Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Neurale Stamm-/Vorläuferzellen weisen verschiedene Expressionsdynamiken von Notch-Signalkomponenten auf, die zu unterschiedlichen Ergebnissen zellulärer Ereignisse führen. Eine solche dynamische Expression kann durch Echtzeitüberwachung und nicht durch statische Analyse mit einem hochempfindlichen Biolumineszenz-Bildgebungssystem, das die Visualisierung schneller Veränderungen von Genausdrücken ermöglicht, aufgedeckt werden.

Zusammenfassung

Die Notch-Signalisierung reguliert die Aufrechterhaltung von neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen durch Zell-Zell-Wechselwirkungen. Die Komponenten der Notch-Signalisierung weisen einen dynamischen Ausdruck auf. Notch-Signaleffektor Hes1 und der Kerbliganand Delta-like1 (Dll1) werden oszillatonisch in neuralen Stamm-/Vorläuferzellen exprimiert. Da die Periode der oszillatorischen Expression dieser Gene sehr kurz ist (2 h), ist es schwierig, ihre zyklische Expression zu überwachen. Um solche schnellen Veränderungen in der Genexpression oder Proteindynamik zu untersuchen, sind schnell reagierende Reporter erforderlich. Aufgrund seiner schnellen Reifungskinetik und hohen Empfindlichkeit eignet sich der Biolumineszenzreporter luciferase, um schnelle Genexpressionsänderungen in lebenden Zellen zu überwachen. Wir verwendeten einen destabilisierten Luziferase-Reporter zur Überwachung der Promotoraktivität und einen luziferase-gebundenen Reporter zur Visualisierung der Proteindynamik bei Einzelzellauflösung. Diese Biolumineszenz-Reporter zeigen einen schnellen Umsatz und erzeugen sehr schwache Signale; Daher haben wir ein hochempfindliches Biolumineszenz-Bildgebungssystem entwickelt, um solche schwachen Signale zu erkennen. Diese Methoden ermöglichen es uns, verschiedene Genexpressionsdynamiken in lebenden Zellen und Geweben zu überwachen, die wichtige Informationen sind, um die tatsächlichen Zellzustände zu verstehen.

Einleitung

Das Säugetiergehirn besteht aus einer großen Anzahl von verschiedenen Arten von Neuronen und Gliazellen. Alle Zellen werden aus neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen (NPCs) erzeugt, die sich zuerst vermehren, um ihre Anzahl zu erweitern, dann beginnen, sich in Neuronen zu differenzieren, und schließlich zu Gliazellen1,2,3,4,5führen. Sobald sich die Zellen in Neuronen differenziert haben, können sie sich nicht vermehren oder ihre Anzahl erhöhen, und daher ist die Aufrechterhaltung von NPCs bis zu späteren Stadien wichtig. Die Notch-Signalisierung über Zell-Zell-Interaktionen spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der NPCs6,7. Kerbliganden interagieren mit dem Membranprotein Notch auf der Oberfläche benachbarter Zellen und aktivieren das Kerbprotein. Nach der Aktivierung tritt eine Proteolyse des Kerbproteins auf, wodurch die intrazelluläre Domäne von Notch (NICD) aus der Zellmembran in den Zellkern8,9,10freigesetzt wird. Im Kern bindet NICD an die Förderregionen Hes1 und Hes5 (Hes1/5) und aktiviert die Expression dieser Gene. Hes1/5 unterdrücken die Expression der proneuralen Gene Ascl1 und Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Da proneurale Gene neuronale Differenzierung induzieren, spielen Hes1/5 eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung von NPCs. Da proneurale Gene die Expression des Kerbliganden Delta-like1 (Dll1) aktivieren können, reprimiert Hes1/5 auch die Expression von Dll1. Daher führt die Expression von Dll1 dazu, dass benachbarte Zellen für Dll1 über Notch-Signalisierung negativ sind. Auf diese Weise hemmen Zellen benachbarte Zellen daran, ihrem gleichen Schicksal zu folgen, ein Phänomen, das als laterale Hemmung bekannt ist8. Im sich entwickelnden Gehirn spielt die laterale Hemmung eine Rolle bei der Erzeugung verschiedener Zelltypen.

Die Echtzeit-Bildgebung auf Einzelzellebene zeigt dynamische Ausdrücke der Komponenten der Notch-Signalisierung in NPCs15,16,17. Notch Signalisierung aktiviert die Expression von Hes1, aber Hes1 Protein bindet an seinen eigenen Promotor und unterdrückt seinen eigenen Ausdruck. Darüber hinaus ist Hes1 ein extrem instabiles Protein, das durch den Ubiquitin-Proteasomen-Weg abgebaut wird; Daher ist die Repression des eigenen Förderers nur von kurzer Dauer und dann beginnt die Transkription wieder. Auf diese Weise oszilliert der Ausdruck von Hes1 sowohl auf der Transkriptions- als auch auf der Translationsebene in einem 2 h-Zyklus18. Die oszillierende Expression von Hes1 wiederum induziert die oszillierende Expression der nachgeschalteten Zielgene, wie Ascl1, Neurog2 und Dll1, durch periodische Repression15,16,17,19. Während proneurale Gene neuronale Differenzierung induzieren können, reicht ihre oszillierende Expression für eine neuronale Differenzierung nicht aus; vielmehr ist ihr nachhaltiger Ausdruck für die neuronale Differenzierung unerlässlich. Die oszillatorische Expression von proneuralen Genen ist wichtig für die Aufrechterhaltung von NPCs und nicht für die Induktion neuronaler Differenzierung14,15,16. Die Expression von Dll1 oszilliert sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene während verschiedener Morphogenese, wie Neurogenese und Somitogenese. Die dynamische Expression von Dll1 ist wichtig für die normale Morphogenese und die stetige Expression von Dll1 induziert Defekte in der Neurogenese und Sogenese17. Diese Ergebnisse zeigen die wichtige Funktion, die die Dynamik der Genexpression und Proteinkinetik auf die Regulation verschiedener Entwicklungsereignisse hat (d.h. unterschiedliche Expressionsdynamiken erzeugen unterschiedliche Outputs im zellulären Verhalten).

Um die Dynamik der Notch-Signalisierung zu analysieren, reicht die statische Analyse von Geweben und Zellen nicht aus, da sie sich ständig ändern. Die Echtzeit-Bildgebung einzelner Zellen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Dynamik in der Genexpression zu offenbaren. Die dynamische Expression von Notch-Signalmolekülen erfährt im Zeitraum von 2-3 h schnelle zyklische Reaktionen. Diese schnelle periodische Expression stellt die Echtzeitüberwachung vor zwei schwierige Probleme: (1) Die Expression der Moleküle wird auf ein niedriges Niveau unterdrückt, und (2) ein schneller Fluktuation erfordert schnell reagierende Reporter. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir zuvor eine Biolumineszenz-Echtzeit-Bildgebungsmethode20entwickelt. Da der Biolumineszenzreporter eine höhere Empfindlichkeit und kürzere Reifezeit hat als fluoreszierende Reporter, ermöglicht uns diese Strategie, die schnelle Dynamik in lebenden Zellen zu überwachen. Anhand der Echtzeit-Visualisierung stellten wir fest, dass mehr Gene eine dynamische Expression aufwiesen, als wir bisher dachten. Darüber hinaus hat die Zahl der Berichte, die Expression und Proteindynamik in lebenden Zellen und die Bedeutung dieser Dynamik in verschiedenen biologischen Ereignissen zeigen, zugenommen, was auf eine grundlegende Rolle der Dynamik in den Genausdrücken21,22hindeutet.

In diesem Bericht beschreiben wir eine Möglichkeit, den Ausdruck der Kerb Liganden Dll1 in NPCs sowohl in dissoziierten Kulturen als auch in kortikalen Scheibenkulturen zu visualisieren. Um die Dynamik der Dll1-Transkription auf Einzelzellebenen zu überwachen, erzeugten wir dissoziierte Kulturen von NPCs, die aus dem embryonalen Telencephalon von transgenen Mäusen abgeleitet wurden, die pDll1-Ub-Fluc-Reporter trugen, einen Dll1-Promotor-gesteuerten destabilisierten Luziferase-Reporter. Um die Dll1-Proteindynamik in vivo zu überwachen, führten wir den Dll1-Fluc-Fusionsreporter in NPCs im Kortex ein und visualisierten den Ausdruck des Reporters in NPCs in kortikalen Scheibenkulturen. Die Echtzeit-Bildgebung ermöglichte es uns, die verschiedenen Merkmale der Genexpression und Proteindynamik in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung zu erfassen.

Protokoll

Alle Verfahren einschließlich tierischer Fächer wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Institut für Grenzleben und Medizinische Wissenschaften der Universität Kyoto genehmigt.

1. Biolumineszenz-Reporter

HINWEIS: Der luziferase-Reporter eignet sich zur Messung der schnellen Dynamik der Promotoraktivität durch Verschmelzung des Degradationssignals. Darüber hinaus ermöglicht der luziferase Fusion Reporter die Überwachung der Proteindynamik in der Einzelzelle. Beide Arten von Reportern stehen für einschichtige Kultur (Dissoziationskultur) und Gewebekultur (Slice-Kultur) Experiment zur Verfügung.

  1. Reporter zur Überwachung der Dll1-Promoteraktivität17
    HINWEIS: Um die schnellen Veränderungen der Genexpression zu überwachen, ist der schnelle und instabile Reporter unerlässlich. Firefly luciferase (Fluc) zeigt eine schnelle Reifung im Vergleich zu Fluorescein-Reportern. Da Ubiquitin verschmolzen Luziferase Reporter (Ub-Fluc) zeigt schnelle Abbau und schnelle Fluktuation, ist es sehr nützlich, die dynamische Genexpression in lebenden Zellen zu überwachen20.
    1. Verwenden Sie Dll1 Promoter-gesteuerte destabilisierte Luziferase Reporter, ubiquitinierte Luziferase (pDll1-Ub-Fluc, Abbildung 1Ein oberes Panel), um schnelle Veränderungen in Dll1-Expression auf einer Transkriptionsebene17zu überwachen.
    2. Generieren Sie eine transgene Mauslinie mit pDll1-Ub-Fluc für den stabilen Ausdruck dieses Reporters.
  2. Reporter zur Überwachung der Dll1-Proteindynamik17.
    1. Für die Erzeugung von Knock-in-Mäusen, legen Sie die Luziferase cDNA in die 3 " Termini der Dll1-Kodierungsregion, so dass Dll1-luciferase Fusion Protein exprimiert wird (Dll1-Fluc Reporter, Abbildung 1A, untere Platte)17.
    2. Überwachen Sie die Expressionsdynamik von Dll1 auf Proteinspiegel, indem Sie die Luziferase-Aktivität messen.
    3. Zur Überwachung der Dll1-Proteindynamik auf Gewebeebene führen Sie den Dll1-Fluc-Reporter durch Utero-Elektroporation in NPCs im embryonalen Telencephalon ein.

2. Biolumineszenz-Bildgebungssystem

  1. Konstruieren Sie ein Biolumineszenz-Live-Imaging-System mit einem invertierten Mikroskop, das mit einer hochempfindlichen, wassergekühlten CCD-Kamera installiert ist. Um das Rauschen zu reduzieren und eine hohe Empfindlichkeit zu erzielen, kühlen Sie die Kamera mit gekühltem Wasser, das vom Wasserzirkulator bei einer optimierten Temperatur von -90 °C bereitgestellt wird.
  2. Installieren Sie für die Live-Zell-/Gewebebildgebung das Inkubationssystem, das die Temperatur und das Mischgas steuert, auf die Mikroskopstufe.
  3. Für die Abbildung der Expression der destabilisierten luziferase Reporter, verwenden Sie hohen numerischen Winkel (NA: 1.30) 40x Öl-Immersion Objektiv linse. Der Arbeitsabstand dieser Linse beträgt 0,2 mm, sie ist nicht nur für die monoschichtige Zellkultur, sondern auch für die Scheibenkultur verfügbar.
  4. Zur doppelten Überwachung der Luziferase- und Fluorescein-Reporterexpression installieren Sie das LED-Beleuchtungsgerät am Lichtpfad des Mikroskops.
  5. Steuern Sie die Zeitraffer-Bildgebung mit einer Software, die mit dem Mikroskop verbunden ist (z. B. multidimensionales Erfassungsprogramm der MetaMorph-Software).
  6. Bereiten Sie das gesamte System in einem dunklen Raum vor, weil das Signal des destabilisierten Luziferase-Reporters sehr schwach ist, und um das fremde Licht zu vermeiden, die Erfassung zu verhindern.

3. Neuralstem/Progenitor Cell (NPC) Dissoziationskulturen

  1. Zubereitung von Kulturmedien, Geschirr und Reagenzien für die NPC-Dissoziationskultur
    1. Bereiten Sie N2/B27-Medien für die Kultivierung von neuralen Stamm-/Vorläuferzellen mit einer Endkonzentration von 1x N2, 1x B27, 1 mM N-Acetylcystein, 10 ng/mL bFGF und 50 U/mL Penicillin/Streptomycin in DMEM/F12-Medien vor.
    2. Bereiten Sie Papain-Lösung für die Dissoziation mit 7 U/ml Papain, 0,006% DNase und 1 mM N-Acetylcystein in EBSS-Medien.
    3. Bereiten Sie 100 mM Luziferin-Natriumlösung für die Lumineszenz-Bildgebung vor. 100 mM Luziferinlösung in N2/B27-Medien auf eine Endkonzentration von 1 mM verdünnen.
      HINWEIS: Luciferin zeigt Auto-Fluorescein selbst. Im Falle der Luziferase-Fluoreszenz Dual Imaging, insbesondere EGFP, senkt die Konzentration von Luziferin auf 0,5 mM ist besser.
    4. Beschichten Sie eine 35-mm-Glasbodenschale (Glasdurchmesser 27-mm) mit 40 g/ml Poly-L-Lysin (PLL)-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation die Platten 3x mit PBS waschen und trocknen lassen.
  2. Zerlegung von Embryonen und Dissoziation von NPCs
    1. Nach der Einschläferung einer schwangeren pDll1-Ub-luc transgenen Maus (Embryonaltag 12.5 (E12.5)) durch CO2-Erstickung und Zervixdislokation durch den Bauch schneiden und die Gebärmutter herausnehmen.
      HINWEIS: Die Forscher müssen die Vorschriften und Richtlinien des Tierforschungsausschusses ihrer Institution befolgen. Wenn Anästhesie oder Schmerzmittel verwendet werden, verwenden Sie sie richtig.
    2. Die Gebärmutter in eine 10 cm Petrischale mit 25 ml eiskaltem PBS geben. Nehmen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter in eiskaltem PBS, mit Mikroschere und feinen Zangen.
    3. Schneiden Sie den Kopf jedes Embryos mit einer Schere ab und übertragen Sie ihn auf 10 cm Petrischalen mit eiskaltem DMEM/F12. Entfernen Sie die Epidermis und den Knorpel, der das Gehirn umgibt, und übertragen Sie das Gehirn auf eine 35 mm Petrischale, die eiskalte 3 ml N2/B27-Medien enthält.
    4. Schneiden Sie das rechte und linke Telencephalon von Diencephalon ab (Abbildung 1Ba-f, C,D). Entfernen Sie die Meningen, die die Oberfläche von Telencephalon mit feiner Zange bedecken (Abbildung 1Bi). Mit feinen Zangen wieder, nehmen Sie den dorso-lateralen Teil des Kortex aus dem Telencephalon (Abbildung 1Bg,h,j-l E).
    5. Übertragen Sie das Gewebe mit einer P1000 Pipette in neue 1,5 ml-Rohre und entfernen Sie jedes zusätzliche Medium mit einer P200-Pipette. Fügen Sie 0,1 ml Papainlösung pro Hirngewebe (ein Paar des Kortex) hinzu. Nach 15 min Inkubation bei 24 °C die Proben 10 Mal mit P1000 Pipette vorsichtig pipette. Die Proben 15 min bei 24 °C erneut inkubieren.
    6. Die Proben mit der P1000 Pipette zehnmal sanft pipette. Zentrifugieren Sie die Proben für 3 min bei 400 x g und Raumtemperatur (RT). Entsorgen Sie den Überstand.
    7. Fügen Sie 1 ml DMEM/F12-Medien in das Pellet ein. Sanfte Pipette 10 mal mit P1000 Pipette. Zentrifugieren Sie die Proben für 3 min bei 400 x g und RT. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie dies mindestens 2 weitere Male.
    8. Zum Pellet 0,5 ml N2/B27-Medien mit 1 mM Luziferin hinzufügen und gut vermischen. Säen Sie die Zellen (1 x 106 Zellen) zu einer PLL-beschichteten Glasbodenschale. Kultur die Zellen im CO2-Inkubator für 1 h. Sobald die Zellen an der Schale haften, fügen Sie 2 ml N2/B27-Medien hinzu, die 1 mM Luziferin enthalten.
  3. Visualisierung des Luciferase-Reporterausdrucks in der NPC-Dissoziationskultur
    1. Starten Sie das Lumineszenz-Live-Imaging-System, bevor Sie die Sezierung durchführen. Für NPC-Kultur, stellen Sie die Temperatur des Bühneninkubators auf 37 °C und die Einstellung des Gasgemisches 20%O2, 5%CO2.
    2. Setzen Sie das Tauchöl auf die Objektivlinse. Legen Sie die Probenschale auf die Mikroskopstufe. Zeigen Sie das Feld manuell an und wählen Sie die beste Position und den Fokus der Interessenzellen aus. Klicken Sie auf Live, um das Testbild zu erhalten.
    3. Führen Sie die Zeitraffererfassung durch 2-dimensionale (Lumineszenz und helles Feld) Erfassungen für 24 h mit Multi-Dimensional Acquisition-Programm. Wählen Sie Multi-Dimensional Acquisition-Programm und legen Sie die Erfassungseinstellung wie folgt fest (Schritt 3.3.6).
    4. Verwenden Sie für die Lumineszenzbildaufnahme die folgenden Kameraeinstellungen: niedrige Übertragungsrate (50 kHz), 2 x 2/4 x 4 Binning, 10 min/5 min Belichtungszeit. Verwenden Sie für die Bildaufnahme in hellen Feldbereichen die folgenden Einstellungen: Zwischenübertragungsrate (1 MHz), 1 x 1 Binning und 100 ms Belichtungszeit.

4. In der Utero-Elektroporation

HINWEIS: Dies wird für die Einführung von Dll1-Fluc Reporter in die neuronalen Vorläuferzellen durchgeführt.

  1. Herstellung von Werkzeugen und Reagenzien für die Elektroporation
    1. Bereiten Sie Mikrokapillaren für die Injektion von DNA in die Herzkammer des embryonalen Telencephalons vor. Dehnen Sie eine Graskapillare mit Hitze und schneiden und polieren Sie die Spitze davon mit der Poliermaschine.
    2. Bereiten Sie eine Mischung aus DNA mit Farbstoff (z. B. Trypan blau). Die Konzentration jeder DNA beträgt 1 g/l in PBS und fügt den Farbstoff zu einer Endkonzentration von 10% hinzu.
      HINWEIS: Verwenden Sie die DNA-Mischung zur Visualisierung der Dll1-Proteindynamik wie folgt: Dll1-Fluc (Dll1-Proteinreporter, Abbildung 2E oben)und pEF-EGFP (EF-Promotor-gesteuerter EGFP-Expressionsvektor, Abbildung 2E niedriger),überwachung der Lage und Morphologie transfizierter Zellen.
    3. Bereiten Sie zwei Arten von Anästhetika vor: 3,88 mg/ml Pentobarbital und 0,12 % Xylazin in sterilen 1x PBS.
    4. Verwenden Sie die sterilen Instrumente und chirurgischen Handschuhe während der Operation.
  2. In der Utero-Elektroporation
    1. Anästhetisieren Sie eine zeitschwangere ICR-Maus (E12.5) durch intraperitoneale Verabreichung von Anästhetika mit 500 l 3,88 mg/ml Pentobarbital und 500 l mit 0,12 % Xylazin.
      HINWEIS: Die Forscher müssen sich an die Vorschriften von Tierversuchen halten. Wenn man Anästhesie oder Schmerzmittel verwenden muss, verwenden Sie sie richtig.
    2. Schneiden Sie das Haar an und desinfizieren Sie die Haut mit chirurgischem Peeling.
    3. Überprüfen Sie, ob es keine Reaktion auf zehenpinch en the pinch gibt. Sobald der Pedalreflex nicht beobachtet wird, machen Sie einen 2-3 cm Schnitt durch den Bauch entlang der Mittellinie. Die Gazen um den sezierten Teil legen und die Gazen mit warmen PBS nass machen, um den Schnitt nicht auszutrocknen. Nehmen Sie das rechte Gebärmutterhorn vorsichtig mit ringförmigen Zangen heraus und zählen Sie die Anzahl der Embryonen.
    4. Injizieren Sie 1-2 l der gemischten DNA vorsichtig mit Mikrokapillare in den Ventrikel des Telencephalons von Embryonen.
      HINWEIS: Wenn die Injektion erfolgreich ist, kann man die blaue Farbe des Farbstoffs über der Oberfläche der Gebärmutter sehen.
    5. Befeuchten Sie die Gebärmutter und die Elektrode, bevor Sie die Spannungsimpulse bereitstellen, und halten Sie dann den Kopf eines Embryos sanft. Stellen Sie die positiv geladene Elektrode auf die Seite der Hemisphäre, in die die DNA injiziert wurde. Stellen Sie sicher, dass der Zustand des Elektroporationsimpulses 30-50 V für 50 ms beträgt, das Intervall der Impulse 1 s (50 ms Ladung und 950 ms unaufladend). Geben Sie 5 Impulse an einen Embryo und überprüfen Sie, ob Blasen aus der negativ geladenen Elektrode erzeugt werden.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Richtung der Elektrode: DNA wird in Zellen auf der Seite der positiven Elektrode integriert. Bewegen Sie während dieses Verfahrens die Position der Elektrode nicht.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.3-4.2.4 für andere Embryonen und geben Sie das Gebärmutterhorn in die Bauchhöhle zurück. Führen Sie das gleiche Verfahren zu den Embryonen im linken Gebärmutterhorn durch.
    7. Nach dem Zurücksetzen der linken Seite, Naht den Schnitt durch eine Seidennaht (4-0) mit einer Nadel (17 mm). Bevor Sie den Schnitt vollständig schließen, geben Sie warme PBS in die Bauchhöhle
      HINWEIS: Das Intervall zwischen den Nähten beträgt etwa 2 mm.
    8. Nach Abschluss der Operation, legen Sie die Maus auf einem Heizkissen für Postanästhesie Erholung. Haus die Maus einzeln.
      HINWEIS: Die Forscher müssen ihre lokale initielle Regelung von Tierversuchen befolgen. Wenn man Schmerzmittel verwenden muss, verwenden Sie sie richtig.

5. Vorbereitung von Scheibenkulturen des sich entwickelnden Kortex und Visualisierung des Luziferase-Reporterausdrucks in den kortikalen Scheiben

  1. Herstellung von Kulturmedien und Reagenzien für Scheibenkulturen des Kortex
    1. Bereiten Sie angereicherte Medien für die Kultivierung von kortikalen Scheiben vor, die 5% fetales Rinderserum und 5% Pferdeserum in N2/B27-Medien enthalten.
    2. Blase 100%O2 Gas durch DMEM/F12 Medien für die Zerlegung und Herstellung von kortikalen Scheiben.
      HINWEIS: Um Sauerstoffgas sicher zu verwenden, lagern Sie den O2-Zylinder im Zylinderschrank und überwachen Sie die Sauerstoffkonzentration in der Luft durch einen Sauerstoffkonzentrationsmesser.
    3. 100 mM Luziferin-Natriumlösung in angereicherten Medien auf eine Endkonzentration von 1 mM verdünnen.
      HINWEIS: Luciferin zeigt Auto-Fluorescein selbst. Im Falle der Luziferase-Fluoreszenz Dual Imaging, insbesondere EGFP, ist eine niedrigere Konzentration von Luziferin (0,5 mM) besser.
    4. Stellen Sie den Multigas-Inkubator auf 37 °C um 40%O2 und 5% CO2.
  2. Zerlegung von Embryonen und Untersuchung der Expression von fluoreszierenden Reportern
    1. Nach der Einschläferung der schwangeren Maus, zu der die Reporter (E13.5) durch Utero-Elektroporation (Schritt 4.2) eingeführt werden, durchschneiden Sie den Bauch und nehmen Sie die Gebärmutter heraus.
      HINWEIS: Die Forscher müssen sich an die Vorschriften von Tierversuchen halten. Wenn Sie Anästhesie oder Schmerzmittel verwenden, verwenden Sie sie richtig.
    2. Die Gebärmutter in eine 10 cm Petrischale mit PBS geben. Nehmen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter in PBS, mit Mikroschere und feinen Zangen. Schneiden Sie den Kopf jedes Embryos ab und übertragen Sie auf eine 10 cm Petrischale mit DMEM/F12-Medien, die mit 100%O2-Gas geblasen sind. Entfernen Sie Epidermis und Knorpel um das Gehirn in DMEM/F12 Medien.
    3. Setzen Sie das Gehirn mit ringförmiger Zange auf den Deckel der Petrischale und setzen Sie den Deckel auf die stereoskopische Mikroskopstufe der Fluoreszenz. Überprüfen Sie den Bereich des Kortex, der fluoreszierendes Protein unter dem Anregungslicht ausdrückt (Abbildung 2A,B).
    4. Übertragen Sie das Gehirn auf ein Silikonkautschuk Schneidebrett gefüllt mit 30 ml DMEM/F12 Medien mit 100%O2 Gas geblasen. Entfernen Sie Menings, die die Oberfläche des Telencephalons durch feine Zange bedecken.
    5. Schneiden Sie die Grenze zwischen medialem und seitlichem Teil des dorsalen Telencephalons und trennen Sie sie mit Mikro-Operzien oder feinen Zangen in zwei Hemisphären. Schneiden Sie mit einem Mikro-Opusmesser den Kortex wie Streifen und machen Kortikalscheiben (Abbildung 2C,D). Pipette Scheiben mit Medium mit Pipette und übertragen sie auf angereicherte Medien in einer 35 mm Schale.
    6. Legen Sie die Scheiben auf die Kultureinsätze in den Glasbodenschalen mit angereicherten Medien. Korrigieren Sie die Richtung der Scheiben mit feinen Zangen. Richten Sie die Schnittfläche der Slices auf die Oberfläche des Kultureinsatzes ein. Entfernen Sie das zusätzliche Medium durch eine Pipette. Inkubieren Sie die Scheiben im Multigas-Inkubator um 40%O2 und 5%CO2 bei 37 °C für 30 min.
    7. Fügen Sie 300 l angereicherte Medien mit 1 mM Luziferin an die Außenseite der Kultur ein, die in die Glasbodenschale einfügt.
  3. Visualisierung des Luciferase-Reporterausdrucks in Slice-Kulturen
    1. Starten Sie das Lumineszenz-Live-Imaging-System, bevor Sie mit der Zerlegung beginnen. Verwenden Sie den folgenden Zustand der kortikalen Scheibenkulturen: 40%O2, 5%CO2 und 37 °C.
    2. Setzen Sie das Tauchöl auf 40x Objektivlinse. Legen Sie die Probenschale auf die Stufe des Mikroskops. Erfassen Sie das Testbild von fluoreszierend und stellen Sie die Position und die Fokusebene auf den Bereich des Interesses unter der Beleuchtung von Anregungslicht.
    3. Führen Sie die Zeitraffererfassung durch 3-dimentionale (Lumineszenz, Fluoreszenz und helles Feld) Erfassungen für 24 h(Abbildung 2F-H). Verwenden Sie für die Lumineszenzbildaufnahme die folgenden Kameraeinstellungen: niedrige Übertragungsrate (50 kHz), 2x2/4x4 Binning, 10 min/5 min Belichtungszeit. Verwenden Sie für die Fluoreszenz- und Lichtfeldbildaufnahme die folgenden Einstellungen: Zwischenübertragungsrate (1 MHz), 1x1 Binning und 100 ms Belichtungszeit.

6. Bildverarbeitung und -analyse

  1. Verbinden Sie jedes Bild, und erstellen Sie die Stapelbilder. Klicken Sie im Menü Datei ( Datei| Import | Bildsequenz) und wählen Sie den Ordner aus, in dem die erfassten Bilder gespeichert werden. Setzen Sie einige Wörter in Dateinamen in die Spalte file Name enthältenthalten .
  2. Um das Rauschen des kosmischen Strahlungsauf den Biolumineszenzbildern zu entfernen, wenden Sie das SpikeNoise Filter-Plug-in von ImageJ/Fiji an. Öffnen Sie die Stapelbilder und klicken Sie auf SpikeNoise Filter.
  3. Wenden Sie Savitzky Golay Temporal Filter-Plug-In an, um eine klare Dynamik des Reporterausdrucks zu erhalten. Öffnen Sie die Stapelbilder und klicken Sie auf Savitzky Golay Temporal Filter.
  4. Um die Intensität des Reporterausdrucks zu messen, wenden Sie das Z-Achsenprofil Plus-Plug-In auf jede einzelne Zelle an. Wählen Sie die Zellen aus, und legen Sie ROIs, Interessenbereich, fest, und klicken Sie auf Z-Achsenprofil Plus.

Ergebnisse

Ausdrücke der Gene Hes1/7 weisen 2 h Oszillationszyklus in verschiedenen Zelllinien und während der Sonogenese auf. Darüber hinaus ist die Schwingungsdauer sehr kurz und sowohl ihre mRNAs als auch ihre Proteine sind mit einer Halbwertszeit von etwa 20 min extrem instabil. Wenn wir einen Reporter mit langsamer Reaktion verwenden, können wir eine solche schnelle Dynamik nicht verfolgen, und wenn wir einen stabilen Reporter verwenden, akkumuliert er sich allmählich, während die Genexpression oszilliert. Daher...

Diskussion

Die Komponenten der Notch-Signalisierung zeigen oszillatorischen Ausdrücke synchron während der Synchronität während der Neurogenese, was zu den Schwierigkeiten führt, die Expressionsdynamik durch statische Analyse im letzteren Fall zu erfassen. Daher ist eine Echtzeitüberwachung erforderlich, um die Ausdrucksdynamik von Notch-Signalkomponenten wie Hes1 und Dll1zu zeigen. Da die Perioden der Ausdrücke von Hes1 und Dll1 Schwingungen extrem kurz sind, etwa 2-3 h, sind schnelle Rea...

Offenlegungen

Die Autoren haben kein gegensätzendes finanzielles Interesse.

Danksagungen

Wir danken Yumiko Iwamoto für die Unterstützung der Produktion des Videos. Wir sind auch Akihiro Isomura für die Diskussion und Unterstützung der Bildanalyse, Hitoshi Miyachi für technische Unterstützung für die Erzeugung von transgenen Tieren, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) und Ouin Kunitaki (Andor Japan) für die technische Unterstützung und Diskussionen des Biolumineszenz-Bildgebungssystems. Diese Arbeit wurde unterstützt von Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (MEXT 24116705 for H.S. and MEXT 16H06480 for R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (JSPS 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. und H.S.) und Platform for Dynamic Approaches to Living System aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie, Japan.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Bioluminescence Imaging System
Chilled water circulator (chiller)JulaboModel: F12-ED
Cooled CCD cameraAndor TechnologyModel: iKon-M 934
Incubator systemTOKAI HITModel: INU-ONICS
Inverted microscopeOlympusModel: IX81
Inverted microscopeOlympusModel: IX83
LED illumination deviceCoolLEDModel: pE1
MetaMorphMOLECULAR DEVICESModel: 40000
Mix gas controllerTokkenModel: TK-MIGM OLO2
Objective lensOlympusModel: UPLFLN 40X O
Preparations for Dissection
Dissection microscopeNikonModel: SMZ-2B
Fluorescence stereoscopic microscopeLeicaModel: MZ16FA
Fine forcepsDUMONTINOX No.5
Scissors, Micro scissors
Forceps
Ring-shaped forceps
10-cm plastic petri dishgreiner664160-013
35-mm plastic petri dishgreiner627160
PBSNacalai Tesque14249-24
DMEM/F12invitrogen11039-021
Reagents for NPC dissociation culture
B27 supplementinvitrogen12587-010
bFGFinvitrogen13256-029Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS
D-luciferinNacalai Tesque01493-85Stock solution: 100mM in 0.9% saline
DNaseWorthington Biochemical CorporationLK003172Stock solution: 1000U/ml in EBSS
EBSSWorthington Biochemical CorporationLK003188
Glass bottom dishIWAKI3910-035
N2 supplement (100x)invitrogen17502-048
N-acetyl-cysteinSigmaA-9165-25G
PapainWorthington Biochemical CorporationLK003178Stock solution: 7U/ml in EBSS
Penicillin/StreptmycineNacalai Tesque09367-34
Poly-L-lysineSigmaP-628140 mg/ml in DW
Preparations for in utero electroporation
50-ml syringeTERUMO181228T
ElectrodeNeppagene7-mm
ElectroporatorNeppageneCUY21 EDIT
Forceps
GauzesKawamoto co.7161
Micro capillaryMade in-house
PBSNacalai Tesque14249-24
PentbarbitalKyoritsuseiyakuSomnopentyl
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Suture needleAkiyama MEDICAL MFG. COF17-40B2
XylazineBayerSeractal
Preparations for Slice culture
10-cm plastic petri dishgreiner664160-013
35-mm plastic petri dishgreiner627160
Culture insertMilliporePICM01250
DMEM/F12invitrogen11039-021
Fetal Bovine SerumSigma172012-500ML
Fine forcepsDUMONTINOX No.5
Forceps
Horse SerumGibco16050-122
Micro surgical knifeAlcon19 Gauge V-Lance
Multi-gas incubatorPanasonicMCO-5MUV-PJ
N2/B27 mediaMade in-houseref. NPC dissociatioin culture
PBSNacalai Tesque14249-24
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Silicon rubber cutting boardMade in-house

Referenzen

  1. Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
  2. Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
  5. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  6. Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
  7. Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
  8. Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
  9. Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
  10. Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
  11. Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
  12. Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
  13. Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
  14. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
  15. Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
  16. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  17. Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
  18. Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
  19. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
  20. Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
  21. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
  22. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
  23. Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
  24. Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
  25. Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
  26. Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
  27. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
  28. Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
  29. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  30. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).
  31. Hansen, A. S., O'Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
  32. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
  33. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  34. Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
  35. Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
  36. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

EntwicklungsbiologieAusgabe 154Echtzeit BildgebungBiolumineszenzLuziferaseOszillationNotch SignalisierungNeurogenese

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten