毛因神经发生期间诺奇信号动力学的实时生物发光成像

摘要

神经干细胞/祖细胞表现出Notch信号分量的各种表达动力学，导致细胞事件的不同结果。这种动态表达可以通过实时监测，而不是静态分析来显示，使用高度敏感的生物发光成像系统，能够可视化基因表达的快速变化。

摘要

Notch信号通过细胞-细胞相互作用调节神经干细胞/祖细胞的维持。Notch 信令的组件表现出动态表达式。槽口信号效应器 Hes1 和 Notch 配体增量类似 1 （Dll1） 在神经茎/祖细胞中以振荡方式表示。由于这些基因的振荡表达周期很短（2小时），因此很难监测它们的循环表达。为了检查基因表达或蛋白质动力学的这种快速变化，需要快速响应报告器。由于其快速成熟动力学和高灵敏度，生物发光报明酶适用于监测活细胞中快速的基因表达变化。我们使用不稳定的荧光素酶报告器来监测促进者活动，使用荧光素酶融合报告器在单个细胞分辨率下可视化蛋白质动力学。这些生物发光记者显示快速周转，并产生非常微弱的信号;因此，我们开发了一个高度敏感的生物发光成像系统来检测这种微弱的信号。这些方法使我们能够监测活细胞和组织的各种基因表达动力学，这是帮助了解实际细胞状态的重要信息。

引言

哺乳动物的大脑由大量不同类型的神经元和胶质细胞组成。所有细胞都是从神经干细胞/祖细胞（NPC）生成的，这些细胞首先增殖以扩大其数量，然后开始分化成神经元，最后产生胶质细胞^{1、2、3、4、5。}一旦细胞分化成神经元，它们就不能增殖或增加其数量，因此，在后期阶段维持NPC是很重要的。通过细胞-细胞相互作用的槽口信令在维持^NPC6，7中起着重要的作用。凹槽配体与邻近细胞表面的膜蛋白Notch相互作用，并激活Notch蛋白。激活后，诺奇蛋白发生蛋白解解，从而将Notch（NICD）的细胞内域从细胞膜释放到细胞核^8、9、10中。在核中，NICD与Hes1和Hes5（Hes1/5）的启动子区域结合，并激活这些基因的表达。 Hes1/5抑制前神经基因Ascl1和Neurogenin1/2（Neurog1/2）^的表达11，12，13，14。由于前神经基因诱导神经元分化，Hes1/5在维持NPC中起着至关重要的作用。此外，由于前神经基因可以激活诺奇配体三角洲（Dll1）的表达，Hes1/5还抑制Dll1的表达。因此，Dll1的表达导致通过Notch信令对Dll1的相邻细胞呈阴性。这样，细胞会抑制相邻细胞遵循其相同的命运，这种现象称为横向抑制^8。在发育中的大脑中，横向抑制在产生各种不同的细胞类型方面起着作用。

在单个单元水平上的实时成像揭示了^{NPC15、16、17}中Notch信号分量的动态表达。Notch信号激活Hes1的表达，但Hes1蛋白与它自己的启动子结合并抑制它自己的表达。此外，Hes1是一种极不稳定的蛋白质，由泛基蛋白-蛋白酶体通路降解;因此，对自身促进者的压制只是短暂的，然后转录又开始了。这样，Hes1的表达在2小时周期¹⁸的转录和平移水平上振荡。Hes1的振荡表达，反过来，通过周期性抑制15，16，17，19，诱导下游目标基因的振荡表达，如Ascl1，Neurog2和Dll1。 虽然前神经基因可以诱导神经元分化，但振荡表达不足以进行神经元分化;而是它们的持续表达对神经元分化至关重要。前神经基因的振荡表达对于维持NPC很重要，而不是诱导神经元分化14，15，16。Dll1的表达在各种形态形成（如神经发生和躯体发生）期间在转录和转化水平上振荡。Dll1的动态表达对Dll1的正常形态发生和稳定表达具有重要的诱导神经发生缺陷和躯体发生^缺陷17。这些发现证明了基因表达和蛋白质动力学对调节各种发育事件（即不同的表达动力学在细胞行为中产生不同输出）的重要作用。

为了分析Notch信号的动态，组织和细胞的静态分析是不够的，因为它们在不断变化。单细胞的实时成像是揭示基因表达动态的有力工具。Notch信号分子的动态表达在2-3小时周期内发生快速循环反应。这种快速的周期性表达为实时监测带来了两个难题:（1）分子的表达被抑制到低水平，（2）快速周转需要快速响应的记者从。为了克服这些问题，我们之前开发了一种生物发光实时成像方法^20。由于生物发光报告仪比荧光报仪具有更高的灵敏度和较短的成熟时间，因此这种策略使我们能够监测活细胞的快速动力学。使用实时可视化，我们发现更多的基因表现出动态表达比我们之前认为的。此外，显示活细胞表达和蛋白质动力学的报告数量以及这些动力学在各种生物事件中的重要性有所增加，这表明动力学在基因表达中的基本作用^21，22。

在本报告中，我们描述了一种在分离区域性和皮质切片培养中可视化 NPC 中 Notch 配体 Dll1 表达式的方法。为了监测单细胞水平Dll1转录的动态，我们产生了从携带pDll1-Ub-Fluc报告器的转基因小鼠的胚胎端管中衍生的NPC分离培养物，该实验鼠是Dll1启动子驱动的不稳定的荧光酶报告者。为了监测体内的Dll1蛋白动力学，我们将Dll1-Fluc融合报告器引入皮层中的NPC，并可视化了报告器在皮质切片培养中的NPC的表达。实时成像使我们能够以高时间分辨率捕捉活细胞中基因表达和蛋白质动力学的各种特征。

研究方案

所有程序，包括动物科目，都通过了京都大学前沿生命与医学研究所的动物护理和使用委员会的批准。

1. 生物发光记者

注: 荧光素酶报通过融合降解信号，可用于测量启动子活性的快速动态。此外，荧光素酶融合报告器能够监测单个细胞中的蛋白质动力学。这两种类型的报告可用于单层培养（分离培养）和组织培养（切片培养）实验。

1. 记者监测Dll1促进者活动¹⁷
   注:要监测基因表达的快速变化，快速响应和不稳定报告器至关重要。萤火虫荧光素（Fluc）与荧光荧光素记者相比，其快速成熟。由于泛素融合荧光素（Ub-Fluc）显示快速降解和快速周转，因此监测活细胞²⁰中的动态基因表达非常有用。
   1. 使用Dll1启动子驱动的不稳定荧光酶报告器，泛素荧光素酶（pDll1-Ub-Fluc，图1A上面板），监测Dll1表达在转录级别¹⁷的快速变化。
   2. 生成一个携带pDll1-Ub-Fluc的转基因小鼠线，供本文台记者稳定表达。
2. 记者为监测Dll1蛋白质动力学^17。
   1. 对于一代敲入小鼠，将荧光素酶cDNA插入Dll1编码区域的3°termini中，以便表达Dll1-荧光酶融合蛋白（Dll1-Fluc报告器，图1A，下面板^）17。
   2. 通过测量荧光素酶活性，监测蛋白质水平Dll1的表达动态。
   3. 为了在组织水平上监测Dll1蛋白动力学，通过子宫电穿孔将Dll1-Fluc报告器引入胚胎端脑的NPC。

2. 生物发光成像系统

1. 使用装有高灵敏度水冷 CCD 相机的倒置显微镜构建生物发光实时成像系统。为了降低噪音并获得高灵敏度，在-90°C的优化温度下，用水循环器提供的冷水冷却相机。
2. 对于活细胞/组织成像，将孵育系统安装到显微镜阶段，控制温度和混合气体。
3. 为了成像不稳定的荧光素酶的表达，请使用高数值角（NA:1.30）40倍油浸物物镜。该镜头的工作距离为0.2 mm，不仅可用于单层细胞培养，还可用于切片培养。
4. 对于荧光素酶和荧光素报告器表达的双重监测，请将 LED 照明装置安装到显微镜的光路径上。
5. 使用与显微镜相关的软件（例如，MetaMorph 软件的多维采集程序）控制延时成像。
6. 准备在黑暗的房间里整个系统，因为不稳定的荧光素酶报告器的信号是非常微弱的，并避免多余的光阻止获取。

3. 神经干细胞/祖细胞 （NPC） 分离培养物

1. 培养文化媒介、菜肴和试剂，促进人大分离文化
   1. 制备N2/B27培养神经干细胞/祖细胞，最终浓度为1xN2、1x B27、1mM N-乙酰半胱氨酸、10纳克/mL bFGF和50U/mL青霉素/链霉素。
   2. 在EBSS介质中制备含有7U/mL木瓜素、0.006%DNase和1 mM N-乙酰半胱氨酸的分离剂的木瓜溶液。
   3. 准备100 mM的荧光素钠溶液，用于发光成像。在N2/B27介质中稀释100 mM荧光素溶液，最终浓度为1 mM。
      注:路西法林显示自动荧光素本身。在荧光素荧光双成像的情况下，特别是EGFP，将荧光素的浓度降低至0.5 mM更好。
   4. 在室温下涂上 35 毫米玻璃底盘（玻璃直径 27 毫米），并涂上 40 μg/mL 聚L-莱辛 （PLL） 溶液 1 小时。孵育后，用PBS清洗板3x，让它干燥。
2. 胚胎的解剖和NPC的分离
   1. 对怀孕的pDll1-Ub-luc转基因小鼠（胚胎日12.5（E12.5）实施_CO2窒息和宫颈脱位后，切开腹部并切除子宫。
      注:研究人员必须遵守其机构动物研究委员会的法规和准则。如果使用麻醉或止痛药，则正确使用。
   2. 将子宫转移到含有25 mL的25 mL的培养皿中。用微剪刀和细钳从子宫中提取胚胎，在冰冷的PBS中。
   3. 用剪刀切断每个胚胎的头部，并将其移植到含有冰冷的DMEM/F12的10厘米培养皿中。去除大脑周围的表皮和软骨，并将大脑转移到含有35毫米培养皿的含有3mL的N2/B27介质。
   4. 切断左右端脑素从二脑素 （图 1Ba-f， C， D）.使用细钳去除覆盖端脑表面的脑皮（图1Bi）。再次使用细钳，从端管取下皮层的侧侧部分（图1Bg，h，j-l E）。
   5. 使用 P1000 移液器将组织转移到新的 1.5 mL 管中，并使用 P200 移液器去除任何多余的介质。每个脑组织（一对皮层）添加0.1 mL的木瓜溶液。在24°C孵育15分钟后，用P1000移液器轻轻移液样品10次。在24°C下再次孵育样品15分钟。
   6. 使用 P1000 移液器轻轻移液样品 10 次。在 400 x g和室温 （RT） 下使样品离心 3 分钟。丢弃上清液。
   7. 向颗粒中添加 1 mL 的 DMEM/F12 介质。使用 P1000 移液器轻轻移液器 10 次。在400 x g和RT下将样品离心3分钟。丢弃上清液。重复此操作至少 2 次。
   8. 在颗粒中，加入含有 1 mM 荧光素的 0.5 mL 的 N2/B27 介质，并混合均匀。将细胞（1 x 10⁶细胞）播种到 PLL 涂层玻璃底盘中。在_CO2培养箱中培养细胞 1 小时。一旦细胞粘附到培养皿中，加入2 mL的N2/B27介质，含有1 mM荧光素。
3. 人大解构文化中荧光酶记者表达的可视化
   1. 在执行解剖之前启动发光实时成像系统。对于NPC培养，将舞台培养箱的温度设定为37°C，并将气体混合物的设定设置为20%O_2，CO2。
   2. 将浸入油放入物镜。将样品盘放在显微镜台上。手动查看字段并选择感兴趣单元格的最佳位置和焦点。单击实时以获取测试映像。
   3. 通过多维采集程序运行 24 小时二维（发光和明亮场）采集的延时采集。选择多维采集计划，然后按照如下方式设置采集设置（步骤 3.3.6）。
   4. 对于发光图像采集，请使用以下摄像机设置:低传输速率（50 kHz）、2 x 2/4 x 4 分箱、10 分钟/5 分钟曝光时间。对于亮场图像采集，请使用以下设置:中间传输速率（1 MHz）、1 x 1 分箱和 100 ms 曝光时间。

4. 子宫电穿孔

注:这是为将Dll1-Fluc报告器引入神经祖细胞而执行的。

1. 用于电穿孔的工具和试剂的制备
   1. 准备微毛细血管，将DNA注入胚胎端脑心室。用热拉伸草毛细管，用抛光机切割和抛光其尖端。
   2. 准备DNA与染料的混合物（例如，试青蓝）。每个DNA在PBS中的浓度为1μg/μL，并将染料添加到10%的最终浓度。
      注:使用DNA混合物对Dll1蛋白动力学进行可视化如下:Dll1-Fluc（Dll1蛋白报告器，图2E上部）和pEF-EGFP（EF启动子驱动EGFP表达载体，图2E下部），监测转染细胞的位置和形态。
   3. 准备两种类型的麻醉剂:3.88毫克/mL的五巴比妥和0.12%的木尔他辛，在无菌1xPBS。
   4. 在手术过程中使用无菌器械和手术手套。
2. 在子宫电穿孔
   1. 通过麻醉剂内给麻醉剂麻醉时间怀孕的ICR小鼠（E12.5），使用500μL的3.88mg/mL五巴比妥和500μL的0.12%木氨酸。
      注:研究人员必须遵守动物实验的规定。如果一个人需要使用麻醉或止痛药，正确使用。
   2. 用手术擦洗夹头发和消毒皮肤。
   3. 检查脚趾捏反应无。一旦不观察到踏板反射，沿着中线穿过腹部2-3厘米。在解剖部分周围放置纱布，用温暖的 PBS 将纱布弄湿，不要弄干切口。用环状钳子轻轻拿出右子宫角，并计算胚胎数量。
   4. 用微毛细管轻轻地将1-2 μL的混合DNA注射到胚胎的端管心室。
      注:注射成功后，可以看到子宫表面染料的蓝色。
   5. 在提供电压脉冲之前，先将子宫和电极弄湿，然后轻轻握住胚胎的头部。将带正电荷的电极设置到半球的一侧，在半球中注入DNA。确保电穿孔脉冲条件为 30-50 V，为 50 ms，脉冲间隔为 1 s（50 ms 充电和 950 ms 非电荷）。向一个胚胎提供5个脉冲，并检查气泡是来自带负电荷的电极产生的。
      注:确保电极的方向:DNA被合并到正电极侧面的细胞中。在此过程中，请勿移动电极的位置。
   6. 对其他胚胎重复步骤4.2.3-4.2.4，并将子宫角返回到腹腔。对左子宫角的胚胎进行相同的程序。
   7. 放回左侧后，用针（17 毫米）缝合丝缝合（4-0）。完全关闭切口之前，将温暖的PBS放入腹腔
      注:缝合间隔约为 2 mm。
   8. 完成手术后，将鼠标放在加热垫上，以便麻醉后恢复。单独容纳鼠标。
      注:研究人员必须遵守他们当地对动物实验的教规。如果一个人需要使用止痛药，正确使用。

5. 皮质切片培养的制备和皮质切片中荧光酶报告器表达的可视化

1. 培养培养物和试剂的制备，用于皮层切片培养
   1. 在N2/B27培养剂中制备含有5%胎儿牛血清和5%马血清的皮质切片的浓缩培养剂。
   2. 通过 DMEM/F12 介质将 100% O₂气体用于解剖和制作皮质切片。
      注:为了安全使用氧气，将 O₂气缸存放在气缸柜中，并通过氧气浓度计监控空气中的氧气浓度。
   3. 在富集培养剂中稀释100 mM荧光素钠溶液，最终浓度为1 mM。
      注:路西法林显示自动荧光素本身。在荧光素荧光双成像的情况下，特别是EGFP，荧光素（0.5 mM）的浓度较低。
   4. 将多气体培养箱设置为 37°C 40% O₂和 5% CO₂。
2. 胚胎的解剖与荧光报告器表情的检查
   1. 在子宫电穿孔（步骤4.2）中，将记者（E13.5）引入的怀孕小鼠安乐死后，切开腹部并切除子宫。
      注:研究人员必须遵守动物实验的规定。如果使用麻醉或止痛药，应正确使用。
   2. 将子宫转移到含有PBS的10厘米培养皿中。用微剪刀和细钳从PBS的子宫中提取胚胎。切断每个胚胎的头部，并转移到含有DMEM/F12介质的10厘米培养皿中，该培养皿与100%O₂气体一起冒泡。在 DMEM/F12 介质中去除大脑周围的表皮和软骨。
   3. 将大脑放在培养皿的盖子上，用环形钳子，将盖子放在荧光立体显微镜台上。检查激发光下表达荧光蛋白的皮层区域（图2A，B）。
   4. 将大脑转移到硅橡胶切割板上，板上装有 30 mL 的 DMEM/F12 介质，带有 100% O₂气体。用细钳去除覆盖端脑表面的脑皮。
   5. 使用微手术刀或细钳切割背端脑的中侧部分和侧侧之间的边界，并分离成两个半球。使用微型手术刀，像条纹一样切开皮层，做皮质切片（图2C，D）。使用移液器使用介质的移液器切片，并将其转移到 35 mm 盘中的浓缩介质中。
   6. 将切片放在具有丰富介质的玻璃底盘中的培养器上。使用细钳校正切片的方向。将切片的切割曲面设置为区域性插入曲面。用移液器取出额外的介质。在37°C下由40%O₂和5%CO₂设置的多气体培养箱中孵育切片30分钟。
   7. 在玻璃底盘中插入的培养物外侧添加含有 1 mM 荧光素的浓缩介质 300 μL。
3. 切片区域性中荧光酶报告器表达式的可视化
   1. 在开始解剖之前，启动发光实时成像系统。使用皮质切片培养物的以下条件:40% O_2、5%CO₂和 37 °C。
   2. 将浸入油放入 40x 物镜。将样品盘放到显微镜的舞台上。采集荧光测试图像，在激发光的照射下，将位置和焦点平面设置到感兴趣的区域。
   3. 通过 3-延迟（发光、荧光和亮场）采集运行延时采集 24 小时（图 2F-H）。对于发光图像采集，请使用以下摄像机设置:低传输速率（50 kHz）、2x2/4x4 分箱、10 分钟/5 分钟曝光时间。对于荧光和明亮场图像采集，请使用以下设置:中间传输速率（1 MHz）、1x1 分箱和 100 ms 曝光时间。

6. 图像处理和分析

1. 连接每个图像并制作堆栈映像。单击"从文件菜单导入图像序列（文件 |导入 |图像序列），并选择保存获取图像的文件夹。将文件名中包含的一些单词放入 F ile 名称包含 的列中。
2. 要消除生物发光图像上的宇宙射线噪声，请应用 ImageJ/Fiji 的SpikeNoise 滤波器插件。打开堆栈图像，然后单击"尖峰噪声过滤器"。
3. 应用Savitzky Golay临时滤波器插件，以获得清晰的报告器表达动态。打开堆栈图像，然后单击萨维茨基戈莱临时过滤器。
4. 要测量报告器表达式的强度，请对每个单元格应用Z 轴配置文件加插件。选择单元格并设置 ROIs、感兴趣的区域，然后单击Z 轴轮廓加 号。

结果

基因Hes1/7的表达表现出2小时振荡周期，在各种细胞系和细胞生成过程中。此外，振荡周期很短，其mRNA和蛋白质都极不稳定，半寿命在20分钟左右。如果使用反应缓慢的报告器，我们就无法追踪这种快速的动态，如果使用稳定的报告器，它会在基因表达振荡时逐渐积累。因此，记者必须迅速退化，以监测这些周期性表达基因的快速流动。为了克服这些问题，我们使用荧光酶报告器来监测振荡...

讨论

Notch信号的分量在发生过程中显示振荡表达同步，但在神经发生期间不同步，导致在后一种情况下通过静态分析捕获表达动力学的困难。因此，需要实时监控来揭示 Notch 信令分量（如Hes1和Dll1）的表达动态。由于Hes1和Dll1振荡的表达周期极短，因此需要大约 2-3 小时、快速响应和不稳定的报告器来监测其表达动态。为此，我们开发了生物发光报告仪和成像系统。生物发光?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioluminescence Imaging System
Chilled water circulator (chiller)	Julabo	Model: F12-ED
Cooled CCD camera	Andor Technology	Model: iKon-M 934
Incubator system	TOKAI HIT	Model: INU-ONICS
Inverted microscope	Olympus	Model: IX81
Inverted microscope	Olympus	Model: IX83
LED illumination device	CoolLED	Model: pE1
MetaMorph	MOLECULAR DEVICES	Model: 40000
Mix gas controller	Tokken	Model: TK-MIGM OLO2
Objective lens	Olympus	Model: UPLFLN 40X O
Preparations for Dissection
Dissection microscope	Nikon	Model: SMZ-2B
Fluorescence stereoscopic microscope	Leica	Model: MZ16FA
Fine forceps	DUMONT	INOX No.5
Scissors, Micro scissors
Forceps
Ring-shaped forceps
10-cm plastic petri dish	greiner	664160-013
35-mm plastic petri dish	greiner	627160
PBS	Nacalai Tesque	14249-24
DMEM/F12	invitrogen	11039-021
Reagents for NPC dissociation culture
B27 supplement	invitrogen	12587-010
bFGF	invitrogen	13256-029	Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS
D-luciferin	Nacalai Tesque	01493-85	Stock solution: 100mM in 0.9% saline
DNase	Worthington Biochemical Corporation	LK003172	Stock solution: 1000U/ml in EBSS
EBSS	Worthington Biochemical Corporation	LK003188
Glass bottom dish	IWAKI	3910-035
N2 supplement (100x)	invitrogen	17502-048
N-acetyl-cystein	Sigma	A-9165-25G
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LK003178	Stock solution: 7U/ml in EBSS
Penicillin/Streptmycine	Nacalai Tesque	09367-34
Poly-L-lysine	Sigma	P-6281	40 mg/ml in DW
Preparations for in utero electroporation
50-ml syringe	TERUMO	181228T
Electrode	Neppagene	7-mm
Electroporator	Neppagene	CUY21 EDIT
Forceps
Gauzes	Kawamoto co.	7161
Micro capillary	Made in-house
PBS	Nacalai Tesque	14249-24
Pentbarbital	Kyoritsuseiyaku	Somnopentyl
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Suture needle	Akiyama MEDICAL MFG. CO	F17-40B2
Xylazine	Bayer	Seractal
Preparations for Slice culture
10-cm plastic petri dish	greiner	664160-013
35-mm plastic petri dish	greiner	627160
Culture insert	Millipore	PICM01250
DMEM/F12	invitrogen	11039-021
Fetal Bovine Serum	Sigma	172012-500ML
Fine forceps	DUMONT	INOX No.5
Forceps
Horse Serum	Gibco	16050-122
Micro surgical knife	Alcon	19 Gauge V-Lance
Multi-gas incubator	Panasonic	MCO-5MUV-PJ
N2/B27 media	Made in-house		ref. NPC dissociatioin culture
PBS	Nacalai Tesque	14249-24
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Silicon rubber cutting board	Made in-house