JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מתרגם הריבוכמה אהדה הזיקה (מלכודת) מאפשר בידוד מהיר ויעיל של סוג תא ספציפי לתרגם mRNA. כאן, אנו מדגימים שיטה המשלבת הזרקת זנב הידרודינמי במודל העכבר של אוכלוסיית הכבד והמלכודת כדי לבחון את פרופיל הביטוי של אכלוס מחדש של hepatocytes.

Abstract

אוכלוסיית הכבד לאחר הפציעה היא תכונה קריטית של יונקים אשר מונע כשל איברים מיידיים ומוות לאחר חשיפת רעלים סביבתיים. הבנה עמוקה יותר של השינויים בביטוי הגנים המתרחשים במהלך האוכלוסיה יכולה לסייע בזיהוי מטרות טיפוליות כדי לקדם את שיקום תפקודי הכבד בקביעת הפציעות. עם זאת, שיטות לבודד במיוחד את האכלוס מחדש של hepatocytes מעוכבים על ידי חוסר של סמנים תא, מספרי תאים מוגבלים, ואת שבריאת התאים האלה. ההתפתחות של תרגום הריבוכמה הזיקה של טיהור (מלכודת ) הטכנולוגיהבשילוב עם פה-/- מודל העכבר כדי לשחזר את האוכלוסייה מחדש במסגרת של פגיעה בכבד מאפשר פרופיל ביטוי גנים של האכלוס מחדש הפטציטים. עם המלכודת, סוג תא ספציפי לתרגם mRNA הוא במהירות וביעילות מבודד. פיתחנו שיטה אשר משתמשת מלכודת עם אהדה מבוססת בידוד של תרגום mRNA מ hepatocytes כי באופן סלקטיבי לבטא את חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-מתויג חלבון ריבוזומבית (RP), GFP: RPL10A. ההשמנה מפעילה את פרק הזמן הארוך הנדרש למיון תאים המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית שיכולה לשנות את פרופיל ביטוי הגנים. יתר על כן, מאז רק האכלוס מחדש של hepatocytes לבטא GFP: RPL10A היתוך חלבון, mRNA המבודד הוא נטול זיהום של hepatocytes הפצועים שמסביב וסוגי תאים אחרים בכבד. MRNA מטוהר האהדה הוא באיכות גבוהה ומאפשר במורד הזרם PCR או התפוקה הגבוהה ניתוח מבוסס רצף של ביטוי גנים.

Introduction

כמו איבר חילוף החומרים העיקרי של בעלי חוליות, הכבד אחראי על הומאוסטזיס גלוקוז, סרום חלבון סינתזה, הפרשה חומצה מרה, ומטבוליזם xenoביוטי ודטוקסיפיקציה. הכבד בעל יכולת יוצאת דופן כדי לחדש את כימוכימה הפצועים בעת החשיפה לרעלים כדי למנוע כשל כבד מיידית1. עם זאת, כישלון של התחדשות יכול להתרחש בהגדרה של פרצטמול או אלכוהול צריכת יתר, אשר יכול להוביל לכשל כבד אקוטי2. יתר על כן, פגיעה בכבד כרונית נגרמת על ידי דלקת הפטיטיס ויראלי, מחלת כבד שומני, ו steatohepatitis יכול לגרום פיברוזיס בכבד, שחמת, ו סרטן hepatocellular3. הטיפול הרפואי היחיד הזמין עבור מחלת הכבד בשלב הסופי הוא השתלת אבל הוא מוגבל על ידי המחסור איברים, מניעת טיפול יעיל עבור כל המטופלים4. הבנה טובה יותר של תהליך ההחלמה לאחר פגיעה בכבד רעיל הוא אפוא חיוני לפיתוח של טיפולים לעורר התחדשות מספיק כדי להציל את תפקוד האיבר החולה.

