Imagem latente viva da pilha para avaliar a dinâmica do sincronismo da metafase e do Fate da pilha depois das perturbações mitotic do eixo

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a dinâmica da formação do eixo e da progressão mitotic. Nossa aplicação da imagem latente do lapso de tempo permite que o usuário identifique pilhas em vários estágios do mitosis, controle e identifique defeitos mitotic, e analise a dinâmica do eixo e o Fate mitotic da pilha em cima da exposição às drogas antimitotic.

Resumo

A imagem latente do tempo-lapso da pilha viva é uma ferramenta importante na biologia da pilha que fornece a introspecção em processos celulares que poderiam de outra maneira ser negligenciados, incompreendido, ou interpretado mal pela análise da fixo-pilha. Embora a imagem e a análise de células fixas sejam robustas e suficientes para observar o estado estacionário celular, ela pode ser limitada na definição de uma ordem temporal de eventos no nível celular e está mal equipada para avaliar a natureza transitória dos processos dinâmicos, incluindo progressão mitótica. Ao contrário, a imagem latente viva da pilha é uma ferramenta eloqüente que possa ser usada para observar processos celulares a nível da único-pilha sobre o tempo e tem a capacidade capturar a dinâmica dos processos que seriam representados de outra maneira mal na imagem latente fixa da pilha. Aqui nós descrevemos uma aproximação para gerar as pilhas que carregam marcadores cDNAs etiquetados da cromatina e dos microtúbulos e seu uso em aproximações da imagem latente da pilha viva para monitorar o alinhamento do cromossoma da metafase e a saída mitotic. Nós descrevemos técnicas Imaging-Based para avaliar a dinâmica da formação do eixo e da progressão mitotic, incluindo a identificação das pilhas em vários estágios no mitosis, na identificação e no seguimento de defeitos mitotic, e na análise da dinâmica do eixo e destino de células mitóticas após o tratamento com inibidores mitóticos.

Introdução

A análise baseada em imagem de células fixas é comumente usada para avaliar as alterações de nível populacional de células em resposta a várias perturbações. Quando combinado com a sincronização de células, seguido pela coleta e imagem de pontos de tempo serial, essas abordagens podem ser usadas para sugerir uma seqüência de eventos celular. Não obstante, a imagem latente fixa da pilha é limitada que as relações temporais estão implícitas para uma população e não demonstrada a nível de pilhas individuais. Desta maneira, quando a imagem latente e a análise fixas da pilha forem suficientes observar fenótipos robustos e mudanças do estado estacionário, a habilidade de detectar mudanças transientes sobre o tempo e as mudanças que impactam somente um subpopulação das pilhas são imperfeitas. Ao contrário, a imagem latente viva da pilha é uma ferramenta eloqüente que possa ser usada para observar processos celulares e subcellular dentro de uma única pilha, ou população celular, sobre o tempo e sem a ajuda de aproximações da sincronização que podem eles mesmos impactar o comportamento celular ^{1. º , 2. º , 3. º , 4. º , 5. º ,} a ⁶.

A formação de um eixo mitotic bipolar é essencial para a segregação apropriada do cromossoma durante a divisão da pilha, tendo por resultado duas pilhas genetically idênticas da filha. Os defeitos na estrutura mitotic do eixo que corromper a progressão mitotic e comprometer a fidelidade da segregação do cromossoma podem conduzir às divisões de pilha catastróficas e à viabilidade reduzida da pilha. Por esta razão, os venenos mitóticos que alteram a formação do fuso são terapêuticas promissoras para limitar a rápida proliferação das células cancerosas^7,8,9. Não obstante, a análise fixa da pilha da estrutura do eixo que segue a adição de venenos mitotic é limitada em sua habilidade de avaliar o processo dinâmico da formação do eixo e não pode indicar se as mudanças observadas na estrutura do eixo são permanentes ou são em vez transiente e pode ser superado para permitir a divisão celular bem-sucedida.

Neste protocolo, nós descrevemos uma aproximação para avaliar a dinâmica do mitose que segue perturbações do eixo pela imagem latente viva da pilha. Usando o hTERT imortalized RPE-1 linha celular projetada para expressar um RFP-Tagged histona 2B para visualizar a cromatina, juntamente com um EGFP-Tagged α-tubulin para visualizar microtúbulos, o sincronismo do alinhamento do cromossomo metafase, início da anaphase, e, finalmente, o Fate da pilha mitotic é avaliado usando indicações visuais do movimento do cromossoma, da compactação, e da morfologia nuclear.

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Protocolo

1. geração de células hTERT-RPE-1 que expressam estavelmente RFP-histona 2B (RFP-H2B) e α-tubulina-EGFP (Tub-EGFP)

Nota: todas as etapas seguem técnicas assépticas e acontecem em um gabinete de segurança de nível II + (BSL2 +) de biosseguridade.

1. Gerar retrovírus carregando os genes do interesse (α-tubulin-EGFP e RFP-H2B) pelo transfection de 293T pilhas com os plasmídeos lentivirais apropriados de acordo com as instruções do fabricante do sistema lipídico-baseado da entrega do transfection.
   1. Dia 1: utilize uma pipeta Pasteur de vidro descartável para aspirar o meio de cultura celular a partir de uma placa de células de 293T subconfluentes e lave o meio residual com solução salina tamponada com fosfato (PBS) adicionando 5 mL de PBS. Redemoinho para distribuir PBS sobre o fundo da placa, em seguida, aspirar o PBS com uma pipeta de vidro estéril descartável Pasteur.
   2. Adicionar 2 mL de 0, 5% de tripsina que foi pré-aquecido a 37 ° c e devolver a placa a uma incubadora humidificada a 37 ° c com 5% de CO₂ para 2 a 5 min para permitir que as células aderentes sejam libertadas da superfície do prato de cultura celular.
   3. Adicione 8 mL de meio de águia modificada de Dulbecco fresco (DMEM) suplementado com o soro bovino fetal de 10% (FBS) e a penicilina/estreptomicina de 1% à placa que contem o Trypsin.
   4. Ressuscitar as células introduzindo suavemente a pipetagem e transfira a suspensão para um tubo cônico estéril de 15 mL. Coloque o tubo cônico em uma centrífuga equilibrada e gire em 161 x g por 5 min à temperatura ambiente para gentilmente pellet as células.
   5. Aspirar a solução de médio/tripsina a partir de células peletizadas e células de ressuscição em 10 mL de DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina/estreptomicina. Use um hemocitômetro para contar a suspensão da pilha 293T e a placa 2 x 10⁶ 293T pilhas por o poço de uma placa de 6 poços.
   6. Células de cultura em um volume total de 2 mL do meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina e manter em uma incubadora humidificada a 37 ° c com 5% CO₂.
   7. Dia 2: Pipetam 7 μL de reagente de parto com base em lipídios e 100 μL de meio sérico reduzido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e permitem incubar à temperatura ambiente durante 5 min (tubo #1).
   8. Num tubo de microcentrifugação separado de 1,5 mL, pipetam 1 μg de vetor de expressão RFP-H2B (ou 1 μg de vetor de expressão α-tubulina-EGFP), juntamente com 5 μL de reagente potenciador (conforme exigido por directrizes do fabricante), 0,5 μg pMD2. G e 1 μg psPAX2 e 100 μL de redução médio sérico (tubo #2).
   9. Combine o conteúdo da etapa 1.1.7 e etapa 1.1.8 por pipetagem cuidadosamente #2 tubo em #1 de tubo e incubar por 20 min à temperatura ambiente.
      Nota: a reacção pode ser dimensionada conforme necessário para a transfecção de células em poços adicionais.
   10. Pipeta a reação do transfection gota gota ao poço desejado que contem as pilhas 293T em 2 ml do meio e retornam o prato à incubadora humidificada no ° c 37 com 5% co₂.
       Nota: para gerar células expressando RFP-H2B e α-tubulin-EGFP, gere vírus separados para cada construção de expressão (etapas 1.1.7-1.1.9).
   11. Dia 3: aspirar e substituir o meio com 2 mL de DMEM fresco suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina/estreptomicina. Devolva o prato à incubadora humidificada a 37 ° c com 5% de CO₂.
2. Dia 4: colete o meio contendo partículas de vírus expressas, sendo cauteloso para não interromper ou remover células de 293T. Filtre o meio contendo partículas de vírus passando-o através de um filtro de 0,45 μM anexado a uma seringa de 5 mL. Vírus alíquota para armazenamento a curto prazo a 4 ° c, ou armazenamento de longo prazo a-80 ° c.
   Nota: as partículas virais obtidas desta forma estarão presentes em uma faixa de ~ 1 x 10⁷ a 1 x 10⁸ unidades de Transviação/ml. Como as células e células produtoras de virais a serem infectadas são cultivadas no mesmo meio, a concentração viral para substituir o meio não é necessária e as partículas virais filtradas podem ser usadas diretamente para infectar as células.
3. Sementes 2 x 10⁵ htert-RPE-1 células por poço de um prato de 6 poços em preparação para a infecção viral. Células de cultura em 2 mL de DMEM suplementados com 10% FBS e 1% de penicilina/estreptomicina e manter em uma incubadora humidificada a 37 ° c com 5% CO₂.
4. Dia 5: Adicione o brometo de hexadimethrine (por exemplo, Polybrene) às pilhas de hTERT-RPE-1 a uma concentração final de 8 μg/mL. Infectar células com uma mistura de 500 μL de vírus diluído em 500 μL de meio de cultura celular.
   Nota: a solução de brometo de Hexadimethrine é preparada em água destilada estéril, depois filtrada através de um filtro de 0,45 μm.
5. Dia 6: usando uma pipeta de vidro descartável de Pasteur, aspirar o meio dos poços que contêm as pilhas contaminadas vírus. Substitua o meio de cultura celular por 2 mL de DMEM contendo 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina e concentrações apropriadas de antibiótico para selecionar para a integração e expressão do plasmídeo.
   Nota: o plasmídeo de expressão α-tubulina-EGFP utilizado nos experimentos descritos traz um gene de resistência à puromicina e o plasmídeo da expressão RFP-H2B carrega um gene de resistência à blasticidina. Portanto, 10 μg/mL de puromicina e 2 μg/mL de blasticidina são usados para a seleção de α-tubulina-EGFP, RFP-H2B expressando células hTERT RPE-1. As concentrações de antibióticos utilizadas para a seleção podem diferir para várias linhas celulares utilizadas.
6. Manter as células seleção antibiótica por 5-7 dias, substituindo o meio a cada 3 dias com meio fresco contendo reagentes de seleção apropriados.
   Nota: as células devem ser mantidas na subconfluência durante a seleção e devem ser expandidas conforme necessário, conforme descrito nas etapas 1.1.1 a 1.1.4.
7. Use a imagem latente da imunofluorescência para confirmar a expressão de construções etiquetadas.
   Observação: se desejado, os clones de célula única podem ser derivados para obter níveis de expressão uniforme dentro da população de células. Uma vez que os clones estáveis são confirmados, as pilhas podem ser mantidas as condições padrão da cultura na ausência de seleção antibiótica.

2. preparação de células para imagens de células ao vivo após perturbações do fuso mitótico

Nota: Use técnicas assépticas e execute as etapas em um armário de segurança BSL2.

1. Usando uma pipeta de vidro estéril descartável de Pasteur, aspirar o meio da placa da cultura que contem a linha de pilha que carreg a construção da expressão (s) (da etapa 1,7). Lave brevemente as células com 10 mL de PBS estéril. Redemoinho para distribuir PBS sobre o fundo da placa, em seguida, aspirar PBS com uma pipeta Pasteur estéril de vidro descartável.
2. Adicione 2 mL de 0, 5% de tripsina à placa de 10 cm. Incubar a placa a 37 ° c por 2-5 min ou até que as células se separem da superfície da chapa.
3. Adicionar 8 mL de meio fresco à placa contendo tripsina. Ressuscitar as células introduzindo suavemente a pipetagem e transfira a suspensão para um tubo cônico estéril de 15 mL. Coloque o tubo cônico em uma centrífuga equilibrada e gire em 161 x g por 5 min à temperatura ambiente para gentilmente pellet as células.
4. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuscitar em 10 mL de PBS pipetando suavemente com uma pipeta serológica de 10 mL. Coloque o tubo cônico em uma centrífuga equilibrada e gire em 161 x g por 5 min à temperatura ambiente para gentilmente pellet as células.
5. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuscitar em 10 mL do meio fresco pipetando suavemente com uma pipeta serológica de 10 mL.
6. Contagem de células, em seguida, calcular o número da célula usando um hemacitômetro e diluir para uma concentração de 1-2 x 10⁵ células/ml no meio de cultura celular. Semente 500 μL da suspensão da pilha a cada poço de uma placa inferior estéril da imagem latente de 12 poços. Coloc a placa na incubadora da cultura da pilha e permita que as pilhas aderem à superfície da placa.
   Nota: a imagem latente da pilha viva exige que as pilhas sejam well-adered de modo que permaneçam associadas com o plano da imagem latente durante a aquisição de imagens. A duração do tempo necessário para as células aderirem após o chapeamento pode diferir de uma linha de célula para a próxima e deve ser otimizada para a linha de célula em estudo.
7. Até 30 minutos antes de iniciar a imagem latente do lapso de tempo, adicione uma concentração relevante de uma droga mitotic a um ou mais dos poços semeados com pilhas. Para dar conta do potencial impacto do solvente orgânico no comportamento celular, adicione um volume igual do diluente do inibidor às células como controles. Por exemplo, assegure-se de que a adição de 100 nM do inibidor específico da quinase mitótica Aurora A (por exemplo, alisertib) seja paralelizadas com um volume igual de DMSO, o diluente para esta droga, em um poço de controle das células.
   Nota: a análise comparativa das alterações dinâmicas na progressão mitótica requer que os poços de células sejam preparados na ausência de perturbações para possibilitar a imagem de mitoses normais em paralelo às condições experimentais.

3. microscópio ajustado para a imagem latente do tempo-lapso de RFP-H2B, α-tubulin-GFP que expressa pilhas (Figura 1, Figura 2)

1. Coloque a placa de cultura celular contendo RFP-H2B, α-tubulin-GFP expressando células hTERT RPE-1 para serem fotografadas em uma pastilha de estágio apropriada em um microscópio de epifluorescência invertido que está equipado com uma câmera de alta resolução (tamanho de pixel de 0,67 μm a 20x), um câmara ambiental pré-aquecida a 37 ° c, e um sistema de entrega para umidificado 5% co₂.
   Nota: as câmaras ambientais incluidas ou as inserções controladas temperatura do estágio podem ser apropriadas fornecidas humidificada 5% CO₂ pode ser entregado e o controle de temperatura estável obtido.
2. Use um objetivo do ar 20x com uma abertura numérica de 0,5 e equipado para a fluorescência do contraste elevado e a imagem latente do contraste ou do brightfield da fase. Ver células com o contraste de fase ou brightfield e ajustar o curso e o foco fino no microscópio para trazer as células em foco.
3. Identifique e defina os tempos de exposição ideais para a aquisição de imagens brightfield, GFP e RFP selecionando o respectivo cubo de filtro com excitação e emissão apropriadas para os fluoróforos que serão fotografados. Alternativamente, clique no botão de exposição automática para introduzir um tempo de exposição predeterminado. Se o sinal não for suficientemente intenso, selecione binning de pixel para permitir tempos de exposição mais curtos, clicando na guia binning e selecionando 2 x 2 pixel binning no menu suspenso.
   Nota: a fototoxicidade pode prejudicar a progressão mitótica e a viabilidade celular. A falha de pilhas mitotic em populações do controle para terminar mitoses normais pode ser uma indicação que os tempos da exposição e/ou a duração da imagem latente precisam de ser aperfeiçoados mais mais.
4. Use um software de aquisição e análise que permita a aquisição simultânea de imagens multicoordenadas e multipoços e defina os parâmetros para a obtenção da imagem.
   1. Selecione e calibre o estágio do microscópio ao prato do multi-poço, de acordo com as instruções do fabricante. Use o software de aquisição de imagem para destacar ou de outra forma selecionar os poços que serão fotografados clicando nos poços relevantes no diagrama do formato da placa que está sendo usado.
   2. o painel de controle de Generatedpoints (Figura 2), defina as coordenadas dentro de cada poço que será imaged estalando na aba da colocação do ponto e selecionando o posicionamento predefinido ou aleatório da coordenada de no menu suspenso. Selecione a guia área de trabalho e selecione restrito no menu suspenso para restringir a área de seleção de coordenadas para excluir os limites do poço. Clique nas guias contagem e distribuição para selecionar o número e a distribuição de pontos a serem capturados por poço, respectivamente.
      Nota: o número de coordenadas que podem ser imaged por bem dentro do incremento de 5 minutos do ponto de tempo será limitado pelo número de poços a ser imaged, assim como o tempo de exposição para cada canaleta. Tipicamente, 5-8 coordenadas por poço são suficientes para observar pelo menos 50 células em cada condição progridem através de mitose dentro de 4 h.
   3. Selecione e insira o intervalo de tempo e a duração para coletar imagens clicando em e inserindo os valores no painel de controle Timesequence .
      Nota: a aquisição de imagens a cada 1 a 5 minutos é apropriada para monitorar a dinâmica da progressão mitótica. A duração geral da imagem deve refletir o ponto de extremidade desejado e a taxa de proliferação da linha celular. Por exemplo, 4 horas é suficiente para ver muitas células progridem através de mitose, 16 horas é suficiente para ver a maioria das células RPE-1 em um progresso de população assíncrona através de mitose.

4. análise da imagem do tempo-lapso para determinar o sincronismo da metafase e o Fate mitotic da pilha que segue perturbações mitotic do eixo

Nota: executar a análise de imagem usando um software de aquisição de imagem (tabela de materiais), ImageJ, ou software de análise de imagem comparável.

1. Visualize a cromatina rotulada RFP-H2B selecionando as imagens capturadas com o cubo do filtro RFP no lugar. Identifique uma célula entrando em mitose, conforme indicado pela compactação inicial da cromatina (Figura 2C, seta azul) e quebra de envelope nuclear (quando α-tubulin-EGFP não é mais excluído pelo limite nuclear).
2. Determine o sincronismo mitotic do alinhamento da metafase e do início do anaphase em pilhas individuais: acompanhe a célula através dos temporais consecutivos no filme adquirido para determinar o número de pontos temporais/minutos da entrada mitotic até a cromatina rotulada por RFP-H2B completa o alinhamento no Equador da célula durante a metafase (Figura 2C, Arrowhead amarelo).
3. Para monitorar o sincronismo mitotic, a fidelidade mitotic, e o Fate da pilha, continue a seguir a pilha com os temporais consecutivos para identificar a coordenada do tempo em que a segregação do cromossoma do anaphase é aparente (Figura 2C, Arrowhead branco) e/ou onde ocorreu a descompactação da cromatina e a reformação de envelope nuclear (como indicado pela exclusão de tubulina do núcleo).
   Nota: as perturbações no conjunto do eixo ou progressão mitótica podem ser avaliadas em função do tempo necessário para obter um fuso mitótico bipolar e alcançar o alinhamento total do cromossomo, ou para completar a segregação do cromossomo anaphase.
4. Visualize o RFP-H2B para identificar células em cada população que apresentem defeitos mitóticos, incluindo pontes de cromossomos e cromatina durante a segregação do cromossomo anaphase.
   Nota: a fidelidade mitótica comprometida também pode resultar em células filhas multinucleadas ou micronucleadas e pode ser visualizada nas células após a saída mitótica, como na Figura 3.

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Resultados

Avaliação da progressão mitótica na presença de perturbações do fuso
O Regulamento do pólo do eixo que focalizando é uma etapa essencial na formação bipolar apropriada do eixo. Rompimento nesse processo por meio de depleções de proteínas, inibição de fármacos ou alterações no número centrosome corromper a estrutura do fuso e atrasar ou interromper a progressão mitótica^10,11,

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Discussão

A resolução temporal fornecida pela imagem de lapso de tempo permite a visualização e avaliação de eventos celulares seqüenciais dentro de células individuais. Abordagens que fazem uso de sincronização celular seguido pela coleta e fixação de células em pontos de tempo seqüencial são limitadas em que as comparações são feitas em última análise entre as populações de células. Em contextos onde a resposta celular às perturbações pode ser não uniforme, ou onde o processo que está sendo visualizad...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin	Gibo-Life sciences	25-510	A serine protease used to release adherent cells from culture dishes
15ml centrifuge tubes	Olympus Plastics	28-101
20x CFI Plan Fluor objective	Nikon		For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence
293T Cells	ATCC	CRL-3216	For use in retroviral transfection; used in step 1.1
a-tubulin-EGFP	Addgene	various numbers	Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors
Alisertib	Selleckchem	S1133	Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM.
Blasticidin	Invitrogen	A11139-03	Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells
C02	Airgas		For use in cell culture and live cell imaging
Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)	Chroma	49005	Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP
Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)	Chroma	49002	Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin
disposable glass Pastuer pipets, sterilized	Fisher Scientific	13-678-6A	For use in aspirating cells
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibo-Life sciences	11965-084	Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibo-Life sciences	10438-026	Cell culture medium supplement
Lipofectamine 3000 and p3000	Invitrogen	L3000-015	Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4
Multi well Tissue Culture dishes	Corning	various	for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging
Nikon Ti-E microscope	Nikon		Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging
NIS Elements HC	Nikon	Version 4.51	Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4
OPTI-MEM	Gibo-Life sciences	31985-070	Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3
Penicillin/Streptomycin	Gibo-Life sciences	15140-122	antibiotic used in cell culture medium
phosphate bufferred saline (PBS)	Caisson labs	PBP06-10X1LT	sterile saline solution for use with cell culture
pMD2.G	Addgene	12259	Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268	Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10
psPAX	Addgene	12260	2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4
Puromycin	Invitrogen	ant-pr-1	Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells
RFP- Histone 2B (H2B)	Addgene	various numbers	Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors
RNAi Max	Invitrogen	13778-150	Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs
RPE-1 cells	ATCC	CRL-4000	Human retinal pigment epithelial cell line
Tissue culture dish 100x20mm	Corning	353003	for use in culturing adherent cells
Zyla sCMOS camera	Nikon		Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells