小肠神经内分泌肿瘤类球体的建立与特征

摘要

神经内分泌肿瘤（NETs）来自神经峰的神经内分泌细胞。它们生长缓慢，对文化充满挑战。我们提出了一个替代策略，通过培养它们作为球体，从小肠中种植NET。这些球体有小肠NET标记，可用于药物测试。

摘要

小肠神经内分泌肿瘤（SBNETs）是肠道肠色素细胞的罕见癌症。这一领域的研究是有限的，因为很少患者衍生的SBNET细胞系被生成。分化良好的SBNET细胞生长缓慢，难以繁殖。已经建立的少数细胞系不是现成的，在培养中一段时间后可能无法继续表达NET细胞的特性。产生新的细胞系可能需要很多年，因为SBNET细胞有很长的倍增时间，并且需要许多浓缩步骤来消除快速分裂的癌症相关成纤维细胞。为了克服这些限制，我们开发了一种方案，从手术切除的肿瘤中培养SBNET细胞，将其作为细胞外基质（ECM）中的球形体。ECM 形成一个三维矩阵，封装 SBNET 细胞，并模仿肿瘤微环境，允许 SBNET 细胞生长。在这里，我们描述了SBNET球体的生长速率，并描述了使用免疫荧光显微镜和免疫组织化学识别SBNET标记物的方法，以确认球体是神经内分泌肿瘤细胞。此外，我们使用SBNET球体来测试拉帕霉素的细胞毒性。

引言

小肠神经内分泌肿瘤（SBNETs）起源于小肠的肠色素细胞。虽然SBNET通常已知生长缓慢，但它们通常转移至^肝脏1。虽然手术切除或肿瘤消融可以考虑在许多情况下，复发几乎是普遍的，因此，药物治疗在管理中起着重要的作用。已经投入了巨大的努力来产生新的SBNET细胞系用于药物检测。然而，收效甚微。只^报告了6个SBNET细胞系（KRJ-I、CND2、GOT1、P-STS、L-STS、H-STS）。不幸的是，一个细胞系不再表示NET^标记6和三个其他SBNET细胞系（KRJ-I，L-STS，H-STS）被确定为从转化淋巴细胞，而不是NET7派生。为了加速识别针对SBNET的药物，需要采用替代方法进行体外药物检测。

在这里，我们利用被切除的SBNET的可用性，并建立了一种方法，培养这些患者衍生的SBNET作为在ECM中生长的球体。本手稿的总体目标是将一种将 SBNET 培养为三维 （3D） 培养方法描述为一种三维 （3D） 培养方法，并概述通过免疫荧光染色和免疫组织化学来描述这些球体以保留 SBNET 标记的过程。

此外，我们演示了这些SBNET球体如何可用于测试拉帕霉素的效果，一种抗癌^{药物NET8。}该协议背后的原理是开发一种在体外培养SBNET细胞的新方法，并将其用于药物测试。与建立SBNET细胞系的传统方法相比，该技术的优点是可以快速获得SBNET的3D培养物，并在3周内进行药物测试。SBNET球体可能被用作执行体外药物屏幕的模型，以识别SBNET患者的新药。由于SBNET细胞系并不广泛可用，SBNET球体的3D培养物可以作为研究SBNET的新体外模型，并可在该领域的科学家之间共享。

研究方案

所有使用人类神经内分泌肿瘤样本的实验都已获得爱荷华大学医院和诊所IRB委员会的批准（协议号199911057）。所有材料和设备的列表在材料表中描述。增长介质和关键解决方案的列表见表1。

1. 小肠神经内分泌肿瘤（SBNET）采集和细胞分离

1. 从外科病理学核心确认肿瘤组织后，获取切除的患者SBNET样本。
2. 将 SBNET 切成 5 mm 立方体，并储存在 25 mL 的 DMEM/F12 介质中，放入锥形管中，以便运输至实验室。
3. 在含有1%FBS、1%青霉素/链霉素（Pen/链球菌）、1%谷氨酰胺（洗涤介质）的DMEM中转移肿瘤，并在此洗涤介质中孵育15分钟。
4. 使用无菌弯曲剪刀将肿瘤转移到新盘和薄荷肿瘤到小于 1 毫米片。
5. 将切碎的组织转移到含有25 mL洗涤介质的50 mL管中。
6. 在 4°C 下在 500 x g下离心 15 分钟。
7. 丢弃上清液，在含有胶原酶（100 U/mL）和DNase（0.1mg/mL）的洗涤介质中重新悬浮颗粒。
8. 允许消化切碎的肿瘤发生在37°C的培养箱中，缓慢摇动（50 rpm），1.5小时。

2. SBNET作为ECM肿瘤球体的培养

1. 消化完成后（步骤1.8），在4°C下以500 x g离心15分钟，丢弃上清液，将颗粒重新悬浮在15 mL的洗涤介质中。
2. 将 70 μm 细胞滤网放在新的 50 mL 管顶部，并将 10 mL 的洗涤介质转移到细胞滤网上。旋转洗涤介质以覆盖塑料管的一侧，以防止 NET 细胞粘在塑料管的侧面。
3. 通过细胞过滤器过滤细胞悬浮液。
4. 在 500 x g下在 4°C 下离心 15 分钟，丢弃上清液，在 200 μL 的洗涤介质（总体积为 ± 250 μL）中重新悬浮颗粒，并将其放在冰上。
5. 将5μL细胞转移到500μL的洗涤介质（1/100稀释因子）。使用血细胞计使用稀释的细胞进行细胞计数，以获得每毫升的细胞数。乘以 100 以校正稀释系数。
6. 将步骤 2.5 中获得的每 mL 的细胞数乘以步骤 2.4 （= 250 μL） 中获得的悬浮细胞总体积。
7. 在 500 x g下在 4°C 下离心 15 分钟，丢弃上清液，并将细胞重新悬浮在液体 ECM 中（1 x 10⁶细胞/mL），并保持在冰上。
8. 将 ECM 中的 5-20 μ0 ΜL SBNET 球体转移到 96 孔板中，通过将板置于 37°C 培养箱中 5 分钟，使液体 ECM 固化。
9. 在含有ECM中SBNET球体的96孔板中，每口孔中加入200 μL的SBNET培养基（DMEM/F12 = 10% FBS + 1% PEN/STREP = 1% 谷氨酰胺 + 10 mMM烟酰胺 + 10 μg/mL 胰岛素）。
10. 或者，培养SBNET有机体在干细胞培养基中类似于以前描述的人类肝脏或胰腺器官^生长9，并列在材料表中。
11. 每 5-7 天更换一次介质。

3. 使用 ImageJ 定量 SBNET 球体尺寸

1. 在第 1 天、第 4 天、第 7 天、14 天、23 日和 97 日拍摄 5-10 张 SBNET 球体照片，使用 10 倍目标。
2. 在 ImageJ 中打开保存的图像。转到"分析"选项卡，选择"设置测量值"选项，然后对"区域"选项进行检查。
3. 使用工具栏中的椭圆选择工具在聚焦良好的球形周围生成椭圆或圆形。
4. 转到"分析"选项卡并选择"度量值"选项。重复步骤 3.4 和 3.5，以便从 25-50 SBNET 球体获得面积测量。这些值以像素平方提供。
5. 通过将每个像素的大小与每个像素的长度除以显微镜图像的 μm 转换系数，将像素区域转换为 μm^2。
   注:SBNET细胞主要以球形生长，有些时候作为椭圆体生长。

4. 通过免疫荧光对SBNETS球体进行表征

1. 使用 P1000 移液器将 ECM 中生长的有机物转移到 1.5 mL 管中。
2. 在 1，500 x g下离心 1 分钟，并去除上清液。
3. 通过加入1 mL的PBS清洗有机体培养物，混合、在1，500 x g下离心1分钟，并去除上清液。
4. 加入500μL的4%甲醛，孵育15分钟，修复有机体。
5. 用 1 mL 的 PBS 洗涤培养液两次。
6. 通过添加 500 μL 的 PBS + 3% BSA = 0.1% Triton X 100 5 分钟来渗透培养物。
7. 然后用 1 mL 的 PBS = 3% BSA 洗涤三次。
8. 用初级抗体对突触素 （SYP）¹⁰孵育 1h，在 1/600 稀释或色丹素 A （CgA）¹¹和体母素受体 2 （SSTR2）¹²在抗体缓冲液中稀释 1/400 （2.5% 牛血清白蛋白， 0.1% 钠）阿齐德，25 mM Tris pH 7.4，150 mM 氯化钠）。
   注:每管使用300μL或更多抗体溶液。
9. 用 1 mL 的 PBS = 3% BSA 洗涤三次。
10. 在抗体缓冲液中以1/500稀释时与FITC耦合的二级抗体孵育1小时。每管使用300μL或更多抗体溶液。
11. 洗涤 3 次，使用 1 mL 的 PBS = 3% BSA。确保吸出并丢弃所有上清液。
12. 加入5μL的安装介质，其中包含核污渍DAPI。
13. 使用 P20 移液器将 5 μL 的 SBNET 球体从步骤 4.12 转移到玻璃滑块上，并密封盖玻片。
14. 使用 10x、20x 或 40x 物镜使用荧光显微镜拍摄图像。

5. 通过免疫组织化学 （IHC） 进行 SBNET 球体表征

1. 使用 P1000 移液器将 SBNET 球体从培养板转移到 1.5 mL 管。
2. 在 1，500 x g下离心 1 分钟，并去除上清液。
3. 修复SBNET球体，从步骤5.2向管中加入500μL的10%形式，并在石蜡嵌入前2-5天室温下孵育，并切割4μm厚的球形部分。
4. 在pH9的抗原检索溶液中，使用热诱导表位提取，使用3合1自动滑动处理站加热至97°C20分钟，为抗体孵育准备幻灯片。
5. 以1/100稀释15分钟对SYP¹⁰进行块状滑轨和孵育，在1/800稀释时用CgA¹¹进行15分钟，在1/5，000稀释时用SSTR21孵育30分钟。
6. 使用二级抗体检测系统孵育抗SYP和CgA染色15分钟，抗SSTR2染色30分钟。使用 400x 目标拍照。

6. 用拉帕霉素治疗SBNET类有机物

1. 在 DMSO 中溶解拉帕霉素，以获得 10 mM 库存溶液。
2. 使用 DMSO（例如，1 mL 的 SBNET 培养基 = 1 μL 的 DMSO）和带 10 μM 雷帕霉素的 SBNET 培养基（例如，1 mL 的 SBNET 培养基 = 1 μL 的 10 mM 雷帕霉素库存溶液）制备 SBNET 培养基。
3. 将 200 μL 介质与带 DMSO 或 10 μM 拉帕霉素的 SBNET 培养基转移到 SBNET 球形培养物。
4. 在37°C培养箱中孵育SBNET球体5天。
5. 加入1 μM的紫杉醇，孵育30分钟。取出含有苯二甲酸酯的介质，用200μL的PBS清洗，并将200μL的PBS转移到每个井。
6. 使用带有荧光显微镜10x、20x或40x物镜的红色滤镜立方体，拍摄带药物治疗或不药物治疗的SBNET球体的显微镜图像。
   注:使用市售显微镜的红色滤镜立方体G（材料表），沾染了被染色的死细胞显示为红色。或者，可以使用535nm激发和624nm发射分光光度计捕获信号。

7. 分割 SBNET 球体

注:这样做是为了扩展和与其他研究人员共享。

1. 使用 P1000 移液器以机械方式断开 ECM，并使用 SBNET 球形将 ECM 吸到无菌的 1.5 mL 管中。
2. 在 4°C 下以 1，000 x g离心，去除所有上清液，并将管放在冰上。
3. 将新 ECM 的体积增加 2-4 倍。通过上下移液 10 倍，将新 ECM 与旧 ECM 和 SBNET 球体混合。避免引入气泡。
4. 将 ECM 和 SBNET 球体混合物的 5-20 μL 转移到新板，并允许 ECM 固化。
5. 用新的SBNET介质盖住并转移到孵化器。回收率约为 95 到 100%。
6. 要将 SBNET 球体运送到另一个实验室，请使用新 ECM 将 SBNET 球体转移到 T25 烧瓶，并允许 ECM 固化。
7. 用 SBNET 球形介质填充 T25 烧瓶，拧紧盖上，并准备装运包装。
8. 收到 SBNET 球体培养体后，删除培养基，执行步骤 7.1 到 7.5，使 SBNET 球体回到培养体中。

8. SBNET 球体的冷冻存储和恢复

1. 将 SBNET 球体从 5-10 个小井转移到 15 mL 管。在500 x g下在4°C下离心15分钟，去除上清液，重新悬浮在冷冻介质中（90%FBS = 10%DMSO），储存在细胞冷冻容器中，并将其置于-80°C。
2. 转移到液氮中，以便延长储存时间。
3. 要恢复 SBNET 球体，请将冷冻小瓶放在冰上，等待内容完全解冻。反转管子并重新放置在冰上，以加快解冻过程。
4. 样品解冻后，放入预冷却离心机内，以1000 x g旋转10分钟。
5. 拆下上清液并重新悬挂 ECM 中的球体。将管放在冰上，将 20 μL 转移到新板，然后等待 ECM 凝固。
6. 用10μM的ROCK抑制剂（Y-27632）13转移200μL的SBNET培养基，并转移到培养箱。
7. 允许 SBNET 球体恢复和生长 1 周。去除旧的培养基，补充200 μL的SBNET培养基，并返回到孵化器。
8. 允许 SBNET 球体继续生长。
   注意:快速生长的球体在冷冻^保存13后开始恢复至少需要1周时间。SBNET球体至少需要2-4周才能开始生长。许多SBNET细胞将在前2周内死亡，存活率低于10%。由于这是一个非常耗时和低产量的过程，最好与其他研究人员共享培养瓶中的 SBNET 球体（如步骤 7 中所述）。冷冻储存和恢复应仅用作在发生细菌污染时的备用计划。

结果

目前只有2个SBNET细胞系建立和出版2，3，4，5，它们不是现成的许多研究人员。在这里，我们建议将 SBNET 培养为 ECM 中的球体，并将其用作研究 SBNET 药物敏感性的替代模型。从转移到肝脏的SBNET患者衍生的肿瘤被收集，消化以释放SBNET细胞，并与液体ECM混合，以建立SBNET球体培养物（图1A...

讨论

肿瘤3D培养物已成为临床前药物检测的宝贵^资源。各种肿瘤有机体生物库最近已建立从乳腺癌和前列腺癌^{肿瘤16，17。}在这项研究中，我们为培养SBNET作为球体提供了详细的方案，以及一种简单快捷的方法，通过免疫荧光和测试药物敏感性验证NET标记物的球体培养。根据我们的经验，SBNET球体可以在各种文化媒介中成长。它们在干细胞培?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-rabbit FITC	Jackson ImmunoResearch	11-095-152	Secondary antibody couple to a green fluorophore
Antigen Retrieval Solution	Agilent Dako	S2367	Solution at pH 9 for preparing slides for IHC
Autostainer Link 48	Agilent Dako	Not Available	Automated system for antibody staining
Cell freezing container	Thermo Scientific	5100-0001	Container to for freezing cells
CellSence	Olympus	Version 1.18	Computer software for using fluorescent microscope
Chromogranin A antibody	Abcam-45179	RB-9003-PO	Antibodies for IF
Chromogranin A antibody (clone LK2H10)	Thermo Scientific	MA5-13096	Antibodies for IHC
Collagenase	Sigma	C0130	Enzyme for digesting tumor tissue
DMEM	Gibco	11965-092	Medium for tissue preparation
DMEM/F12	Gibco	11320-033	Medium for organoid cultures
DMSO	Sigma	D8418	Solvent for dissolving drug
DNAse	Sigma	DN25	Enzyme for digesting tumor tissue
Ethidium Homodimer	Chemodex	CDX-E0012-T1E	DNA and RNA binding dye
FBS	Gibco	16000044	Reagent for culture media
Fluorescent microscope	Olympus	CKX35	Microscope for taking pictures of SBENT spheroids
Glutamine	Gibco	A2916801	Reagent for culture media
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.51	Computer software for image analysis
Insulin	Sigma	I0516	Reagent for culture media
Matrigel	Corning	356235	Matrix to embed and anchore organoids
Mounting medium (VECTASHIELD)	Vector Laboratories	H-1200	Fixative for labelled-cells with a nuclear stain
Nicotinamide	Sigma	72340	Reagent for culture media
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Reagent to fix cells
PEN/STREP	Gibco	15140-122	Reagent for culture media
PT Link	Agilent Dako	Not Available	Automated system to prepare slides for IHC staining
Rapamycin	Alfa Aesar	J62473	Drug that can inhibit NET growth
Secondary antibodies for IHC	Agilent Dako	K8000	Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system
SSTR2 antibody	GeneScritp	A01591	Antibodies for IF
SSTR2 antibody (clone UMB1)	Abcam	ab134152	Antibodies for IHC
Synaptophysin antibody	Abcam	32127	Antibodies for IF
Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)	Agilent Dako	M7315	Antibodies for IHC
TritonX	Mallinckrodt	3555 KBGE	Reagent to permeablize cells
Y-2763 ROCK inhibitor	Adipogen	AG-CR1-3564-M005	To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw