小腸神経内分泌腫瘍スフェロイドの確立と特徴付け

要約

神経内分泌腫瘍(NETs)は神経堤の神経内分泌細胞に由来する。彼らは成長が遅く、文化に挑戦しています。我々は、スフェロイドとしてそれらを培養することにより、小腸からNETを成長させるための代替戦略を提示します。これらのスフェロイドは、小さな腸ネットマーカーを有し、薬物検査に使用することができます。

要約

小腸神経内分泌腫瘍(SBNET)は、腸の腸内クロマフィン細胞に由来する稀な癌である。この分野の研究は、非常に少数の患者由来SBNET細胞株が生成されているので、限られている。十分に分化したSBNET細胞は成長が遅く、伝播しにくい。確立された少数の細胞株は容易に利用できないし、培養中の時間が経つ後もNET細胞の特性を発現し続けないかもしれない。SBNET細胞は長い倍増時間を持ち、癌関連線維芽細胞を急速に分裂させるには多くの濃縮ステップが必要となるため、新しい細胞株の生成には何年もかかる可能性があります。これらの限界を克服するために、細胞外マトリックス(ECM)におけるスフェロイドとして外科的に除去された腫瘍からSBNET細胞を培養するプロトコルを開発しました。ECMは、SBNET細胞をカプセル化し、腫瘍微小環境を模倣してSBNET細胞の増殖を可能にする3次元マトリックスを形成する。ここでは、SBNETスフェロイドの増殖速度を特徴付け、免疫蛍光顕微鏡と免疫組織化学を用いてSBNETマーカーを同定する方法を説明し、スフェロイドが神経内分泌腫瘍細胞であることを確認した。また、ラパマイシンの細胞毒性を試験するためにSBNETスフェロイドを用いた。

概要

小腸神経内分泌腫瘍(SBNETs)は、小腸の腸内クロマフィン細胞に由来する。SBNETは一般的にゆっくりと成長することが知られているが、それらは一般的に^肝臓1に転移する。外科的除去または腫瘍切除は多くの場合考えることができるが、再発はほぼ普遍的であり、したがって、医療療法は管理において重要な役割を果たす。薬物検査のための新しいSBNET細胞株を生成するために多大な努力が投資されています。しかし、成功はほとんどありませんでした。6つのSBNET細胞株(KRJ-I、CND2、GOT1、P-STS、L-STS、H-STS)のみが報告されています^2,3,4,5;そして残念ながら、1つの細胞株はもはやNET^{マーカー6}および他の3つのSBNET細胞株(KRJ-I、L-STS、H-STS)を発現しなくなり、NETs⁷の代わりに形質転換リンパ芽球に由来すると判断した。SBnETを標的とする薬剤の同定を加速するためには、インビトロ薬物検査のための代替方法が必要である。

ここでは、切除されたSBNETの利用可能性を利用し、ECMで成長するスフェロイドとしてこれらの患者由来SBNETを培養する方法を確立した。この原稿の全体的な目標は、免疫蛍光染色および免疫組織化学によるSBNETマーカーの保持のためのこれらのスフェロイドを特徴付ける3次元(3D)培養および輪郭手順としてSBNETを培養する方法を記述することです。

さらに、これらのSBNETスフェロイドをNETs⁸の抗癌剤であるラパマイシンの効果をテストするためにどのように使用できるかを示す。このプロトコルの背後にある根拠は、インビトロでSBNET細胞を成長させ、薬物検査に使用する新しい方法を開発することです。SBNET細胞株を確立する従来の方法に対するこの技術の利点は、SBnNETの3D培養物を迅速に得ることができ、薬物検査を3週間以内に行うことです。SBNETのスフェロイドは、SBNET患者の新薬を同定するためにインビトロ薬剤スクリーンを行うためのモデルとして使用される可能性がある。SBNET細胞株は広く利用できないため、SBNETスフェロイドの3D培養はSBNNETを研究するための新しいインビトロモデルとして機能し、現場の科学者間で共有することができます。

プロトコル

ヒト神経内分泌腫瘍サンプルを用いる全ての実験は、アイオワ大学病院および診療所IRB委員会(議定書番号199911057)によって承認されている。すべての材料と機器のリストは、材料の表に記載されています。成長メディアと主要なソリューションの一覧を表 1に示します。

1. 小腸神経内分泌腫瘍(SBNET)コレクションと細胞解離

1. 外科病理学の中心からの腫瘍組織の確認の後に切除された患者SBNETのサンプルを得る。
2. SBNETを5mmの立方体にカットし、DMEM/F12培地の25 mLを円錐形のチューブに入れて保管し、実験室への輸送を行います。
3. 1%FBSを含むDMEMで腫瘍を転写し、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(ペン/ストレプ)、1%グルタミン(洗浄培地)を含み、この洗浄媒体で15分間インキュベートする。
4. 生殖不能の湾曲したはさみを使用して、腫瘍を新しい皿とミンチ腫瘍に1mm未満に移します。
5. 25 mLの洗浄媒体を含む新しい50 mLチューブにひき刻まれた組織を移します。
6. 4°Cで15分間500 x gでサンプルを遠心分離します。
7. 上清を廃棄し、コラゲナセ(100U/mL)とDNase(0.1mg/mL)を含む洗浄媒体の10 mLでペレットを再懸濁します。
8. みじん切り腫瘍の消化を37°Cインキュベーターで1.5時間のゆっくりと振る(50rpm)で消化できるようにします。

2. ECMにおける腫瘍スフェロイドとしてのSBNTの培養

1. 消化が完了した後(ステップ1.8)、4°Cで15分間500 x gで遠心分離機を、上清を廃棄し、洗浄媒体の15 mLでペレットを再懸濁する。
2. 新しい50 mLチューブの上に70 μmのセルストレーナーを置き、セルストレーナーの上に洗浄媒体の10 mLを移します。洗浄媒体を旋回してプラスチックチューブの側面を覆い、NET細胞がプラスチックチューブの側面に付着するのを防ぎます。
3. セルストレーナーを介してセル懸濁液をフィルタリングします。
4. 4°Cで15分間500xgで遠心分離機を廃棄し、洗浄媒体の200μL(総容積は〜250μL)でペレットを再懸濁し、氷の上に置きます。
5. 洗浄培地の500μL(1/100希釈係数)に5μLの細胞を移します。血球計を用いて希釈した細胞を使用して、1ミリリットル当たりの細胞数を得る。希釈係数を補正するには、100 を掛けます。
6. ステップ 2.5 で得られた mL 当たりのセル数に、ステップ 2.4 (~250 μL) で得られた懸濁液中の細胞の総体積を乗算します。
7. 4°Cで15分間500xgで遠心分離機を使用し、上清を廃棄し、液体ECM(1 x 10⁶細胞/mL)で細胞を再懸濁し、氷の上に保ちます。
8. ECMのSBNETスフェロイドの5-20 μLを96ウェルプレートに移し、37°Cのインキュベーターにプレートを5分間入れることで液体ECMを固化させます。
9. SBNET培養培地の200 μL(DMEM/F12 + FBS + 1% PEN/STREP + 1% グルタミン + 10 mM ニコチンアミド + 10 μg/mLインスリン) をECMのSBNETスフェロイドを含む96ウェルプレートの各ウェルに添加します。
10. あるいは、ヒト肝臓または膵臓オルガノイ^ド9を増殖させるために以前に記載されているものと同様の幹細胞培地中の培養SBNETオルガノイドは、材料の表に記載されている。
11. 5~7日ごとにメディアを変更します。

3. ImageJを用いたSBNETスフェロイドサイズの定量化

1. 10倍の目的を使用して、文化の1日目、4、7、14、23、97でSBNETのスフェロイドの5-10枚の写真を撮ります。
2. ImageJ で保存したイメージを開きます。[分析]タブに移動し、[測定値の設定]オプションを選択し、[エリア]オプションをオンにします。
3. ツール バーの楕円形選択ツールを使用して、よく焦点を合わせた回転楕円の周囲に楕円または円を生成します。
4. [分析]タブに移動し、[測定]オプションを選択します。25~50 SBNETスフェロイドから面積測定を取得するには、手順 3.4 と 3.5 を繰り返します。値はピクセル二乗で指定されます。
5. 各ピクセルのサイズを各ピクセルの長さで、顕微鏡画像の μm 変換係数に分割して、ピクセル領域を μm²に変換します。
   注:SBNET細胞は主にスフェロイドとして成長し、いつかは楕円体として成長します。

4. 免疫蛍光によるSBNETSスフェロイドの特性

1. ECMで成長したオルガノイドをP1000ピペットを使用して1.5 mLチューブに移します。
2. 1分間1,500 x gで遠心分離機を取り出し、上清を取り除きます。
3. 1 mLのPBSを加えてオルガノイド培養物を洗浄し、1分間1,500xgで遠心分離機を混合し、上清を除去する。
4. 4%パラホルムアルデヒドの500 μLを加えてオルガノイドを固定し、15分間インキュベートします。
5. PBSの1 mLで培養物を2回洗います。
6. PBS + 3% BSA + 0.1% トリトン X 100 を 5 分間添加して培養物を透過化します。
7. その後、PBS+3%BSAの1 mLで3回洗浄します。
8. シナプトフィシン(SYP)10で1/600希釈またはクロモグラニンA(CgA)11およびソマトスタチン受容体2(SSTR2)12で1/400希釈抗体バッファー(2.5%ウシヌメシン、0.1ナトリウム)に対する一次抗体で1時間インキュベートアジド、25 mMトリスpH 7.4、150mM塩化ナトリウム)。
   注: チューブあたり 300 μL 以上の抗体溶液を使用します。
9. PBS + 3% BSAの1 mLで3回洗浄します。
10. 抗体バッファー内の1/500希釈でFITCに結合した二次抗体を1時間1時間インキュベートし、チューブ当たり300μL以上の抗体溶液を使用する。
11. PBS + 3% BSAの1 mLで3回洗浄します。すべての上清を吸引し、廃棄することを確認してください。
12. 核汚れをDAPIに含む取り付け媒体を5μL加えます。
13. P20ピペットを使用して、ステップ4.12からSBNETスフェロイドの5 μLをガラススライドに転送し、カバースリップでシールします。
14. 10x、20xまたは40xの目的を使用して蛍光顕微鏡を使用して画像を撮ります。

5. SBNETスフェロイドの免疫組織化学による特性化(IHC)

1. P1000ピペットを使用して、培養プレートから1.5 mLチューブにSBNETスフェロイドを移します。
2. 1分間1,500 x gで遠心分離機を取り出し、上清を取り除きます。
3. ステップ5.2からチューブに10%ホルマリンの500 μLを加え、パラフィン埋め込み前に2~5日間室温でインキュベートし、4μmの厚いスフェロイドセクションを切断してSBNETスフェロイドを修正します。
4. 3-in-1自動スライド処理ステーションを使用して20分間97°Cに加熱することにより、pH9の抗原検索液における熱誘発エピトープ検索を脱パラフィン化、再水和、および使用して、抗体インキュベーション用のスライドを調製します。
5. SYP¹⁰に対する一次抗体を15分間、CgA¹¹を15分間1/800希釈、SSTR2¹²を1/5,000希釈で30分間ブロックし、インキュベートします。
6. 抗SYPおよびCgA染色のための15分間、抗SSTR2染色のための30分のための二次抗体検出システムでインキュベートする。400倍の目的を使用して写真を撮ります。

6. ラパマイシンによるSBNETオルガノイドの治療

1. DMSOでラパマイシンを溶解し、10mMのストック溶液を得る。
2. DMSOを使用してSBNET培養培地を調出し(例えば、SBNET培養培地の1mL+DMSOの1μL)と10μMのラパマイシンを含むSBNET培養培地(例えば、SBNET培養培地の1mL+1μLの1μL)を調出す。
3. DMSOまたは10 μMラパマイシンを使用してSBNET培養培地を使用して200 μL培地をSBNETスフェロイド培養物に転送します。
4. SBNETスフェロイドを37°Cインキュベーターで5日間インキュベートします。
5. エチジウムホモジマーの1 μMを追加し、30分間インキュベートエチジウムホモジマーを含む培地を取り出し、200μLのPBSで洗浄し、各ウェルに200μLのPBSを移します。
6. 蛍光顕微鏡の10x、20x、または40倍の目的を持つ赤いフィルターキューブを使用して薬物治療の有無にかかわらずSBNETスフェロイドの顕微鏡画像を撮ります。
   注:エチジウムホモジマーで染色された死細胞は、市販の顕微鏡の赤色フィルターキューブGを使用して赤色で表示されます(材料の表)。あるいは、信号は535 nm励起および624 nm放出の分光光度計を使用して捕獲することができる。

7. SBNET スフェロイドの分割

注:これは、拡張のために、他の研究者との共有のために行われます。

1. P1000ピペットを使用してECMを機械的に破壊し、SBNETのスフェロイドでECMを無菌の1.5 mLチューブに吸引します。
2. 4°Cで1,000 x gで遠心分離機を取り除き、すべての上清を取り除き、チューブを氷の上に置きます。
3. ペレットに新しいECMの体積を2~4倍に加えます。新しい ECM を古い ECM と SBNET のスフェロイドとミックスして、上下 10x をピペッティングします。気泡の導入を避ける。
4. ECMおよびSBNETスフェロイド混合物の5-20 μLを新しいプレートに移し、ECMが固化することを可能にする。
5. 新しいSBNET媒体でカバーし、インキュベーターに転送します。回収率は約95~100%です。
6. SBNET スフェロイドを別のラボに出荷する場合は、新しい ECM を使用して SBNET スフェロイドを T25 フラスコに転送し、ECM を固化します。
7. T25フラスコをSBNETのスフェロイド媒体で満たし、キャップのネジをしっかりと入れ、出荷パッケージを準備します。
8. SBNET スフェロイド培養を受け取った後、培養培地を取り外し、ステップ 7.1 ~ 7.5 を実行して、SBNET スフェロイドを培養に戻します。

8. SBNETスフェロイドの凍結貯蔵と回収

1. SBNETのスフェロイドを5~10の小さな井戸から15 mLの管に移します。4°Cで15分間500xgで遠心分離機を除去し、凍結培地(90%FBS + 10%DMSO)で再中断し、細胞凍結容器に保存し、-80°Cに置きます。
2. 液体窒素に移して長い貯蔵を行う。
3. SBNETのスフェロイドを回収するには、凍結したバイアルを氷の上に置き、内容が完全に解凍されるまで待ちます。チューブを反転し、解凍プロセスをスピードアップするために氷の上に再配置します。
4. サンプルが解凍されたら、予め冷やされた遠心分離機の中に入れ、10分間1,000 x gで回転させます。
5. 上清を取り除き、ECMでスフェロイドを再中断します。チューブを氷の上に置き、20 μLを新しいプレートに移し、ECMが固化するのを待ちます。
6. ROCK阻害剤(Y-27632)13の10μMを持つSBNET培養培地の200μLを200μLに転送し、インキュベーターに移す。
7. SBNET スフェロイドの回復と成長を 1 週間許可します。古い培養培地を取り出し、200μLのSBNET培養培地で補充し、インキュベーターに戻す。
8. SBNET スフェロイドが成長し続けることを許可します。
   注:急速に成長するスフェロイドが凍結保存後に回復し始めるのに少なくとも1週間^{かかります13.}SBNETのスフェロイドは成長を開始するのに最低2〜4週間かかります。多くのSBNET細胞は最初の2週間以内に死亡し、生存率は10%未満である。これは非常に時間がかかり、低収量プロセスであるため、培養フラスコで他の研究者SBNETスフェロイドと共有することをおりかねます(ステップ7で説明)。凍結貯蔵と回収は、細菌汚染が発生した場合のバックアップ計画としてのみ使用してください。

結果

現在、2、3、4、5のSBNET細胞株は2つしか確立^{され、公開されており、}多くの研究者が容易に利用できるわけではありません。ここでは、ECMにおけるスフェロイドとしての培養SBNETを提案し、これをSBNET薬物感受性を研究する代替モデルとして用いる。肝臓に転移したSBNET由来の患者由来腫瘍を採取し...

ディスカッション

腫瘍3D培養は、前臨床薬物^検査15のための貴重なリソースとなっている。乳癌および前立腺癌腫瘍16,17から様々な腫瘍オルガノイドバイオバンクが最近確立されている。本研究では、SBNETをスフェロイドとして培養するための詳細なプロトコルと、免疫蛍光と試験薬物感受性によってNETマーカーのスフェロイド培養を検証する簡単か...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-rabbit FITC	Jackson ImmunoResearch	11-095-152	Secondary antibody couple to a green fluorophore
Antigen Retrieval Solution	Agilent Dako	S2367	Solution at pH 9 for preparing slides for IHC
Autostainer Link 48	Agilent Dako	Not Available	Automated system for antibody staining
Cell freezing container	Thermo Scientific	5100-0001	Container to for freezing cells
CellSence	Olympus	Version 1.18	Computer software for using fluorescent microscope
Chromogranin A antibody	Abcam-45179	RB-9003-PO	Antibodies for IF
Chromogranin A antibody (clone LK2H10)	Thermo Scientific	MA5-13096	Antibodies for IHC
Collagenase	Sigma	C0130	Enzyme for digesting tumor tissue
DMEM	Gibco	11965-092	Medium for tissue preparation
DMEM/F12	Gibco	11320-033	Medium for organoid cultures
DMSO	Sigma	D8418	Solvent for dissolving drug
DNAse	Sigma	DN25	Enzyme for digesting tumor tissue
Ethidium Homodimer	Chemodex	CDX-E0012-T1E	DNA and RNA binding dye
FBS	Gibco	16000044	Reagent for culture media
Fluorescent microscope	Olympus	CKX35	Microscope for taking pictures of SBENT spheroids
Glutamine	Gibco	A2916801	Reagent for culture media
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.51	Computer software for image analysis
Insulin	Sigma	I0516	Reagent for culture media
Matrigel	Corning	356235	Matrix to embed and anchore organoids
Mounting medium (VECTASHIELD)	Vector Laboratories	H-1200	Fixative for labelled-cells with a nuclear stain
Nicotinamide	Sigma	72340	Reagent for culture media
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Reagent to fix cells
PEN/STREP	Gibco	15140-122	Reagent for culture media
PT Link	Agilent Dako	Not Available	Automated system to prepare slides for IHC staining
Rapamycin	Alfa Aesar	J62473	Drug that can inhibit NET growth
Secondary antibodies for IHC	Agilent Dako	K8000	Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system
SSTR2 antibody	GeneScritp	A01591	Antibodies for IF
SSTR2 antibody (clone UMB1)	Abcam	ab134152	Antibodies for IHC
Synaptophysin antibody	Abcam	32127	Antibodies for IF
Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP)	Agilent Dako	M7315	Antibodies for IHC
TritonX	Mallinckrodt	3555 KBGE	Reagent to permeablize cells
Y-2763 ROCK inhibitor	Adipogen	AG-CR1-3564-M005	To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw