 肝脏等价物生产
    1. 使用肝脏等效介质维持肝素细胞，这是威廉的中等E辅以10%的胎儿牛血清，2mM L-谷氨酰胺，100单位/mL青霉素，100μg/mL链霉素，5微克/mL人胰岛素和5×10-5M 氢皮质松，并在本手稿中命名为"威廉姆斯E S"。每2-3天更新一次肝细胞介质，保持细胞培养两周，以启动肝细胞和胆血管细胞的分化。
    2. 前两周后，在 HepaRG 的培养基中再添加 2% DMSO，再增加两周，以完成细胞分化24，25。使用聚 L-lysine 涂层细胞培养瓶，在斯特拉特细胞培养基 （SteC CM） 中种植 HHSTeC，每两三天更换一次介质。
    3. 取出培养素，用1x DPBS洗涤两次，加入8 mL的0.05%Trypsin/EDTA，分离细胞培养瓶中生长的肝细胞（175厘米2）。在37°C下孵育5至10分钟，通过添加至少两倍的三辛抑制剂体积来停止反应。对HHSTeC执行相同的操作，调整试剂体积，因为需要少量的这些细胞，它们可以保持在较小的烧瓶（75厘米2）中。
    4. 在 250 x g 下 离心 5 分钟，取出上一代，并在 Williams E S 介质中重新暂停细胞颗粒。计数细胞，确保细胞生存能力高于80%。
    5. 在Williams E S介质16中，以24:1的比例生成结合肝球蛋白和HHSTeC细胞的肝球状。加入 4.8 x 104 分化的 HepaRG 和 0.2 x10 4 HHSTeC，组成 50，000 个细胞的每个肝球体，体积为 80 μL。仔细混合。
    6. 使用多通道移液器，在每孔384个球形微孔板中分配80μL的组合细胞池，该孔具有圆形井底几何形状。
      注:四天后，形成约300μm的球体。
    7. 使用宽孔尖端，将肝脏球体转移到超低附着6孔板，允许所需的"一对一"计数。

2. 肠和肝脏当量在2-OC MPS中的整合

  1. 用于吸收测定的肠道 2-OC MPS 组件
    1. 移液 500 μL 的 DMEM S 进入较小的 2-OC 和 300 μL 的较大隔间。在24个井板中吸气每个肠道屏障的基底和孔基 media。使用无菌钳子，将每个 2-OC 电路集成一个刀片，特别是集成到较大的隔间中。在肠侧涂抹200μL的肠介质。
      注:在将器官集成到 MPS 中时，避免形成气泡。
    2. 将 MPS 连接到控制单元，控制单元必须连接到加压空气供应。设置参数:压力大约为 ±300 bar，泵送频率为 0.3 Hz。第二天，进行APAP治疗。
  2. 肝脏 2-OC MPS 组件用于代谢检测
    1. 将威廉姆斯 E S 的移液 650 μL 放入大隔间，将 350 μL 放入较小的隔间，从而接收球体。在超低附件 6 孔板中，使用宽孔尖端计算球体。每个肝脏等价物由二十个球形26组成。每个电路集成20个肝脏当量，使用宽孔尖端，只允许将器官转移到2-OC的较小隔间中。
    2. 将 MPS 连接到控制单元，控制单元必须连接到加压空气供应。设置参数:压力大约为 ±300 bar，泵送频率为 0.3 Hz。第二天，进行APAP治疗。
  3. 肠道/肝脏 2-OC MPS 组件，用于吸收和代谢测定
    1. 将两种介质（肠和肝脏）组合在1:4的比例中，这意味着肠面的DMEM S为200μL，壁体侧为800μL，在基础侧为800μL。同时在2-OC中整合肠道和肝脏当量。
    2. 将 MPS 连接到控制单元，控制单元必须连接到加压空气供应。设置参数:压力大约为 ±300 bar，泵送频率为 0.3 Hz。第二天，进行APAP治疗。
      注:对于所有实验，在三元化中执行每个时间点，这意味着三个分离的 2-OC 电路（即 1 和 1/2 2-OC 器件）。每个 2-OC 电路的总体积为 1 mL。

3. 乙酰氨基酚 （APAP） 制备

  1. 准备APAP库存溶液，在绝对乙醇中溶解APAP。在实验当天，在相应的介质（APAP溶液）中稀释APAP，浓度为12μM用于"口服给药"，2微米用于"静脉注射"。
  2. 确保两种管理方法在车辆控制和处理溶液中乙醇的最终浓度为 0.5%。对于正对比（100 mM APAP），乙醇浓度为2%。

4. 测试物质管理和介质取样

  1. APAP"口头"管理和媒体抽样
    1. 将2-OC.P出液500μL中各肠道屏障的基底和腹膜培养基吸入有机基质侧大隔间，将300μL吸入小隔间。
    2. 检查有无气泡，并继续进行肠道屏障等效治疗与测试物质在一面，模拟口服。通过在肠道培养插入物的皮面添加 200 μL 的 12 μM APAP 溶液来模拟 APAP"口服"给药，该溶液表示肠道"流明侧"（图 1B）。将 MPS 连接到控制单元。
    3. 收集总体积从阿皮和从基础侧在以下时间点:0小时，5分钟，15分钟，30分钟，1小时，3小时，6小时，12小时，和24小时15，27。在静态和动态条件下进行三分之一酸酯的所有实验，并在单独的微管中收集每个三分之一的每个样本。使用 HPLC/UV 分析样品。
      注:单独的基础样本和基础样本。
  2. APAP"静脉"给药和介质采样
    1. 通过将 2 μM APAP 溶液直接施用到肝脏室，模拟"静脉注射"途径。吸气所有 2-OC 中等内容。将测试物质放入大隔间和 350 μL 的相同介质的移液器 650 μL 放入包含 20 个球状物的较小隔间中。收集以下时间点的所有卷:0 小时、30 分钟、1 小时、2 小时、3 小时、6 小时、12 小时和 24 小时27、28。
    2. 在静态和动态条件下进行三次三次试验。在单独的微管中收集每个三分之一的样品。使用 HPLC/UV 分析样品。

5. 仪器和色谱条件

  1. HPLC 分析
    1. 根据表 1 设置 HPLC 分析 的所有相关参数。
    2. 在真空下，通过0.45 μm膜过滤器过滤移动相。通过 0.22 μm 孔径 PVDF 注射器过滤器（直径 13 mm）过滤样品，并将其存放在小瓶中。开始测量。
  2. 库存解决方案、校准标准和质量控制 （QC） 样品
    1. 在醋酸铵缓冲液（100 mM，pH 6.8）中制备10 mM的APAP库存溶液，用用醋酸铵缓冲液稀释的DMEM S和Williams E S细胞培养基介质进一步稀释，以实现0.25至100.00μM的工作溶液。
    2. 在三钙中包括一组校准样品，在三次三度中包括质量控制样品。通过串行稀释准备这些标准。
    3. 创建 APAP 峰值区域与 APAP 标称标准浓度的校准曲线。确定每个校准曲线的线性回归拟合。通过目视检测、相关系数、运行内和运行间精度和精度值评估各种校准模型的拟合优度。
    4. 注射DMEM S和Williams E S介质的空白样品稀释在醋酸铵缓冲液（1:1，v/v）中。为APAP浓度为0.50（LOQ）、4.50、45.00和90.00μM，在用醋酸铵缓冲液稀释的DMEM S和Williams E S介质中制备质量控制样品的三倍。
    5. 确保质量控制样品是根据新的库存解决方案准备的，与用于生成标准曲线的解决方案不同。使用质量控制样本调查运行内和运行间变化。
  3. 验证程序
    1. 按照先前报告的程序29，30执行生物分析方法的验证。分别考虑威廉姆斯 E S 和 DMEM S 细胞培养基，在五到六个不同的场合进行色谱运行。
    2. 确保根据APAP（轴 y）的峰值区域（轴 y）与各自的标称浓度（轴 x）绘制的在醋酸铵缓冲液中稀释的DMEM S或Williams E S细胞培养基中从0.25至100.00μM的校准点。将这些标准校准曲线的斜率与醋酸铵缓冲液中准备的校准曲线的斜率进行比较。确保所有校准曲线的相关性值至少为 0.998。
    3. 使用 5 天或 6 个不同天在四个不同级别 LLOQ、低、中、高质量控制的复制，确定代理矩阵中分析的精度和准确性（内部和运行间）。在同一天，在含有0.50、4.50、45.00和90.00μM.00 μMM APAP浓度（n= 3）的醋酸铵缓冲液（1:1，v/v）中稀释的DMEM S或Williams E S细胞培养基中执行运行内精度和精度测量。
    4. 根据最近获得的校准曲线评估每组包含APAP浓度的质量控制样品。通过利益化合物的分离程度和干扰成分引起的其他色谱峰的选择性测试测定的选择性。
  4. 定量下限 （LLOQ） 和检测限值 （LOD）
    1. 根据响应和斜率方法的标准偏差确定定量 （LLOQ） 的下限。使用公式 10°/S 计算，其中 α 是 y-intercept 的标准偏差，S 是通过绘制校准曲线29、30 获得的直线斜率。估计检测极限（LOD），考虑3.3倍于标准差的空白，除以校准曲线29，30的斜率。

6. 组织等效可行性/功能

  1. Mtt
    1. 执行 MTT 测定，以评估 MPS 测定的所有时间点的器官生存能力。作为负控制，使用细胞介质加车辆。作为阳性对照，用100mM APAPAP和1%NaOH在细胞培养中稀释的器官进行治疗。
    2. 将每个复制的20个球体转移到96孔板中的单个孔中，细胞培养物插入24个孔细胞板，每孔放置一个肠道当量。用1x DPBS清洗组织等价物三次。
    3. 加入300μL的1mg/mL MTT溶液，在各自的细胞介质中稀释，每井。在标准细胞培养条件下孵育板3小时。
    4. 通过移液仔细从每一个井中去除 MTT 溶液。在4°C下，使用每口200μL的异丙醇从肠道和肝脏当量中提取MTT formazan。
      注:密封盖子以防止蒸发。
    5. 将每个上一液的 200 μL 转移到 96 井微测试板中各自的预识别井。使用异丙醇作为空白。
    6. 在 570 nm 的板读卡器中读取前坦吸收。计算单元格减少 MTT 的相对能力 （%）使用每个时间点的平均光学密度，与负对相比，被认为是100%的细胞生存能力。
  2. 细胞化学/组织学
    1. 在室温下修复肠道和肝脏当量25分钟，在0.1 M磷酸盐盐缓冲液中使用4%（w/v）半成甲醛，pH 7.4。在PBS缓冲液中清洗器官5次，每次10分钟。用四甲苯胺甲胺甲胺-法洛丁或亚历克萨氟647 phaloidin染色肠道和肝脏当量，PBS31中的1:50。
    2. 将它们转移到 OCT 冷冻介质几分钟，在 RT 适应，然后将它们转移到液氮，直到完全冻结。使用低温恒温器进行约10-12 μm厚的肝球状切除。
    3. 使用 DAPI 在安装介质中安装组织部分。通过共和荧光显微镜检查它们。
    4. 固定后冷冻器官，根据既定协议进行色氧林和 eosin 染色。如上文所述，在切片组织后，用安装介质安装幻灯片，并使用光学显微镜拍摄组织学图像。
  3. 高含量分析
    1. 细胞的线粒体和核染色
      1. 在 DMSO 中重组冻干粉末，以制造 1 mM 线粒体染色库存溶液（例如，MitoTracker 深红色调频）。将等分库存溶液储存在-20°C，防止光线。在没有血清的预战 （37 °C） 组织培养基中，将 1 mM 线粒染色存量溶液稀释至最终浓度 （200 nM）。
      2. 删除单元格培养媒体。加入线粒体染色溶液，在37°C的加湿大气中用5%的CO2完全覆盖样品和孵育细胞15-45分钟。
      3. 小心地去除线粒体染色工作溶液，并在室温下用PBS中的2-4%甲醛固定液更换15分钟。
      4. 用 PBS 轻轻冲洗固定单元格 5 分钟。重复洗涤过程两次。
      5. 在10 mL超纯水中溶解100毫克的 Hoechst 33342 染料，准备 10 mg/mL （16.23 M） 核酸染色库存溶液。
        注:库存溶液应等分，并储存在-20°C下不受光线。
      6. 在PBS中制备0.2-2.0μg/mL核酸染色工作溶液，并在室温下用核酸染色工作溶液孵育固定细胞10分钟。
      7. 去除核酸染色工作溶液，用PBS轻轻冲洗细胞3分钟。细胞应保存在4°C的PBS中，防止光线。
    2. 线粒体和核染色分析
      1. 使用荧光显微镜分析细胞，使用适用于核酸污渍（+Ex/μEm:361/497 nm）和线粒体污渍（+Ex/+μEm:644/665 nm）的过滤组。通过核酸阳性染色和量化细胞数来查找细胞。量化线粒体染色荧光强度线粒体。
  4. 图像J 中的变形测量（球体计算）
    1. 从哥伦布软件将高内容分析 （HCA） 图像导出为 *.flex 文件。使用 Bio 格式插件32将 .flex 文件作为灰度作为图像 J 使用: 文件 > 导入 > 生物格式。
    2. 在" 导入选项" 窗口中，选择 "超堆栈查看 "，并在 "拆分为单独的 窗口"下启用拆分通道。此选项将允许访问特定通道中的所有文件（例如，DAPI、线跟踪器等）。不要选择在 内存管理下使用 虚拟堆栈。
      注:最好在图像中使用 DAPI 通道作为"灰尘"，因为培养基在 UV 波长中会降低（例如，405 nm）。
    3. 如果像素大小未根据 .flex 文件中的嵌入值加载，则调整像素大小 （分析 > 设置比例）。应用高斯模糊滤镜以消除过多的杂色，避免形状轮廓的不规则。过程 > 过滤器 > 高斯模糊.2.0 和 3.0 之间的西格玛（半径）值是大多数情况的理想。如果堆栈有多个图像，请应用于所有图像（选择"进程堆栈"窗口中的"是"）。
    4. 使用阈值生成二进制图像以分隔背景和器官（对象）。单击图像 > 调整 > 阈值。使用红色蒙版根据图像的强度调整值，以适合器官形状，保持形态完好无损。如果图像具有白色背景，请禁用"深色背景"。单击"应用"。
    5. 在"将堆栈转换为二进制"窗口中，选择阈值方法。通常，在此类图像处理中，默认或三角形是首选。保持背景为黑暗。如果堆栈中存在多个图像，请选择计算每个图像的阈值。
    6. 选择 "过程">二进制 > 填充孔。可选，从背景中去除孔。在 "处理>二进制"> 选项s 中， 选择黑色背景 并再次 执行填充 孔。在 继续 下一步之前，请禁用黑色背景选项。
    7. 单独的对象。对于有机体，分水岭法是一个不错的选择。单击 "进程">二进制 > 分水岭。执行形状分析。
      1. 选择"分析>设置测量值"。有几个选项可用（详细信息https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html）。对于器官，选择"面积"，"平均灰色值"，"最小和最大值"灰色值和形状描述符。选择"显示"标签以标识图像和科学表示法中的对象。单击"确定"。
      2. 选择 分析 > 分析粒子。选择 "大小 " 和"循环" 限制。分别保留 0 无穷大和 0.00-1.00 以测量图像中的所有对象。在 "显示" 中，选择 "大纲"，以便识别对象。启用 显示结果 以输出结果; 在边上排除 以排除接触边框的对象; 包括孔 ，以便对象中最终的内部孔被视为主形状的一部分。
    8. 对 每个图像 堆栈重复形状分析，结果将追加到单个表中。将结果表导出 到文件 > 保存 .csv为...
  5. 实时 PCR
    1. 按照制造商的指示，使用苯酚和瓜尼丁同位素的单相溶液从组织等价物中提取RNA。
    2. 通过逆转录1~2μg的总RNA进行cDNA合成。
    3. 使用基因特异性底向量（表5）放大所有靶点，以执行实时定量PCR.每个 qRT-PCR 包含 30 ng 的反向转录 RNA 和每个底转的 100 nM。
    4. 遵循 PCR 条件:50°C 3 分钟（1 个周期）;95 °C，5分钟（1次）;95 °C 30 秒，59 °C 45 秒，72 °C 45 秒（35 - 40 次循环）。
  6. CYP 测定
    1. 遵循第 2.2 节进行肝脏 2-OC 组装。实验组为无细胞控制、APAP 2 μM 12小时、24小时和车辆控制。遵循第 3.3 节和 4.2 节，进行 APAP 2 μM 制备和治疗。
      注:为确保所有样品同时准备好进行CYP检测，在开始24小时治疗后12小时开始12小时治疗。使用 0.5% 乙醇溶液处理 CYP 活性无细胞控制，以及车辆控制。
    2. 在室温下解冻 3 mM 致发光基板库存溶液，并在 William 的 E S. 中进行 1:1000 稀释，防止光线。
    3. 收集球体，将每个实验组转移到96井板的井中。拆下介质，用 100 μL 的 1x DPBS 洗涤两次，每井加入 80 μL 的 3 μM 基板溶液。将无细胞控制留在威廉的 E S 介质中。保存一个没有球体或基板溶液的井，用于背景控制。在37°C下孵育30-60分钟，用5%CO2，防止光线。
    4. 使用带酯酶的重组缓冲液平衡冻干路西林检测试剂 （LDR）。通过旋转或反转混合。将被处理的体积存放在室温下，直到下一步。
      注:重组后的LDR可储存在室温下24小时或4°C1周，不丧失活动。对于长期存储，储存在+20°C。
    5. 孵育后，在白色不透明96孔微孔的三个不同孔中转移25μL完整球体的上清液。每井添加25μLLDR，均质化。
    6. 在室温下孵育白板20分钟。读取发光仪上的亮度。请勿使用荧光计。
    7. 通过从经过试验的化合物处理和未经处理的（车辆控制）值中减去背景发光值（无细胞控制）来计算净信号。通过将处理净值除以未经处理的净值并乘以 100 来计算 CYP3A4 活动的百分比变化。
  7. 西方印迹
    1. 将肝脏球状体转移到已识别的 1.5 mL 微管。拆下介质，用 100 μL 的 1x DPBS 洗涤两次。
    2. 在4°C下将肝脏球状体在100μL细胞裂解RIPA缓冲液中裂解20分钟。离心机 15 分钟、4 °C 和 11000 rpm。将上一液转移到另一个已识别的 1.5 mL 微管。
    3. 量化通过布拉德福德方法获得的蛋白质量。从梯度聚丙烯酰胺凝胶每井的10至50μg蛋白质中加载10至50μg的蛋白质，并执行SDS-PAGE。
    4. 通过半干燥系统设备将加载的蛋白质从凝胶转移到 0.22 μm PVDF 膜。使用 50 mM Tris-HCl 和 192 mM 甘氨酸的转移溶液。根据要转移的凝胶数量（一次 1 到 2）设置设备参数。
    5. 在TBS-T缓冲液中用3-5%脱脂牛奶溶液阻断PVDF膜上的非特异性相互作用:三叶酸盐（50 mM Tris pH 7.6，150 mM 氯化钠）辅以Tween 20的0.1%。在室温下，保持膜在轻轻恒定的摇动下1小时。
    6. 在室温下轻轻持续摇动 3-5 分钟，用 TBS-T 清洗。重复此洗涤步骤两次。
    7. 在TBS-T上分别稀释白化素和文古林原抗体1:1000和1:2000。在4°C下，在轻轻不断的摇动下，用原抗体孵育膜过夜。
      注:始终按照制造商的指示稀释抗体。
    8. 去除原抗体并洗膜3次（步骤6.7.6）。稀释ECL抗小鼠IgG二级抗体至1:5000对TBS-T。在室温下轻轻持续摇动下，用二次抗体孵育膜2小时。
    9. 去除二次抗体并清洗膜（步骤6.7.6）。使用 ECL 西样板基物进行蛋白质检测。暴露自动放射胶片 30 秒至 30 分钟。在三钙中执行免疫印迹检测。

结果

要在 2-OC MPS 中执行 PK APAP 测试，第一步是制造人肠和肝脏等价物（器官）。在开始PKAPAP检测之前，它们被集成到2-OC微流体装置（图1A）24小时。第二天，介质被更改，模型将暴露在 APAP。图 1显示了放置在 2-OC 设备（图1B）和APAP PK 实验时间过程（图1C）内的肠道和肝脏等价物。我们在 2D 培养物和 3D 器官中进?...

讨论

准确、可靠地评估研究性新药的药理特性，对于降低以下开发步骤的风险至关重要。MPS 是一项相对较新的技术，旨在提高预测能力，减少临床前测试的成本和时间。我们的团队正在推进对铅优化所需的药代动力学和毒理学特性的评估。我们与2-OC微流体装置合作，该装置有两个腔室，允许两个器官的整合。APAP之所以被选中，是因为它拥有大量高质量的人类数据，大部分是肝脏代谢的，并且也表现?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们感谢克里斯蒂·古根-吉卢佐博士、INSERM 522单元的菲利普·格里邦博士和271 INSERM单元的克里斯蒂安·特雷波博士使用生物材料（Hepa RG细胞），并随后提供给我们进行学术研究。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1x DPBSThermo Fisher Scientific14190235No calcium, no magnesium
2-OCTissUse GmbHTwo-organ chip
384-well Spheroid MicroplateCorning3830Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% ParaformaldehydeUse to fix cell
AcetaminophenSigma AldrichA7085Use to MPS assays
AcetonitrileTediaUsed to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidinThermo Fisher Scientificconfocal experiment
Ammonium acetateSigma AldrichUsed to perform HPLC
Caco-2 cellsSigma Aldrich86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasksSarstedt
Confocal Fluorescence microscopeLeicaDMI6000
CryostatLeicaCM1950
DMEM high glucoseThermo Fisher Scientific12800017Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSOSigma AldrichD4540Add 2% to HepaRG media
EthanolSynth
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific12657029
Freezing medium OCTTissue-TekTissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cellsBiopredic InternationalHPR101Undifferentiated cells
HHSTeCScienCell Research Laboratories5300Cells and all culture supplements
Hoechst 33342HCA experiments
HT-29 cellsSigma Aldrich85061109
Human InsulinInvitrogen - Thermo Fisher Scientific12585014
HydrocortisoneSigma AldrichH0888
IsopropanolMerck278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamineThermo Fisher ScientificA2916801
Luna C18 guard column SSPhenomenexUsed to perform HPLC
MicroscopeLeicaDMi4000
MicrotomeLeicaRM2245
Millicell 0.4 µm pore size insertsMerckPIHP01250
Millicell ERS-2 meterMerckMERS00002Used to TEER measurement
MitoTracker Deep RedHCA experiments
MTTThermo Fisher ScientificM6494
MX3000P systemAgilent Technologies
Neubauer chamberCounting cells
Operetta High Content Imaging SystemPerkin ElmerUsed to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPAPromegaCat.# V9001
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15070063Cell culture
PermountThermo Fisher ScientificHistology
PrimersRT-qPCR
PVDF membraneBioRad
PVDF Syringe filter0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 columnPhenomenexUsed to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax)IKA Works GmbH & Co2819000Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM)ScienCell5301Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse TranscriptaseThermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific
TRizol TM reagentThermo Fisher ScientificTrizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solutionThermo Fisher ScientificR001100
Ultra-low-attachment platesCorningCLS3471-24EA6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well MicroplatePerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams EPan BiotechP04-29510Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

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