המערכת הרחבה ביותר מודל שימושית לחקר התחדשות הכבד הוא כריתת המעי חלקית במכרסמים, שבו חלק גדול של הכבד הוא resected כדי לעורר הרחבת hepatectomy מהירה5. עם זאת, כריתת הפפאציט חלקית לא לכידה התרחבות hepatectomy בעקבות פגיעה בכבד רעיל בשל היעדר חדירת תאים חיסוניים ונמק תא hepatectomy נצפו לעתים קרובות בקביעת פציעה חמורה בכבד בבני אדם6. מערכת מתאימה יותר כדי לדגמן צורה זו של התחדשות איברים הוא פה -/- עכבר, אשר חסר פונקציונלי fumarylacetoacetate (אח) נדרש עבור חילוף החומרים הנכון טירולה, מפתחת נזק כבד חמור המוביל למוות7. עכברים אלה יכולים להישמר במצב בריא ללא הגבלה על ידי טיפול עם התרופה nitisinone במים השתייה. לחילופין, ביטוי פה יכול להיות משוחזר על ידי המסירה הטרנסגנטית לקבוצת משנה של hepatocytes, אשר תרחיב לאכלס את הכבד על ידי הסרת nitisinone8.

כדי לפרופיל את השינויים בביטוי הגנים של אכלוס מחדש של hepatocytes, כלי כדי לבודד באופן ספציפי שכפול hepatocytes ב-פה-/- עכבר ללא זיהום של hepatocytes השכןנפגע וסוגי תאים אחרים נדרש. למרבה הצער, מיון תאים בסיוע בלתי מבוקר (FACS) של hepatocytes הוא קשה מאז (1) שבריאת האכלוס מחדש של hepatocytes מוביל להחלמה ירודה לאחר הכבד פרזיה, (2) שכפול hepatocytes הם מאוד משתנה בגודל, עושה בידוד של אוכלוסייה טהורה על ידי facs קשה, ו (3) את זמן ההליך מתוך זלוף הכבד כדי בידוד RNA הוא גדול מ 2 h, ולכן פרופילי ביטוי גנים עשויים לעבור שינויים מלאכותיים משמעותי לפני שנרכשו דגימות9.

לחילופין, הביטוי של אפימוטים-מתויג הריבוזומים במיוחד באכלוס מחדש של hepatocytes מאפשר הבידוד המהיר של באופן פעיל בתרגום mRNA כרוך על ידי הריבוזומים באמצעות טיהור אהדה מיד לאחר הקציר איברים, עם כבד בתפזורת רקמות כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבצע תרגום-ריבוכמה אהדה הזיקה (מלכודת)10 ולאחריה תפוקה גבוהה RNA-רצף (השמנה-seq), כדי לבודד במיוחד פרופיל mrna באכלוס מחדש של hepatocytes ב- אח-/- עכבר9. Coexpression של חלבון פלורסנט ירוק-מתויג חלבון ריבוזומלי (GFP: RPL10A) עם פה מאפשר טיהור אהדה של תרגום mRNA כרוך על ידי פוליזומים המכילים GFP: RPL10A. שיטה זו מונעת כל שלבי הדיסוציאציה של התאים, כגון מיזוג כבד כדי לבודד את האכלוס מחדש של המופיציטים. במקום זאת, היא משתמשת הליזה של רקמת איברים שלמים ונוגדנים לחלץ במהירות RNA במיוחד מתאי היעד. בסופו של דבר, בידוד שופע של mRNA באיכות גבוהה באמצעות השמנה-seq מאפשר יישומים במורד הזרם כגון ניתוח רצף לפרופיל השינוי הדינאמי של ביטוי הגנים במהלך תהליך האכלוס מחדש.

Protocol

כל השיטות המערבות את השימוש בעכברים תואמים את ההנחיות המסופקות על ידי IACUC של משרד פן לרווחת בעלי חיים באוניברסיטת פנסילבניה.

1. הכנה מגיב

  1. ציקלוהexiמיד
    1. כדי להפוך 500 μL של 0.1 g/mL cycloheximide להשעות 50 mg של cycloheximide ב 500 μL של מתנול.
      זהירות: הציקלוחלמיד היא רעילה מאוד לסביבה ויכולה לגרום למום מולד. כל פסולת ומאגרים המכילים cycloheximide יש לאסוף לסילוק נאות.
      הערה: המלון יכול להיות מאוחסן ב -4 ° c עד יום אחד. . Cycloheximide מעכב תרגום
  2. דיתיוטרטינול (DTT)
    1. כדי להפוך 1 מ ל של 1 מ DTT, להשעות 0.15 g של אבקת DTT ב RNase-מים ללא תשלום.
      זהירות: DTT יכול לגרום לגירוי העור, העין, ודרכי הנשימה.
      הערה: . הוא מסיר כביסה ניתן לאחסן את DTT ב-20 ° c. מומלץ לאחסן 1 M DTT ב-שימוש יחיד מ50 μL.
  3. ביטול המרה (DOC)
    1. כדי להפוך 10% DOC, להשעות 1 g של DOC ב-50 mL בשפופרת חרוט ולהוסיף RNase-מים ללא תשלום עד 10 mL. לנער בחוזקה עד האבקה מומס.
      הערה: הפתרון של 10% DOC הוא מעט צהוב וניתן לאחסנו בטמפרטורת החדר (RT) עד לשנה אחת. . ד ר משמש לפירוק גרעיני
  4. נוגדנים
    1. . כשאתה משתמש בפעם הראשונה הקפא את ההקפאה ואחסן ב-80 ° c.
      הערה: מומלץ לאחסן 50 μg של נוגדנים GFP ב-ali, שימוש יחיד.
  5. חלבון ביולוגי L
    1. השעיית מחדש חלבון biotinylated L ב-1x פוספט באגירה מלוחים (PBS) כדי להפוך את הריכוז הסופי 1 μg/μL.
      הערה: ניתן לאחסן פתרון מחדש ב-20 ° c עד 6 חודשים.

2. הכנת מאגר

  1. מאגר (BSA) סרום שור
    1. כדי להפוך 50 mL של 3% BSA מאגר, להוסיף 1.5 g של IgG-ו פרוטאז חינם האבקה BSA לתוך 40 mL של PBS ואחריו מערבולת. לאחר התפרקה BSA, להוסיף PBS לנפח סופי של 50 mL.
      הערה: ניתן לאחסן את מאגר BSA ב-4 ° צ' עד שישה חודשים.
  2. מאגר חיתוך
    1. כדי להפוך 50 mL של מאגר לחיתוך מלאי, לשלב 5 מ ל של 10 x של האנק מאוזן תמיסת מלח (HBSS), 125 μL של 1 M 4-(2-הידרוקסיל) -1-piperazinefonic חומצה (HEPES), 1,750 μL של 1 מ ' גלוקוז, ו 200 μLשל 1 מ ' הוספת RNase-מים ללא תשלום לנפח הסופי של 50 mL.
      הערה: ניתן לאחסן את המניה במאגר החיתוך ב -4 ° c עד שישה חודשים.
    2. מיד לפני השימוש, להוסיף 100 μg/mL של 0.1 g/mL לשמור על קרח.
  3. מאגר מלח גבוה
    1. כדי להפוך 50 mL של מלאי מאגר המלח גבוהה, להוסיף 1 מ"ל של 1 M HEPES, 8.75 mL של 2 M KCl, 500 μL של 1 M MgCl2, ו500 μl של 100% פוליאתילן nonylphenyl גליקול (לוח חומרים) כדי rnase-מים חינם.
      הערה: ניתן לאחסן את המלאי במאגר הגבוה ב -4 ° c עד שישה חודשים.
    2. מייד לפני השימוש, להוסיף 0.5 μL/mL של 1 M DTT ו-1 μL/mL של 0.1 g/mL במהירות. . שמור את מאגר המלח הטרי על הקרח
  4. מאגר מלח נמוך
    1. כדי להפוך 50 mL של מלאי מלח מאגר נמוך, להוסיף 1 מ"ל של 1 M HEPES, 3.75 mL של 2 M KCl, 500 μL של 1 M MgCl2, ו500 μl של 100% פוליאתילן nonylphenyl גליקול ל 44.25 mL של מים חינם RNase.
      הערה: ניתן לאחסן את המלאי במאגר הנמוך ב -4 ° c עד שישה חודשים.
    2. הוסף 0.5 μL/mL של 1 M DTT ו-1 μL/mL של 0.1 g/mL לפני השימוש. שמור את מאגר המלח. הטרי והנמוך על הקרח
  5. מאגר פירוק רקמות
    1. כדי להפוך 50 mL של מאגר לפירוק רקמות, לשלב 1 mL של 1 M HEPES, 3.75 mL של 2 M KCl, ו 500 μL של 1 M MgCl2. הוספת RNase-מים ללא תשלום לגמר של 50 mL.
      הערה: ניתן לאחסן את המניה במאגר החיתוך ב -4 ° c עד שישה חודשים.
    2. הוסף 1 לוח/10 מ ל של מעכב פרוטאז EDTA חינם, 1 μL/mL של 0.1 g/mL cycloheximide 10 μL/mL של מעכבי RNase כל מייד לפני השימוש. שמור את מאגר לפירוק רקמות טרי על קרח.

3. הצמדה של נוגדנים לחרוזים מגנטיים

  1. נוגדנים
    1. חשב את כמות הנוגדנים של GFP הדרושים עבור כל הדגימות ולהתכונן למדגם נוסף אחד.
      הערה: עבור כל דוגמה, 50 μg של כל נוגדן GFP נדרש.
    2. הפשרת נוגדנים GFP על הקרח ספין במהירות מקסימלית (> 13000 x g) עבור 10 דקות ב 4 ° צ' והעברת supernatants לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
      הערה: שלב הכנת נוגדן ניתן לבצע לפני ההכנה חרוז ואת נוגדנים מופשרים ניתן לשמור על קרח. לחילופין, חלק זה יכול להתבצע במהלך דגירה של חרוז מגנטי וחלבון biotinylated L.
  2. השעיית חרוזים מגנטיים מחדש
    1. השעיה מחדש חרוזים מגנטיים (טבלת חומרים) על ידי ליטוף עדין.
    2. עבור כל דוגמה, השתמש ב-150 μL של חרוז מגנטי. חישוב הנפח של חרוז מגנטי נדרש עבור כל הדגימות ולהכין תוספת אחת. העבר את החרוזים מגנטי מחדש הושעה לצינור 1.5 mL או 2 מ"ל מיקרוצנטריפוגה. אם נדרשת יותר מ-1 mL עבור ניסוי, פצל את הסכום הכולל לאמצעי אחסון שווים.
    3. לאסוף חרוזים על מעמד מגנטי עבור > 1 דקות ולהסיר את supernatant. הסירו את צינורית המיקרוצנטריפוגה מהעמדה המגנטית והוסיפו 1 מ ל של PBS ואחריו ליטוף למעלה ולמטה כדי לשטוף את החרוזים. לאסוף חרוזים על מעמד מגנטי עבור > 1 דקות ולהסיר PBS.
  3. הכנת חרוזי חלבון מצופי L
    1. עבור כל דוגמה, השתמש ב-60 μL של חלבון biotinylated L. אם החלבון L מושהה בעבר ומאוחסן ב-20 ° c, הפשרת חלבון L על קרח. אם החלבון L מושעה לפני השימוש, לקחת את הסכום הנדרש עבור כל הדגימות ולהכין תוספת אחת.
    2. הוסף את הנפח המחושב של חלבון biotinylated L לחרוזים מגנטיים מחדש ושטופים. הוסף את ה-1x PBS כדי להפוך את אמצעי האחסון הסופי 1 mL אם באמצעות שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL, או 1.5 mL אם באמצעות שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 mL. מארג מגנטית חרוזים עם חלבון biotinylated L עבור 35 דקות ב-RT על מסובבי הצינור.
      הערה: ניתן להכין נוגדנים בשלב זה בעוד החרוזים מודגוניים עם חלבון biotinylated L.
    3. לאסוף את החלבונים מצופה L-חלבון על מעמד מגנטי עבור > 1 דקות ולהסיר את הסופרנטאנט. הסר את שפופרת המיקרוצנטריפוגה מהמגנטי והוסף 1 mL של 3% BSA במאגר ואחריו ליטוף בעדינות לפחות 5 פעמים כדי לשטוף את החלבון מצופה מחרוזת L.
    4. לאסוף חרוזים מצופה על מעמד מגנטי עבור > 1 דקות ולהסיר את הסופרנטאנט. חזור על שלבי הכביסה עם 3% BSA עבור 4 פעמים נוספות (סה כ 5 פעמים).
  4. כריכת נוגדנים
    1. הוסף את הכמות המחושבת של נוגדנים מבוססי GFP לתוך החלבון מצופה ה-L והדגירה של 1 h ב -4 ° c על מסובבי הצינור.
      הערה: לאחר דגירה הנוגדן, לנקוט טיפול מיוחד לא המערבולת מטריצה הזיקה.
    2. במהלך הדגירה, להכין מאגר המלח נמוך על ידי חישוב הנפח הכולל הנדרש עבור כל הדגימות ולהוסיף 0.5 μL/mL של 1 M DTT ו-1 μL/mL של 0.1 g/mL למניה נמוכה מלח מאגר לפני השימוש.
      הערה: 3 מ ל של מאגר מלח נמוך עבור כביסה כל שפופרת של חרוזים gfp מצוערות ו-200 μl/מדגם עבור השעיה של חרוזים gfp-מצוחים נדרש. ניתן לשמור על קרח. במשך כמה שעות
    3. לאסוף את מטריצת האהדה על מעמד מגנטי עבור > 1 דקות ולהסיר את הסופרנטאנט. הוסף 1 מ ל של מאגר מלח נמוך ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לשטוף את מטריצת הזיקה. לאסוף את מטריצת הזיקה על דוכן מגנטי עבור > 1 דקות ולהסיר מאגר מלח נמוך. חזור על שלבי הכביסה עם מאגר מלח נמוך במשך 2 פעמים (סה כ 3 פעמים).
    4. השהה מחדש את החרוזים במאגר של מלח נמוך, כך שכל מדגם כולל 200 μL של מטריצת זיקה.
      הערה: ניתן לאחסן את מטריצת הזיקה ב-0.02% נאן3 ב -4 ° c עד 2 שבועות. מטריצה האהדה יש לשטוף במהירות במאגר המלח הנמוך 3 פעמים ומושעה בעדינות על מסובבי הצינור ב 4 ° c עבור לפחות 10 דקות אם מטריצת הזיקה מוכן בתוך שבוע או לילה אם מטריצה הזיקה מאוחסן למעלה משבוע אחד. ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר שלב זה.
      זהירות: נתרן עזידה הוא רעיל מאוד לסביבה. . מגע עם חומצות מייצר גז רעיל כל פסולת יש לאסוף לסילוק נאות.

4. רקמת הכבד לליזה

  1. הכנה לחוצץ והתקנת ציוד
    1. לחשב את מספר הצינורות המיקרוצנטריפוגה הדרושים, התווית ולהירגע על הקרח.
      הערה: בדרך כלל, שבעה 1.5 mL שפופרות מיקרוצנטריפוגה נדרשים עבור כל מדגם: 1 עבור הכבד שנותר גזור, 4 עבור 4 מ ל של הומופוסט הכבד המוליך, ו 2 עבור העברת supernatants.
    2. הכן מאגר לחיתוך טרי על-ידי חישוב הנפח הכולל הנדרש עבור כל הדגימות ולהוסיף 1 μL/mL של 0.1 g/mL cycloheximide. מניחים את מאגר החיתוך הטרי על הקרח כדי לשמור על קור במהלך הניסוי.
      הערה: עבור כל דוגמה, 10 מ"ל של מאגר החיתוך נדרש.
    3. הכנת מאגר פירוק טרי על ידי חישוב הנפח הכולל הנדרש עבור כל הדגימות ולהוסיף 1 לוח/10 מ ל של מעכב פרוטאז EDTA חינם, 1 μL/mL של 0.1 g/mL cycloheximide ו 10 μL/mL של מעכבי RNase כל אחד. השאר את מאגר הליזה על קרח לאורך הניסוי.
      הערה: עבור כל דוגמה, יש צורך ב-4 mL של מאגר הליזה.
    4. הגדר את מטחנת הרקמה (טבלת חומרים), כך שצינוריות הזכוכית הפוליציטאואתילן יכולים להיות מונחים על הקרח במהלך הומוגון של חלקי הכבד. שים 4 מ ל של מאגר לפירוק קר בצינורות זכוכית.
  2. אכלוס מחדש של המגון כבד
    1. המתת חסד 8-12-שבוע- פהאחד-/- עכבר הוזרק עם וקטור המלכודת ואוכלס מחדש עבור 1-4 שבועות עם הרדמה ופריקה צוואר הרחם על פי אישור בעלי חיים הנחיות ניסיוני.
    2. מניחים את העכבר על לוח לנתיחה ולרסס את הבטן עם 70% אתנול. אוהל העור צפק נמוך בבטן באמצעות מלקחיים ולהשתמש במספריים לעשות חתך רוחבי. המשך לחתוך עם המספריים כדי ליצור כנף רחבה בצורת הצפק, ולדאוג שלא לחתוך את הוימעיים. הפוך את הכנף הצפק מעל עצם החזה כדי לחשוף את הכבד.
    3. בזהירות להסיר את הכבד באמצעות מספריים עדינים מלקחיים ובמהירות למקם את הרקמה במאגר לחיתוך קר לשטוף. כדי המגון לטפל ברקמות קפואות, במהירות להעביר את הכמות הרצויה של רקמת הכבד לתוך צינורות זכוכית עם מאגר פירוק קר מבלי להפוך את הרקמה.
      הערה: הרקמה הניתנת לחיתוך מוקפאת ומאוחסנת ב-80 ° c לאחר שהיא נשטפה באמצעות מאגר הניתוח. ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר שלב זה.
    4. שוקלים את הכבד על צלחת פטרי ובידוד 200-500 מ ג של חתיכות כבד ומעבר לצינורות הזכוכית. מניחים את רקמת הכבד הנותרים לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה מקורר והקפאת הבזק.
    5. המגון את הדגימות בתוך מנוע מונחה הומוגניד החל ב 300 rpm כדי לנתק hepatocytes ממבנה הכבד עבור לפחות 5 משיכות. הנמך את צינור הזכוכית בכל פעם, אבל לדאוג לא לתת את העלייה לעלות מעל הפתרון כדי למנוע את החלבון שיכול לגרום לדנטורציה חלבונים.
    6. להעלות את המהירות כדי 900 rpm כדי המגון מלא את רקמות הכבד עבור לפחות 12 משיכות מלאות.
    7. העבר את הליפוסט לתוך הצינורות המסומנים והטרום מקורר, עם לא יותר מ-1 מ ל של שפופרות ליפוסט ל1.5 mL מיקרוצנטריפוגה. אם 4 מ ל של מאגר הליזה משמש, לשמור על צינור 1 ו-flash להקפיא את הנותרים 3 צינורות.
      הערה: הlysates ניתן לשמור על הקרח עד 1 h כאשר מבתר את החיה הבאה והכנת lysates טריים. הכבד המהומוגניים יכול להיות פלאש קפוא לאחר שלב הפירוק ומאוחסן ב-80 ° c. יכול להיות ירידה של 50% ב-RNA בודד אם משתמשים ב-lysates קפואים. ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר שלב זה.
  3. פירוק גרעיני
    1. צנטריפוגה את הכבד מחדש ב 2,000 x g ב 4 ° c עבור 10 דקות ולהעביר את supernatant לצינור חדש, מיקרו מקורר מיקרוצנטריפוגה על הקרח.
    2. הוסף 1/9 של הנפח supernatant של 10% פוליאתילן nonylphenyl גליקול כדי להפוך את הריכוז הסופי 1% פוליאתילן nonylphenyl גליקול ולערבב על ידי היפוך בעדינות צינורות מיקרוצנטריפוגה.
    3. במהירות לסובב את הצינורות מיקרוצנטריפוגה ולהוסיף 1/9 של נפח לדוגמה של 10% DOC כדי להפוך את הריכוז הסופי 1% DOC ולערבב על ידי היפוך בעדינות צינורות מיקרוצנטריפוגה. במהירות לסובב את הצינורות מיקרוצנטריפוגה ו דגירה על הקרח עבור 5 דקות.
    4. צנטריפוגה את הגרעין הגרעיני ב 20,000 x g ב 4 ° c עבור 10 דקות ולהעביר את supernatant לצינור חדש, מיקרו מקורר מיקרוצנטריפוגה על הקרח.
      הערה: ניתן להניח את הסופרנטאנט המיטונטי בקרח במשך כמה שעות, בעוד הדגימות הנותרות נאספות.

5. Immunoprecipitation

  1. עבור כל צינור, להוציא 1% הנפח הכולל של supernatant כפקד pre-immunoprecipitation כדי להשוות העשרה היעד לאחר הדגירה עם המטריצה זיקה. מקם את הפקדים שלפני immunoprecipitation על מסובבי צינור ב-4 ° c לילה, באותה דרך שבה מעובדים הדגימות הimmunoprecipitated.
  2. הוסף 200 μL של מטריצת זיקה לכל דוגמה. שמור על מחדש את החרוזים על ידי ליטוף עדין לפני הוספת מטריצת הזיקה לכל מדגם. מודקת את lysates עם מטריצת אהדה ב 4 ° c לילה עם ערבוב עדין על מסובבי צינור.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול עד יום לאחר שלב זה.

6. בידוד רנ א

  1. הכנה לחוצץ והתקנת ציוד
    1. מניחים את המתלה המגנטי ב -4 ° c לפחות 30 דקות עד לפני הצינון ומחזיקים את המתלה על הקרח במהלך הניסוי.
    2. חשב את מספר הצינורות המיקרוצנטריפוגה הדרושים ומראש על הקרח או ב -4 ° c.
      הערה: בדרך כלל, כל דוגמה דורשת שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1 עבור רנ א מטוהרים הסופי.
    3. במהירות לסובב את הצינורות משלב 5.2 ולאסוף את החרוזים על ידי הצבת על המדף המגנטי לפחות 1 דקות. לאסוף או למחוק את סופרנטאנט בצינורות מיקרוצנטריפוגה נוספים.
      הערה: הסופרנט שנאסף המכיל שבר לא מאוגד יכול להיות מוקפא הבזק ומאוחסן ב-80 ° c כדי להשוות עם השבר המאוגד לצורך העשרה תעתיק לאחר הטיהור. ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר שלב זה.
    4. הכנת מאגר מלח גבוה על-ידי הוספת 0.5 μL/mL של 1 M DTT ו-1 μL/mL של 0.1 g/mL למניה גבוהה מאגר המלח.
      הערה: עבור כל דוגמה, 5 מ ל של מאגר המלח הגבוה נדרש.
  2. בידוד רנ א
    1. הוסף 1 מ ל של מאגר מלח גבוה טרי לכל צינור ואחריו ליטוף עדין לפחות 5 פעמים בלי להציג בועות.
      הערה: כביסה מספיק יכול להציג רקעים של תעתיקים לא מאוגדים בעוד המבוא של בועות יכול להאיץ השפלה RNA.
    2. לאסוף חרוזים על מעמד מגנטי עבור > 1 דקות ולהסיר את supernatant. חזור על שלבי הכביסה עם מאגר המלח הגבוה במשך 4 פעמים נוספות (סה כ 5 פעמים).
    3. להסיר מאגר המלח הנותר גבוה ולהסיר צינורות מיקרוצנטריפוגה מן המעמד המגנטי ומקום ב RT עבור 5 דקות להתחמם.
    4. השהה מחדש את החרוזים ב-100 μL של מאגר הליזה (המסופק בערכת בידוד RNA) עם β-mercaptoethanol.
      הערה: כל ה-RNA בידוד וערכת טיהור המכילה את הגונידיין guanidine thiocyanate יכול לשמש מאגר פירוק כדי לשחרר RNA מאוגד מן המטריצה זיקה. החילוץ RNA צריך להיות מעובד ב RT מאז guanidine thiocyanate יכול להתגבש בטמפרטורות נמוכות.
    5. וורטקס את החרוזים ואת המאגר עבור לפחות 5 s במהירות הגבוהה ביותר, במהירות ספין למטה כדי לאסוף את המאגר בצד של צינור מיקרוצנטריפוגה ו מודרט את החרוזים עם המאגר ב RT עבור 10 דקות כדי לשחרר את ה-RNA מאוגד חרוז לתוך מאגר הפירוק.
    6. לאסוף חרוזים על דוכן מגנטי עבור > 1 דקות ולאסוף את supernatant להמשיך מיד לניקוי RNA על פי פרוטוקול טיהור RNA כפי שצוין בערכה (טבלת חומרים).
      הערה: Supernatant המכיל את ה-RNA החומק במאגר הליזה יכול להיות גם מאוחסן ב-80 ° צ' עד 1 חודש לפני ניקוי על ידי חימום עד RT על הפשרה.
    7. כדי להשיג איכות מקסימלית של RNA מבודד, לבצע את כל השלבים האופציונליים כולל העיכול DNase ואת כל הצעדים הימנעות RNA. לחמם את מאגר להתחמק שסופקו על ידי ערכת בידוד RNA או RNase-מים ללא תשלום 60 ° c עבור התאוששות RNA מקסימלית.
      הערה: ה-RNA המבודד יכול להיות מאוחסן ב-20 ° c עד חודש או-80 ° c במשך מספר שנים. ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר שלב זה.

