小鼠肝脏中细胞类型特异性基因表达分析

摘要

翻译核糖体亲和性纯化（TRAP）可实现细胞类型特异性翻译mRNA的快速和高效分离。在这里，我们演示了一种将水动力尾静脉注射与肝脏再填充小鼠模型和TRAP相结合的方法，以检查重新填充肝细胞的表达特征。

摘要

受伤后肝脏重新填充是哺乳动物的一个关键特征，它可以防止在接触环境毒素后立即导致器官衰竭和死亡。更深入地了解重放期间发生的基因表达变化，有助于确定治疗目标，促进损伤环境中肝功能的恢复。然而，由于缺乏细胞标记、细胞数量有限以及这些细胞的脆弱性，特别分离重新造血肝细胞的方法受到抑制。^结合Fah-/-小鼠模型，在肝损伤设置中重述再填充，使核糖体亲和纯化（TRAP）技术得以转化，从而允许重新填充的基因表达分析肝 细胞。使用TRAP，细胞类型特异性翻译mRNA被快速有效地分离。我们开发了一种方法，利用TRAP与基于亲和力的分离，从肝细胞翻译mRNA，选择性地表达绿色荧光蛋白（GFP）标记核糖体蛋白（RP），GFP:RPL10A。TRAP 绕用荧光激活细胞分类所需的长时间，可改变基因表达轮廓。此外，由于只有重新填充的肝细胞表达GFP:RPL10A融合蛋白，分离的mRNA没有来自周围受伤的肝细胞和肝脏中其他细胞类型的污染。亲和力纯化的mRNA是高质量的，允许下游PCR或高通量测序基于基因表达的分析。

引言

肝脏作为脊椎动物的主要代谢器官，负责葡萄糖平衡、血清蛋白合成、胆汁酸分泌、异种生物代谢和排毒。肝脏具有非凡的能力，在接触毒素时再生受伤的帕伦奇马，以防止立即肝^衰竭1。然而，再生失败可能发生在对乙酰氨基酚或酒精过量消费的设置，这可能导致急性肝^衰竭2。此外，病毒性肝炎感染、脂肪肝、脂肪性肝炎引起的慢性肝损伤可引起肝纤维化、肝硬化、肝细胞^癌3。治疗终末期肝病的唯一治疗方法是移植，但受器官短缺的限制，无法对所有患者进行有效^治疗。因此，更好地了解毒性肝损伤后的恢复过程对于开发治疗以刺激足以挽救患病器官功能的再生至关重要。

肝再生研究应用最广的模型系统是啮齿动物的局部肝切除术，其中大部分肝脏被切除以刺激肝细胞快速^扩张5。然而，部分肝切除术不重述肝细胞扩张后，毒性肝损伤，由于缺乏免疫细胞渗透和肝细胞坏死经常观察到在急性肝损伤设置在^人类6。一个更合适的系统来模拟这种形式的器官更新^是Fah-/-小鼠，它缺乏功能性紫甲酸氢酶（FAH）所需的适当的酪氨酸代谢，并开发严重的肝脏损伤，导致^死亡7。通过饮用水中的药物尼他酮治疗，这些小鼠可以无限期地保持健康状态。或者，FAH表达可以通过转基因递送到肝细胞的子集来恢复，在消除尼西酮8时，肝细胞将膨胀以重新填充^肝脏。

为了分析重新填充肝细胞的基因表达变化，需要一种工具，专门^分离Fah-/-小鼠中复制的肝细胞，而不受邻近受伤的肝细胞和其他细胞类型的污染。不幸的是，肝细胞的荧光辅助细胞分拣（FACS）很困难，因为（1）肝细胞再生的脆弱性导致肝灌注后恢复不良，（2）复制肝细胞的大小变化很大，使得隔离纯种群由FACS困难，和（3）从肝脏灌注到RNA分离的手术时间大于2小时，因此基因表达谱可能在采集样品之前发生重大人工^变化。

或者，表位标记核糖体的表达，专门在重新填充肝细胞允许快速分离积极翻译mRNA结合核糖体结合在器官收获后立即亲和纯化，与散装肝脏组织莱沙。在这里，我们描述了一个协议，以执行翻译核糖体亲和纯化（TRAP）10，然后是高通量RNA测序（TRAP-seq），在Fah-/- 中特别分离和剖分mRNA，以重新填充肝^{细胞- /-}鼠标⁹.绿色荧光蛋白标记核糖体蛋白（GFP:RPL10A）与FAH的共聚体蛋白（GFP:RPL10A）与FAH的共聚体结合，允许通过含有GFP:RPL10A的聚体结合的翻译mRNA进行亲和纯化。这种方法避免了任何细胞分离步骤，如肝脏灌注，以分离脆弱的再生肝细胞。相反，它利用整个器官组织和抗体的解毒，快速从靶细胞中快速提取RNA。最后，通过TRAP-seq分离大量、高质量的mRNA，使测序分析等下游应用能够分析基因表达在再填充过程中的动态变化。

研究方案

所有涉及使用小鼠的方法都符合宾夕法尼亚大学宾夕法尼亚大学宾夕法尼亚大学动物福利办公室IACUC提供的指南。

1. 试剂制备

1. 赛克洛赫西米德
   1. 要使500μL为0.1克/mL环氧西米，在500μL甲醇中悬浮50毫克环己酰胺。
      警告:环己酰胺对环境毒性极强，可引起先天性畸形。所有含有环己酰胺的废物和缓冲液应收集，以便妥善处置。
      注:环己酰胺可在4°C下储存长达1天。环己酰胺抑制翻译。
2. 二硫二醇 （DTT）
   1. 要制造 1 m L 的 1 M DTT，在无 RNase 水中悬浮 0.15 g DTT 粉末。
      警告:DTT 可刺激皮肤、眼睛和呼吸道。
      注:DTT 是一种洗涤剂。DTT 可储存在-20°C。建议将 1 M DTT 存储在 50 μL 的一次性等分中。
3. 脱氧胆酸 （DOC）
   1. 要制作 10% DOC，在 50 mL 锥形管中悬浮 1 g DOC，并加入高达 10 mL 的无 RNase 水。大力摇动，直到粉末溶解。
      注:10% DOC 溶液略带黄色，可在室温 （RT） 下存储长达 1 年。DOC用于核莱沙。
4. GFP抗体
   1. 首次使用时，应有同分 GFP 抗体。捕捉冻结等分，并储存在-80°C。
      注:建议将50μgGFP抗体储存在一次性等分中。
5. B 生物酸酯蛋白 L
   1. 在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中重新悬浮生物素化蛋白L，使最终浓度为1μg/μL。
      注:悬浮溶液可在-20°C下储存长达6个月。

2. 缓冲液制备

1. 牛血清白蛋白 （BSA） 缓冲液
   1. 要制造 50 mL 的 3% BSA 缓冲液，将 1.5 g IgG 和无蛋白酶的 BSA 粉末加入 40 mL 的 PBS 中，然后加入涡旋。BSA 溶解后，将 PBS 添加到 50 mL 的最终体积中。
      注:BSA 缓冲液可在 4°C 下存储长达六个月。
2. 解剖缓冲区
   1. 要制造50 mL的解剖缓冲液，将 5 mL 的 10x 汉克平衡盐溶液 （HBSS）、125 μL 的 1 M 4-（2-羟基）-1-烟碱硫酸 （HEPES），1，750 μL 的 1 M 葡萄糖，以及 200 μL 的 1 M NaHCO₃。将无RNase水添加到50 mL的最终体积中。
      注:解剖缓冲液可储存在4°C下长达6个月。
   2. 在使用前，加入100微克/mL的0.1克/mL环氧西米，并保持在冰上。
3. 高盐缓冲液
   1. 要生产50 mL的高盐缓冲液，在无RNase水中加入1 mL的1M HEPES、8.75 mL的2M KCl、500 μL的1M MgCl₂和500μL的100%非基苯基聚乙烯乙二醇（材料表）。
      注:高盐缓冲液可在4°C下储存长达6个月。
   2. 在使用前，添加 0.5 μL/mL 的 1 M DTT 和 1 μL/mL 0.1 g/mL 环氧西米。将新鲜的高盐缓冲液放在冰上。
4. 低盐缓冲液
   1. 要制造50毫升的低盐缓冲液，在44.25ml无RNase水中加入1mL，2M KCl3，500μL1MMgCl2，500μL100%非基苯基聚乙烯乙二醇。
      注:低盐缓冲液可在4°C下储存长达6个月。
   2. 在使用前加入0.5 μL/mL的1M DTT和0.1 g/mL环氧西米1μL/mL。将新鲜的低盐缓冲液放在冰上。
5. 组织莱沙缓冲液
   1. 要制造50 mL的组织莱沙缓冲液，结合 1 mL 的 1 M HEPES、3.75 mL 的 2 M KCl 和 500 μL 的 1 M MgCl₂。将无RNase水添加到 50 mL 的决赛中。
      注:解剖缓冲液可储存在4°C下长达6个月。
   2. 加入1片/10 mL的EDTA无蛋白酶抑制剂，1 μL/mL 0.1 g/mL环氧西米，10μL/mL的RNase抑制剂，每次使用前。将新鲜的组织莱沙缓冲液保存在冰上。

3. 抗体与磁珠的偶联

1. 抗体
   1. 计算所有样品所需的GFP抗体量，并准备一个额外的样品。
      注:对于每个样品，每个GFP抗体需要50μg。
   2. 在4°C下解冻冰上的GFP抗体，以最大速度（>13，000 x g）旋转10分钟，并将上生子转移到新的微离心管中。
      注:抗体制备步骤可在珠子制备前执行，解冻的抗体可保存在冰上。或者，此部分可在磁珠和生物异化蛋白 L 的孵育过程中进行。
2. 重新悬浮磁珠
   1. 通过温和的移液重新悬浮磁珠 （材料表）.
   2. 对于每个样品，使用 150 μL 的磁珠。计算所有样品所需的磁珠体积，并额外准备一个磁珠。将重新悬浮的磁珠转移到 1.5 mL 或 2 mL 微离心管中。如果实验需要超过 1 mL，则将总金额拆分为相等的卷。
   3. 在磁性支架上收集珠子，超过 1 分钟，然后取出上清液。从磁性支架上取下微离心管，加入 1 mL 的 PBS，然后上下移液以清洗珠子。在磁性支架上收集珠子，等待 >1 分钟并取出 PBS。
3. 蛋白质L涂层珠子的制备
   1. 对于每个样品，使用60μL的生物酸酯蛋白L。如果蛋白质L先前被重新悬浮并储存在-20°C，解冻蛋白L在冰上。如果在使用前重新暂停蛋白质L，请服用所有样品所需的量，并额外准备一个。
   2. 将生物酸酯蛋白L的计算量添加到重新悬浮和洗涤的磁珠中。如果使用 1.5 mL 微离心管，则添加 1x PBS 以产生最终体积 1 mL;如果使用 2 mL 微离心管，则添加 1.5 mL。在管旋转器上用生物素化蛋白L在RT孵育磁珠35分钟。
      注:当珠子用生物异化蛋白L孵育时，可以在此步骤中制备抗体。
   3. 在磁性支架上收集蛋白质 L 涂层珠子，超过 1 分钟，并去除上清液。从磁性支架上取下微离心管，加入 1 mL 的 3% BSA 缓冲液，然后轻轻移液至少 5 次，以洗洗蛋白质 L 涂层珠子。
   4. 在磁性支架上收集涂层珠子，超过 1 分钟，并去除上清液。用 3% BSA 重复洗涤步骤 4 次（共 5 次）。
4. 抗体结合
   1. 将计算出的GFP抗体量加入蛋白质L涂层珠中，在4°C下在管旋转器上孵育1小时。
      注:抗体孵育后，特别注意不要涡旋亲和基质。
   2. 在孵育期间，通过计算所有样品所需的总体积来制备低盐缓冲液，并在使用前将0.5 μL/mL的1 M DTT和1μL/mL的0.1克/mL环氧西米添加到低盐缓冲液中。
      注:需要3 mL的低盐缓冲液，用于清洗每管GFP偶联珠子，200μL/样品用于重新悬浮GFP偶联珠。新鲜的低盐缓冲液可以在冰上保存几个小时。
   3. 在磁性支架上收集亲和矩阵，超过 1 分钟并去除上清液。加入1 mL的低盐缓冲液，上下轻轻移液，以洗净亲和力基质。在磁性支架上收集亲和矩阵，超过 1 分钟，并去除低盐缓冲液。用低盐缓冲液重复洗涤步骤2次（共3次）。
   4. 在低盐缓冲液中重新悬浮珠子，使每个样品具有200μL的亲和性基质。
      注:亲和性基质可在4°C下储存在0.02%NaN₃中长达2周。亲和性基质应在低盐缓冲液中快速洗涤3次，如果亲和基质在1周内制备，在4°C的管旋转器上轻轻悬浮至少10分钟，如果亲和基质储存超过1周，则通和性基质应在一夜之间制备。在此步骤后可以暂停该协议。
      警告:阿齐德钠对环境毒性极强。与酸接触会产生有毒气体。所有废物应收集，以便妥善处置。

4. 肝组织性莱沙

1. 缓冲器准备和设备设置
   1. 计算所需的微离心管数量，在冰上贴上标签和冷却。
      注:通常，每个样品需要7个1.5 mL微离心管:1个用于剩余的解剖肝脏，4个用于4mL的均质肝莱液，2个用于转移上生子。
   2. 通过计算所有样品所需的总体积，并准备新鲜的解剖缓冲液，并添加 1 μL/mL 0.1 g/mL 环氧西米。将新鲜的解剖缓冲液放在冰上，在整个实验过程中保持寒冷。
      注:对于每个样品，需要10 mL的解剖缓冲液。
   3. 通过计算所有样品所需的总体积来制备新的溶解液缓冲液，并分别添加 1 片/10 mL 无 EDA 蛋白酶抑制剂、1 μL/mL 0.1 g/mL 环氧西米和 10 μL/mL RNase 抑制剂。在整个实验过程中，将莱沙缓冲液保持在冰上。
      注:对于每个样品，需要4 mL的莱沙缓冲液。
   4. 设置组织磨床（材料表），使聚四氟乙烯（PTFE）玻璃管在肝片均质化期间可以放在冰上。将4 mL的冷液化缓冲液放入PTFE玻璃管中。
2. 再生肝均质化
   1. 根据批准的动物实验指南，将注射TRAP载体的8-12周大^{的Fah-/-小鼠}安乐死1⁄4周，进行麻醉和宫颈脱位。
   2. 将鼠标放在解剖板上，用 70% 乙醇喷洒腹部。用钳子将皮肤和腹膜低在腹部，并用剪刀进行横向切口。继续用剪刀切割，使一个宽的U形围肠皮瓣，小心不要切割内脏。将围膜皮瓣翻转到胸骨上，露出肝脏。
   3. 小心地用细剪刀和钳子取出肝脏，并迅速将组织放入冷解剖缓冲液中冲洗。要使冷冻组织均质化，快速将所需数量的肝脏组织移入PTFE玻璃管中，使用冷莱丝缓冲液，而不解冻组织。
      注:解剖组织在用解剖缓冲液洗涤后，可闪冻并储存在-80°C下。在此步骤后可以暂停该协议。
   4. 在培养皿上称量肝脏，分离出 200–500 毫克的肝片，然后进入 PTFE 玻璃管。将剩余的肝脏组织放入预冷却的微离心管中并闪状冷冻。
   5. 在电机驱动的均质器中，从 300 rpm 开始，使样品与肝脏结构分离，至少 5 次中风。每次降低玻璃管，但注意不要让虫子上升到溶液上方，以防止可能导致蛋白质变性的曝气。
   6. 将速度提高到 900 rpm，使肝脏组织完全均匀化至少 12 次完全行程。
   7. 将莱沙转移到贴有标签和预冷却的管中，每 1.5 mL 微离心管的莱沙度不超过 1 mL。如果使用 4 mL 的莱沙缓冲液，请保留 1 管并闪烁冻结剩余的 3 管。
      注:在解剖下一种动物并准备新鲜分解物时，这些分解物可以在冰上保存长达 1 小时。均质肝脏在分片后可闪冻，并储存在-80°C。如果使用冷冻的酸度，分离RNA可能会减少50%。在此步骤后可以暂停该协议。
3. 核莱沙
   1. 在4°C下将肝脏分瓶在2，000 x g下离心10分钟，并将上清液转移到冰上新的预冷却微离心管中。
   2. 加入10%非基苯基聚乙烯乙二醇的上清体积的1/9，使最终浓度为1%非基苯基聚乙烯乙二醇，并通过轻轻反转微离心管进行混合。
   3. 快速旋转微离心管，加入10%DOC样品体积的1/9，使最终浓度达到1%DOC，并通过轻轻反转微离心管进行混合。快速旋转微离心管，在冰上孵育5分钟。
   4. 在4°C下将核液在20，000 x g下离心10分钟，并将上清液转移到冰上新的预冷却微离心管中。
      注:线粒体耗尽的上清液可以在冰上放置几个小时，同时收集剩余的样本。

5. 免疫沉淀

1. 对于每个管，拿出上清液总量的1%作为免疫前沉淀控制，以比较孵育后的目标富集与亲和基质。在4°C的管转盘器上放置免疫前沉淀控制，就像免疫沉淀样品的处理一样。
2. 在每个样品中添加 200 μL 的亲和性基质。在将亲和性基质添加到每个样品之前，请特别注意通过温和的移液重新悬浮珠子。在4°C过夜，用亲和基质孵育解物，在管旋转器上温和混合。
   注:在此步骤之后，协议可以暂停一天。

6. RNA分离

1. 缓冲器准备和设备设置
   1. 将磁性机架置于 4°C 下至少 30 分钟，以预冷，并在整个实验过程中将磁架保持在冰上。
   2. 计算所需的微离心管数量，并在冰上或 4°C 时预冷。
      注:通常，每个样品需要1个微离心管作为最终纯化的RNA。
   3. 从步骤5.2快速旋转管子，在磁性机架上放置至少1分钟，收集珠子。
      注:收集的上清液含有未结合的馏分，可以闪冻结并储存在-80°C，与纯化后转录浓缩的带位分数进行比较。在此步骤后可以暂停该协议。
   4. 在高盐缓冲液中加入0.5 μL/mL的1 M DTT和1μL/mL 0.1 g/mL环氧西米，制备高盐缓冲液。
      注:对于每个样品，需要5mL的高盐缓冲液。
2. RNA分离
   1. 在每个管中加入1 mL的新鲜高盐缓冲液，然后轻轻移液至少5次，而不会引入气泡。
      注:洗涤不足会引入未绑定的转录本的背景，而气泡的引入可能会加速RNA降解。
   2. 在磁性支架上收集珠子，超过 1 分钟，然后取出上清液。用高盐缓冲液重复洗涤步骤4次（共5次）。
   3. 取出剩余的高盐缓冲液，从磁性支架上取出微离心管，并在 RT 处放置 5 分钟以预热。
   4. 用β-美尔卡托乙醇在100μL的赖糖缓冲液中重新悬浮珠子（在RNA分离试剂盒中提供）。
      注:任何含有脱硝性瓜尼丁三洋酸的RNA分离和纯化试剂盒都可以用作莱沙缓冲液，从亲和基质中释放结合的RNA。RNA提取应在RT处理，因为瓜尼丁三洋酸酯可以在低温下结晶。
   5. 以最高速度将珠子和缓冲液涡旋至少5秒，快速向下旋转以收集微离心管一侧的缓冲液，并在RT处用缓冲液孵育珠子10分钟，将珠约束RNA释放到解液缓冲液中。
   6. 在磁性支架上收集珠子超过1分钟，并收集上清液，按照试剂盒（材料表）中指定的RNA纯化方案立即进行RNA清理。
      注:在溶酶缓冲液中含有洗脱RNA的上清液也可以储存在-80°C长达1个月，然后通过解冻时加热到RT进行清理。
   7. 要实现分离RNA的最大质量，执行所有可选步骤，包括DNase消化和所有RNA洗脱步骤。将RNA分离试剂盒或无RNase水提供的洗脱缓冲液加热至60°C，以实现最大的RNA恢复。
      注:分离的RNA可在-20°C下储存长达1个月或-80°C数年。在此步骤后可以暂停该协议。

7. 可选RNA质量分析（推荐）

1. 使用生物分析仪¹¹评估 RNA 质量，并使用分光光度计¹²评估 RNA 质量，以确定是否需要重复免疫沉淀过程才能获得充足和高质量的 RNA。
   注:高通量测序的最佳RNA质量应遵循库制备试剂盒和测序平台指定的协议。

8. 下游应用

注:TRAP协议分离的总RNA可用于许多标准下游应用，包括RNA-seq（TRAP-seq）。标准逆转录和定量PCR协议也可在TRAP之后使用。

1. 对于TRAP-seq，按照标准^方法13执行RNA-seq库制备。
2. 对于RNA-seq，使用商用RNA-seq试剂盒制备cDNA测序库，其基寡聚物聚物（T）基浓缩。或者，如果总RNA质量低于推荐用于聚（A）浓缩，则使用rRNA耗尽模块。然而，预计在测序后会看到更多的rRNA对齐。

结果

为了在重新^填充Fah-/-小鼠的肝细胞中分析基因表达，Gfp:Rpl10a融合和法赫转基因在含有质粒的转位^子8（TRAP载体）中共同传递到肝脏，流体动力学注射 （图 1A）去除尼西酮诱导毒性肝损伤，为肝细胞产生选择压力，使其能稳稳地表达FAH，以重新填充受伤的帕伦奇^马9。免疫荧?...

讨论

TRAP-seq是一种通过表位标记核糖体翻译mRNA的细胞类型特异性分离技术，它提供了FACS方法的替代方法，因为它规避了FACS⁹的时间要求等限制。相反，TRAP允许从散装组织中直接快速有效地分离RNA，帮助避免基因表达的任何改变。TRAP-seq特别适合用于重新填充Fah^-/-小鼠肝脏，因为去除尼西酮后的肝细胞扩张是细胞自主的，并且通过集成功能使肝细胞子集的基因表达分析?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated	DWK Life Sciences (Wheaton)	358007
Absolutely RNA Miniprep Kit	Agilent	400800
Anti-GFP antibodies	Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core	GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free	Jackson ImmunoResearch	001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836170001
Cycloheximide	Millipore Sigma	C7698
Deoxycholic acid, DOC	Millipore Sigma	D2510
D-Glucose, Dextrose	Fisher Scientific	D16
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	D9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Thermo Fisher Scientific	65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid	Fisher Scientific	FB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific	Thermo Fisher Scientific	AAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2	Millipore Sigma	M8266
Methanol	Fisher Scientific	A452
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	VV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module	New England BioLabs	E7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina	New England BioLabs	E7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630	Millipore Sigma	I8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated	Ambion	AM9932
Overhead Stirrer	DWK Life Sciences (Wheaton)	903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4	Ambion	AM9625
Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated	Thermo Fisher Scientific	29997
Potassium chloride, KCl	Millipore Sigma	P4504
RNA 6000 Pico Kit & Reagents	Agilent	5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Invitrogen	AM9780
RNasin Ribonuclease Inhibitors	Promega	N2515
Sodium azide, NaN3	Millipore Sigma	S2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3	Millipore Sigma	S6297
SUPERase·In RNase Inhibitor	Invitrogen	AM2694