JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里，我们提出一个协议，以评估主轴形成和线粒体进展的动态。我们的延时成像应用使用户能够识别线粒体不同阶段的细胞，跟踪和识别线粒体缺陷，并在接触抗线粒药物时分析主轴动力学和线粒细胞命运。

摘要

活细胞延时成像是细胞生物学中的重要工具，它提供了对细胞过程的洞察，否则这些细胞过程可能被固定细胞分析忽略、误解或误解。虽然固定细胞成像和分析是健壮的，足以观察细胞稳定状态，但它在定义细胞级事件的时间顺序时可能受到限制，并且无法评估动态过程的瞬态性质，包括线粒体进展。相反，活细胞成像是一种雄辩的工具，可用于观察细胞过程在单细胞水平随着时间的推移，并有能力捕捉过程的动态，否则在固定细胞成像中表现不佳。在这里，我们描述了一种生成带有荧光标记染色质和微管标记的细胞的方法，以及它们在活细胞成像方法中的使用，以监测元相染色体对齐和线粒出口。我们描述了基于成像的技术，以评估主轴形成和线粒进展的动态，包括识别线粒体不同阶段的细胞，识别和跟踪线粒缺陷，以及分析主轴动力学和使用线粒抑制剂治疗后的线粒细胞命运。

引言

基于图像的固定细胞分析通常用于评估细胞总体水平的变化，以响应各种扰动。当与细胞同步结合，然后采集和成像串行时间点时，这些方法可用于建议细胞事件序列。然而，固定细胞成像是有限的，因为时间关系是隐含在一个群体，而不是在单个细胞的水平证明。这样，虽然固定细胞成像和分析足以观察强健的表型和稳定状态变化，但检测随时间变化和仅影响细胞亚群的变化的能力并不完美。相反，活细胞成像是一个雄辩的工具，可用于观察单个细胞或细胞群中的细胞和亚细胞过程，随着时间的推移，无需辅助同步方法，这些方法本身可能会影响细胞行为1,2,3,4,5,6.

双相线轴的形成对于细胞分裂期间适当的染色体分离至关重要，从而产生两个基因相同的子细胞。线粒主轴结构的缺陷会破坏线粒体进展，并损害染色体分离的保真度，从而导致灾难性细胞分裂和细胞生存能力下降。因此，改变主轴形成的线粒体毒素是限制癌细胞7、8、9快速增殖的有希望的治疗方法。然而，在添加线粒毒物后，主轴结构的固定细胞分析在评估主轴形成的动态过程的能力方面受到限制，并且可能不能指示观察到的主轴结构变化是永久性的还是相反是暂时的，可以克服，以允许成功的细胞分裂。

在此协议中，我们描述了一种通过活细胞成像评估主轴扰动后线粒体动力学的方法。使用 hTERT 不朽的 RPE-1 细胞系，用于表达 RFP 标记的 Histone 2B 来可视化染色质，以及 EGFP 标记的 α-tubulin 来可视化微管、元相染色体对齐的时间、抗癫痫的发病，并最终线粒细胞的命运是使用染色体运动，压实和核形态的视觉线索评估。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

1. 生成 hTERT-RPE-1 细胞，可稳稳地表达 RFP-组蛋白 2B （RFP-H2B） 和 β-图布林-EGFP （tub-EGFP）

注:所有步骤均采用无菌技术，在生物安全 II+ （BSL2+） 安全柜中执行。

  1. 根据制造商对脂质转染输送系统的说明，通过转染293T细胞，使用适当的慢病毒质粒，生成携带相关基因（β-图布林-EGFP和RFP-H2B）的逆转录病毒。
    1. 第1天:使用一次性玻璃巴斯德移液器从一盘亚汇合293T细胞中吸出细胞培养基，并通过加入5 mL的PBS，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗掉残留培养基。旋转在板底部分配 PBS，然后用无菌一次性玻璃巴斯德移液器吸气。
    2. 加入预加热至37°C的0.05%胰蛋白酶的2 mL，在37°C下将板返回到加湿培养箱，在5%CO2下2至5分钟，使粘附细胞从细胞培养皿表面释放出来。
    3. 在含有胰蛋白酶的板中加入8 mL的新鲜Dulbeco的改性鹰介质（DMEM），辅以10%胎儿牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素。
    4. 通过轻轻移液来重新悬浮细胞，并将悬浮液转移到无菌的15 mL锥形管中。将锥形管置于平衡的离心机中，在室温下以 161 x g旋转 5 分钟，轻轻颗粒细胞。
    5. 从颗粒细胞中吸出中/胰蛋白酶溶液，并在10 mL的DMEM中重新悬浮细胞，辅以10%FBS和1%青霉素/链霉素。使用血细胞计计算 293T 细胞悬浮液和板 2 x 106 293T 细胞每孔 6 孔板。
    6. 培养细胞总体积为2 mL的Dulbeco的改性鹰培养基（DMEM）辅以10%胎儿牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素，并在加湿培养箱中保持37°C，CO2为5%。
    7. 第2天:移液器7μL的脂基转染输送试剂和100μL的减压血清培养基放入1.5 mL微离心管中，使其在室温下孵育5分钟（管#1）。
    8. 在单独的 1.5 mL 微离心管中，移液器 1 μg 的 RFP-H2B 表达载体（或 1 μg β-图布林-EGFP 表达载体），以及 5 μL 增强试剂（根据制造商指南的要求），0.5 μg pMD2.G 和 1 μg psPAX2 和 100 μL 的降低血清培养基（管#2）。
    9. 将步骤 1.1.7 和步骤 1.1.8 的内容相结合，将管#2小心地移入管#1，并在室温下孵育 20 分钟。
      注:反应可根据需要进行缩放，以便转染其他井中的细胞。
    10. 将转染反应滴入在2mL的介质中含有293T细胞的所需井，并将培养皿在37°C下返回加湿培养箱，CO2为5%。
      注:要生成同时表达RFP-H2B和β-tubulin-EGFP的细胞，为每个表达式构造生成单独的病毒（步骤1.1.7-1.1.9）。
    11. 第3天:吸气，用2 mL的新鲜DMEM补充10%FBS和1%青霉素/链霉素。将盘子在37°C下返回加湿培养箱，CO2为5%。
  2. 第4天:收集含有表达的病毒颗粒的培养基，小心不要破坏或移除293T细胞。通过连接到 5 mL 注射器的 0.45 μM 过滤器，过滤含有病毒颗粒的介质。在4°C下短期储存或长期储存在-80°C时使用等分病毒。
    注: 以这种方式获得的病毒颗粒将存在于 ±1 x 107至 1 x 108转导单元/mL 的范围内。由于病毒生成细胞和要感染的细胞都在同一培养基培养中，因此不需要病毒浓度来取代介质，过滤过的病毒颗粒可以直接用于感染细胞。
  3. 种子 2 x 105 hTERT-RPE-1 细胞每井 6 井盘，为病毒感染做准备。在2 mL的DMEM中培养细胞辅以10%FBS和1%青霉素/链霉素，并在37°C的加湿培养箱中维持，CO2为5%。
  4. 第5天:将六溴二苯丙胺（如聚溴二苯乙烯）添加到hTERT-RPE-1细胞中，最终浓度为8微克/mL。用500μL病毒的混合物在500μL细胞培养培养基中感染细胞。
    注:六溴二苯丙胺库存溶液在无菌蒸馏水中制备，然后通过0.45 μm过滤器过滤。
  5. 第6天:使用一次性玻璃巴斯德移液器，从含有受病毒感染细胞的井中吸出培养基。用含有10%FBS、1%青霉素/链霉素的2 mL DMEM和适当浓度的抗生素替换细胞培养基，以选择质粒整合和表达。
    注:所述实验中使用的β-图布林-EGFP表达质粒携带一个丙霉素抗素基因，RFP-H2B表达质粒携带一个高爆蛋白抗性基因。因此，10 μg/mL 的紫霉素和 2 μg/mL 的砂蛋白用于选择 β-图布林-EGFP、RFP-H2B 表达 hTERT RPE-1 细胞。用于选择抗生素的浓度对于使用的各种细胞系可能有所不同。
  6. 在抗生素选择下保持细胞5-7天，每3天用含有适当选择试剂的新鲜培养基替换培养基。
    注: 单元格应在选择期间在次汇合处保持，并应根据需要进行扩展，如步骤 1.1.1 到 1.1.4 中所述。
  7. 使用免疫荧光成像来确认标记结构的表达。
    注: 如果需要，可以派生单个细胞克隆，以获得细胞群中的统一表达水平。一旦确认稳定的克隆，在没有抗生素选择的情况下，细胞可以在标准培养条件下维持。

2. 在线粒主轴扰动后制备用于活细胞成像的细胞

注:使用无菌技术并在 BSL2 安全柜中执行步骤。

  1. 使用无菌一次性玻璃巴斯德移液器，从含有表达结构的细胞系的培养板上吸出培养基（从步骤1.7开始）。用10 mL的无菌PBS短暂清洗细胞。旋转在板底部分配PBS，然后用无菌一次性玻璃巴斯德移液器吸气PBS。
  2. 将 2 mL 0.05% 胰蛋白酶添加到 10 厘米板中。在37°C下孵育板2-5分钟，或直到细胞从板表面分离。
  3. 在含有胰蛋白酶的盘子里加入8 mL的新鲜介质。通过轻轻移液来重新悬浮细胞，并将悬浮液转移到无菌的15 mL锥形管中。将锥形管置于平衡的离心机中，在室温下以 161 x g旋转 5 分钟，轻轻颗粒细胞。
  4. 用10mL血清移液器轻轻移液，小心地吸出上清液，重新悬浮在10 mL的PBS中。将锥形管置于平衡的离心机中，在室温下以 161 x g旋转 5 分钟，轻轻颗粒细胞。
  5. 用10mL血清移液器轻轻移液，小心地吸出上清液，重新悬浮在10 mL的新鲜介质中。
  6. 计算细胞数，然后使用血球仪计算细胞数，在细胞培养基中稀释至1-2 x 105细胞/mL的浓度。种子500 μL的细胞悬浮液到每个孔的无菌12孔成像底板。将板放在细胞培养箱中，让细胞粘附在板表面。
    注: 活细胞成像要求细胞保持良好的粘附状态，以便在图像采集期间与成像平面保持关联。细胞在电镀后粘附所需的时间可能因细胞系而异，应针对所研究的细胞系进行优化。
  7. 在开始延时成像前 30 分钟，将线粒药物的相关浓度添加到一个或多个用细胞播种的井中。为了考虑有机溶剂对细胞行为的潜在影响，在细胞中加入相等体积的抑制剂稀释剂作为对照。例如，确保在细胞控制井中，将线粒体激酶Aurora A（例如，alisertib）的特异性抑制剂的100 nM与相同体积的DMSO（这种药物的稀释剂）平行。
    注:对线粒体进展动态变化的比较分析要求在没有扰动的情况下制备细胞井，以便能够在实验条件下对正常线粒进行成像。

3. 为RFP-H2B、β-图布林-GFP表达细胞的延时成像而设置的显微镜（图1，图2）

  1. 将含有RFP-H2B、β-tubulin-GFP的细胞培养板置于配备高分辨率摄像头（像素尺寸为0.67 μm，20倍时）的倒显荧光显微镜上，将表达hTERT RPE-1细胞的图像放入适当的分片中。环境室预热至37°C，并输送系统用于加湿5%CO2。
    注:如果可以提供加湿 5%CO2并获得稳定的温度控制，则可适当提供封闭式环境室或温度控制级插入件。
  2. 使用数值孔径为 0.5 的 20 倍空气物镜，并配备高对比度荧光和相位对比度或明场成像。查看相对比或亮场的细胞，调整过程，在显微镜上精细聚焦，使细胞进入焦点。
  3. 通过为将成像的荧光光道选择具有适当激发和发射的相应滤波立方体，确定并设置明场、GFP 和 RFP 图像采集的最佳曝光时间。或者，单击自动曝光按钮以输入预定的曝光时间。如果信号不够强烈，请选择像素分箱，通过单击装箱选项卡并从下拉菜单中选择2 x 2 像素分箱，从而缩短曝光时间。
    注:光毒性会损害线粒体进展和细胞活力。控制人群中的线粒细胞未能完成正常线粒，可能表明暴露时间和/或成像持续时间需要进一步优化。
  4. 使用采集和分析软件，使多坐标、多井成像能够同时采集，并定义图像采集的参数。
    1. 根据制造商的说明，选择并校准多井盘的显微镜级。使用图像采集软件单击所用板格式图中的相关井，突出显示或以其他方式选择将成像的井。
    2. 在"生成点"控制面板（图 2）下，通过单击"点放置"选项卡并选择预定义或随机坐标放置来定义每口井内的坐标。下拉菜单。选择"工作区域"选项卡，然后从下拉菜单中选择"限制"以限制坐标选择区域以排除井的边界。单击"计数"和"分布"选项卡，分别选择要每个井捕获的点数和分布。
      注: 在 5 分钟时间点增量内，每个井可成像的坐标数将受要成像的井数以及每个通道的曝光时间的限制。通常，每口井5-8个坐标足以在4小时内通过线粒体观察每个条件中至少50个细胞。
    3. 通过单击时间序列控制面板中的值并输入时间间隔和持续时间来收集图像。
      注:每 1 到 5 分钟采集一次图像，以监控线粒体进展的动态。成像的总体持续时间应反映细胞系所需的端点和增殖率。例如，4 小时足以看到许多细胞通过线粒体体体进展，16 小时足以看到异步总体中大多数 RPE-1 细胞通过线粒体体进行。

4. 延时图像分析，以确定线轴扰动后的元相定时和线状细胞命运

注:使用图像采集软件（材料表）、图像J或可比图像分析软件执行图像分析。

  1. 通过选择使用 RFP 滤镜立方体捕获的图像，可视化 RFP-H2B 标记的染色质。识别由初始染色质压实（图2C，蓝色箭头）和核包络分解（当β-图布林-EGFP不再被核边界排除时）所示的进入线粒的细胞。
  2. 确定单个细胞中元相对齐和抗相发病的线位计时:通过采集的影片中的连续时间点跟踪细胞，以确定从线粒进入到 RFP-H2B 标记染色质的时间点数/分钟数在元相期间完成在细胞赤道的对齐（图2C，黄色箭头）。
  3. 要监测线粒定时、线粒保真度和细胞命运，请继续通过连续时间点跟踪细胞，以确定阿相染色体分离明显的时间坐标（图2C，白色箭头）和/或发生染色质去压和核包络改造（如从核中排除纤维蛋白所示）
    注: 主轴装配或线粒体进展中的扰动可以评估为获得双相线轴和实现完整的染色体对齐或完成Aa相染色体分离所需的时间函数。
  4. 可视化 RFP-H2B，以识别在抗癫痫染色体分离期间出现线粒缺陷（包括滞后染色体和染色质桥）的每个人群中的细胞。
    注:受损的线粒保真度也可能导致多核或微细胞的子细胞，并可在线粒退出后的细胞中可视化，如图3所示。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

在主轴扰动存在时线粒体进展的评估
主轴聚焦的调节是正确双极主轴形成的关键步骤。通过蛋白质耗尽、药物抑制或中心体数改变破坏这一过程，破坏主轴结构，延迟或停止线粒体进展10、11、12、13。然而，一些扰动只是暂时延迟主轴的形成与细胞最终通过线?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

延时成像提供的时间分辨率允许可视化和评估单个细胞内的顺序细胞事件。利用细胞同步，随后在连续时间点收集和固定细胞的方法是有限的，因为最终比较是在细胞群之间进行的。在细胞对扰动的反应可能不均匀，或者可视化过程是动态的环境下，活细胞延时成像更有能力跟踪和分析单个细胞的动态以及异质性在细胞群中。通过这种方式，延时成像在监测细胞通过线粒体分裂的动态阶段的进展?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

DLM 由 NSF GRFP 支持。ALM 由史密斯家族生物医学研究卓越奖资助。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% TrypsinGibo-Life sciences25-510A serine protease used to release adherent cells from culture dishes
15ml centrifuge tubesOlympus Plastics28-101
20x CFI Plan Fluor objective NikonFor use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence
293T CellsATCCCRL-3216For use in retroviral transfection; used in step 1.1
a-tubulin-EGFP Addgenevarious numbersExpression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors
AlisertibSelleckchemS1133Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM.
BlasticidinInvitrogenA11139-03Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells
C02AirgasFor use in cell culture and live cell imaging
Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)Chroma49005Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP
Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)Chroma49002Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin
disposable glass Pastuer pipets, sterilized Fisher Scientific13-678-6AFor use in aspirating cells 
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibo-Life sciences11965-084Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibo-Life sciences10438-026Cell culture medium supplement
Lipofectamine 3000 and p3000InvitrogenL3000-015Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4
Multi well Tissue Culture dishesCorningvariousfor use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging
Nikon Ti-E microscopeNikonInverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging
NIS Elements HC NikonVersion 4.51Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4
OPTI-MEMGibo-Life sciences31985-070Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3
Penicillin/Streptomycin Gibo-Life sciences15140-122antibiotic used in cell culture medium
phosphate bufferred saline (PBS)Caisson labsPBP06-10X1LTsterile saline solution for use with cell culture
pMD2.GAddgene12259Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4
PolybreneSigma-AldrichH9268Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10
psPAXAddgene122602nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4
PuromycinInvitrogenant-pr-1Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells
RFP- Histone 2B (H2B)Addgenevarious numbersExpression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors
RNAi MaxInvitrogen13778-150Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs
RPE-1 cellsATCCCRL-4000Human retinal pigment epithelial cell line
Tissue culture dish 100x20mmCorning 353003for use in culturing adherent cells
Zyla sCMOS camera NikonCamera attached to the micrscope, used for capturing images of cells

参考文献

  1. Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
  2. Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491(2016).
  3. Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
  4. Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
  5. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
  6. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
  7. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
  8. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
  9. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411(2012).
  10. Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
  11. Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
  12. Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
  13. Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
  14. Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
  15. Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
  16. Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
  17. Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131(2011).
  18. Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
  19. Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
  20. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  21. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564(2009).
  22. Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
  23. Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
  24. Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
  25. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

151

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。