7. האפשרות ניתוח באיכות RNA (מומלץ)

  1. להעריך את איכות ה-RNA באמצעות bioanalyzer11 וכמות עם ספקטרוסקופיה12 כדי לקבוע אם חוזר התהליך immunoprecipitation נדרש כדי להשיג בשפע באיכות גבוהה RNA.
    הערה: איכות ה-RNA האופטימלית לרצפי התפוקה הגבוהה צריכה לעקוב אחר פרוטוקולים שנקבעו על-ידי ערכות הכנה לספריות ופלטפורמות רצף.

8. יישומים במורד הזרם

הערה: סך RNA מבודד על ידי פרוטוקול המלכודת ניתן להשתמש במספר יישומים סטנדרטיים במורד הזרם, כולל RNA-seq (השמנה-seq). ניתן להשתמש בתעתיק הפוך סטנדרטי ובפרוטוקולי PCR כמותיים גם בעקבות TRAP.

  1. עבור מלכודת seq, בצע הכנה של ספריית RNA-seq בהתאם לשיטות הסטנדרטיות13.
  2. עבור RNA-seq, להכין את הספריות ברצף cDNA באמצעות ערכות RNA-seq מסחריות עם העשרת מבוססי d (T)-מבוסס על העשרה של התעתיקים pvc (A). לחילופין, אם איכות ה-RNA הכוללת נמוכה יותר ממומלצת עבור העשרה פולי (A), השתמש במודולי מחסור rRNA. עם זאת, מצפה לראות יישור rRNA נוסף לאחר ברצף.

תוצאות

כדי לפרופיל ביטוי הגנים באכלוס מחדש של hepatocytes של פה -/- עכבר, gfp: Rpl10a fusion ו- פה transgenes מועברים בתוך הטרנספסון המכיל את הפלסטיק8 (וקטור המלכודת) לכבד על ידי הזרקת הידרודינמית(איור 1א). הסרת nitisinone גורמת לפציעה בכבד רעיל ש?...

Discussion

מלכודת seq היא טכניקה עבור סוג תא ספציפי בידוד של תרגום mRNA באמצעות אפיזומים מתויג ומציג חלופה לגישות FACS, כפי שהוא מוגבל מגבלות כגון דרישות הזמן של FACS9. במקום זאת, המלכודת מאפשרת בידוד מהיר ויעיל של RNA ישירות מרקמות בצובר, ומסייע למנוע כל שינוי בביטוי הגנים. מלכודת seq מתאימה במיוחד...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי המענקים הבאים: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), ו P30-DK050306 (פיילוט מענק KJW).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, CoatedDWK Life Sciences (Wheaton)358007
Absolutely RNA Miniprep KitAgilent400800
Anti-GFP antibodiesMemorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource CoreGFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-FreeJackson ImmunoResearch001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche11836170001
CycloheximideMillipore SigmaC7698
Deoxycholic acid, DOCMillipore SigmaD2510
D-Glucose, DextroseFisher ScientificD16
DL-DithiothreitolMillipore SigmaD9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Thermo Fisher Scientific65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear LidFisher ScientificFB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol redThermo Fisher Scientific14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo ScientificThermo Fisher ScientificAAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2 Millipore SigmaM8266
MethanolFisher ScientificA452
NanoDrop 2000/2000c SpectrophotometerThermo Fisher ScientificVV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation ModuleNew England BioLabsE7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for IlluminaNew England BioLabsE7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630Millipore SigmaI8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-TreatedAmbionAM9932
Overhead StirrerDWK Life Sciences (Wheaton)903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4AmbionAM9625
Pierce Recombinant Protein L, BiotinylatedThermo Fisher Scientific29997
Potassium chloride, KClMillipore SigmaP4504
RNA 6000 Pico Kit & ReagentsAgilent5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination SolutionInvitrogenAM9780
RNasin Ribonuclease InhibitorsPromegaN2515
Sodium azide, NaN3Millipore SigmaS2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3Millipore SigmaS6297
SUPERase·In RNase InhibitorInvitrogenAM2694

References

  1. Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
  2. Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
  3. Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
  4. Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).
  5. Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
  6. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).
  7. Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).
  8. Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).
  9. Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).
  10. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
  11. Agilent Technologies. . Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).
  12. NEBNext. . NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).
  13. NanoDrop. . 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).
  14. Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).
  15. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).
  16. Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. , (2019).
  17. Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. , (2019).
  18. Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
  19. Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).
  20. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).
  21. Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
  22. Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?. Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151seqRNA seqimmunoprecipitationhepatocyte

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved