使用"彩虹"和"延时共聚焦成像"可视化活斑马鱼中发育中的脑

摘要

体内成像是一种强大的工具，可用于研究神经系统发育背后的细胞机制。在这里，我们描述了一种技术，使用延时共聚焦显微镜，以可视化大量的多色彩虹标记细胞在发展中的斑马鱼神经系统实时。

摘要

脊椎动物神经系统的发展需要复杂的细胞行为和相互作用的精确协调。在体内使用高分辨率成像技术可以为活生物体中的这些过程提供一个清晰的窗口。例如，在神经系统形成时，分裂细胞及其后代可以实时跟踪。近年来，多色技术的进步扩大了可以调查的问题类型。多色Brainbow方法不仅可用于区分像细胞一样，还可用于对相关细胞的多个不同克隆进行颜色编码，每个克隆来自一个祖细胞。这允许在开发期间同时对许多不同的克隆及其行为进行多路复用线分析。在这里，我们描述了一种技术，使用延时共聚焦显微镜在发展中的斑马鱼神经系统中实时可视化大量多色彩虹标记细胞。这对于关注细胞之间的细胞相互作用特别有用，因为细胞很难使用传统的启动器驱动颜色进行差异标记。我们的方法可用于同时跟踪多个不同克隆之间的系系关系。使用此技术生成的大型数据集提供了丰富的信息，可以定量地比较基因或药理学操作。最终，所产生的结果有助于回答有关神经系统如何发育的系统问题。

引言

在发育的早期阶段，专门的祖细胞池在增殖区反复分裂，产生不同的子细胞阵列。然后，在这个发育期出生的细胞将分化和旅行，形成新生的器官。在神经系统中，前视像状胶质在心室区产生不成熟的神经元。当神经元从心室迁移并成熟时，膨胀的组织最终形成大脑高度复杂的结构^1,21，2，3，4，5，6。^,3,4,5,6前祖的分裂与神经元的分化和迁移之间的协调将决定大脑的最终大小、形状和功能，直接影响行为^{77、8、9、10。8,9,10}虽然严格控制这些过程显然对于正常的大脑发育至关重要，但监管这些动力学的全球机制并不十分了解。在这里，我们描述了一个工具，以细胞分辨率研究神经系统的发展，允许研究人员可视化在发育中的斑马鱼大脑中与B彩虹的祖细胞和神经元，并通过延时共聚焦显微镜¹¹跟踪他们的行为随着时间的推移。该方法也可以适应可视化发育中的胚胎的其他部分。

为了观察和区分正在发育中的斑马鱼大脑中的细胞，我们采用了"彩虹细胞标记技术^11"。Brainbow利用随机确定的三种不同荧光蛋白（FPs）的组合表达来标记细胞群。虽然Brainbow表达式的默认表达式是红色FP dTomato，但由酶Cre重组酶的重组导致mCerulean（青色荧光蛋白，CFP）或黄色荧光蛋白（YFP）12，13^12,13的表达。单元格中表达的每个 FP 的总量使其具有独特的色调，从而允许从相邻单元格中明确的视觉区别。此外，当一个祖细胞分裂时，每个子细胞将继承其母细胞的颜色，产生颜色编码的克隆，并允许研究人员追踪细胞系^{11，14。11,}虽然最初用于分析小鼠¹²的神经元回路，但此后，Brainbow已在各种模型生物中表达，包括斑马鱼^15。

我们的技术基于以前的多色标签和成像方法，在活斑马鱼中直接成像多个颜色编码的克隆。由于斑马鱼作为胚胎的光学透明度，非常适合成像实验^16，而以前的研究已经利用斑马鱼中的B彩虹来研究各种组织，包括神经系统11、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25。^{11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26，,27}.直接成像生物体的能力，以及它们的快速外生发育，使斑马鱼成为脊椎动物发展的宝贵模型。与哺乳动物的大脑相比，斑马鱼后脑的整个增殖区随时可供成像，而不会破坏其内源环境^6。这允许在活的有机体中进行实验，而不是在体外或固定组织制剂中进行。与固定成像实验相比，体内研究允许纵向设计，生成数小时的数据，可以分析模式，从而增加观察相对罕见事件的可能性。根据感兴趣的事件的速度和长度，研究人员可以选择进行短（1⁄2 小时）或长（高达 ±16 h）的延时成像实验。通过使用斑马鱼热冲击促进剂70（hsp70，hsp），B彩虹表达可以暂时控制^{28，29。28,}此外，由这个启动器诱导的马赛克表达式非常适合标记和跟踪许多克隆^11。

直观地识别活脑中的多个克隆的能力是这种方法的一个优点。以前研究克隆在神经系统发育中的作用的重要研究利用逆转录病毒载体使用单个FP或其他易于可视化的蛋白质标记单个祖细胞及其后代。这种标签允许研究人员观察一个克隆随着时间的推移，无论是体外或体内²2，30，31，32，33，34，35，36，37，38。^{,30,31,32,33,34,35,36,37,38}与跟踪一个克隆细胞行为的方法不同，Brainbow的不同颜色允许研究人员观察克隆之间的动态。此外，通过使用Brainbow标记大脑中的许多克隆，根据标记单个克隆¹¹的技术，收集了有关克隆行为的其他数据。重要的是，这里描述的方法可以扩大，以产生发育比较之间的鱼经历了不同的遗传或药理操纵^18。总体而言，这些优势使表达蓝彩虹的斑马鱼的体内共聚焦成像的延时技术成为探索脊椎动物神经系统发展的理想研究人员，特别是那些对克隆人作用感兴趣的人。

研究方案

涉及动物主题的程序已获得刘易斯和克拉克学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 斑马鱼胚胎的微注射

1. 设置野生类型，成年斑马鱼在性别分离的交配池前，下午进行微注射^{39，40。39,}
2. 在微注射的早晨准备DNA溶液。稀释hsp:Zebrabow¹¹质粒DNA浓度为±10 ng/μL，浓度为0.1 mM KCl，以及2.5%苯酚红色和3.75U克雷重组酶。
3. 在受精45分钟内将DNA溶液微注射到单细胞斑马鱼胚胎^{中39，41。,41}将大约4.2 nL这种溶液注入每个胚胎，相当于42皮克质粒DNA。
   注:如果将转基因、表达的斑马线交配，如Tg（ubi:Zebrabow）15¹⁵和Tg（神经:斑马弓^）18，微注射步骤可以省略。执行微注射可能是有益的，因为它允许研究人员对拷贝数和标签密度进行定位。此外，第二个DNA结构，标记或操纵一个特定的基因产物可以注射旁边的B彩虹，如果需要（例如，一个远红色的荧光蛋白，补充^{Brainbow18）。}
4. 在28°C培养箱中保持E3中³⁹的培养皿中注入的胚胎，持续24小时。

2. 热冲击诱导彩虹表达

注:如果注射的质粒DNA或表达的转基因不利用hsp70促进剂驱动表达，可以跳过热冲击步骤，健康胚胎应立即转移到苯基硫尿酸（PTU）在受精后24小时（hpf）。

1. 在24 hpf，从注射的胚胎组中剔除死亡和变形的胚胎。然后，将健康的胚胎转移到50mL管，最多20个胚胎/管。
2. 将管子充满 10 mL E3。在每个管的顶部放置一个盖子，但不要紧紧闭合。
3. 将装有 50 mL 管的管架直立放置在 37 °C 水浴中。确保浴缸中的水位高于管中的 E3 水平，并留出 80 到 90 分钟。
4. 将带胚胎的管架从水浴中取出，然后直立返回到 28°C 培养箱。允许长达 1 小时的 E3 冷却，使胚胎逐渐适应温度。然后，将胚胎转移到E3中0.2mM PTU的培养皿中，在培养箱中加热，以防止胚胎色素沉着。
   注意事项:PTU 是一种有毒化学品，应小心处理并妥善处理。建议戴手套。

3. 筛选胚胎的彩虹表达

1. 在热冲击后 2 到 4 小时，在标准荧光解剖显微镜下检查胚胎以表示 CFP 或 YFP，这表明 Brainbow 重组成功（来自 dTomato 的默认表达式）。
   注:如果有多个荧光过滤器选项可用，则 CFP 筛查是识别重组良好的鱼类的最有效方法。如果 CFP 和 YFP 滤波器不可用，YFP 也可以在绿色荧光蛋白 （GFP） 滤镜下模糊可视化，因为它们的光谱配置文件重叠。
2. 选择在整个过程中具有强大 FP 表达的胚胎，并随 PTU 转移到单独的盘中。在受精后1天（dpf;28 hpf或更高）成像胚胎，或在PTU中保持胚胎，并在2或3 dpf中保持图像。

4. 安装用于体内成像的胚胎

1. 在实验当天之前，准备成像室和胚胎操作工具。
   1. 通过将塑料环压到 60 mm Petri 盘的中心，使成像室做好准备。
   2. 或者，准备一个定制的胚胎操纵器，在盘子内移动胚胎，并在安装时定向胚胎。通过将尼龙钓鱼线（+1/2 in，+6 lb）的一小段长度，以超过已切割到 ±4 长度的木制棉签棒的末端来构造操纵器。
2. 如有必要（即，在2 dpf或更早情况下成像），在解剖显微镜下使用注射器安装胚胎去变异。
3. 麻醉斑马鱼胚胎。
   1. 与E3一起填充60毫米的培养皿，加入5~6滴4mg/mL MS-222三环-S，最终浓度为±0.2mM。旋转混合。
      注意事项:三氯苯e应谨慎处理，并妥善处理。
   2. 将胚胎从PTU转移到三叶草溶液，确保尽可能少的PTU转移。虽然鱼反射应在1⁄2分钟后停止，但将三环中的胚胎留在三甲e中长达10分钟，以确保对延时成像实验进行彻底麻醉。
   3. 确认胚胎是否经过适当的麻醉。用胚胎操纵器轻轻触摸胚胎尾部，评估启动器反射。如果观察到反射运动，在菜中加入一滴三环，尽可能远离胚胎，并旋转混合。在解剖范围内观察胚胎心率。如果速度异常缓慢，请向盘中添加额外的 E3 滴，以降低三环浓度。
4. 在阿甘罗斯安装麻醉胚胎。
   1. 将鱼转移到成像室内的塑料环中心，并使用细尖转移移液器去除尽可能多的多余的 E3。
   2. 使用干净的转移移液器，在42°C的E3中用1.0%的低熔脂糖（LMA）覆盖鱼，并用薄层的琼脂填充整个塑料环。使用转移移液器轻轻地将胚胎拉入移液器尖端，然后返回到琼脂中，而不会引入气泡。
   3. 在琼脂硬化之前，快速使用胚胎操纵器适当地定向鱼。如果使用直立显微镜成像，将胚胎尽可能靠近琼脂的上表面。将胚胎与成像室底部平行，尾部笔直。
      注:对于后脑成像，胚胎可以定位在背或下垂视图中。应小心确保胚胎的头部在琼脂仍为液体时不会下沉。其他方向可能适合针对其他发育中组织进行成像。对于倒置显微镜，安装方式会有所不同，通常将鱼放置在玻璃底的培养皿底部附近。
5. 等待琼脂硬化，然后用 E3 填充成像室。添加尽可能多的 E3，以考虑成像过程中的蒸发。

5. 发展斑马鱼辛脑的延时共聚焦成像

1. 将成像室放在共聚焦显微镜上，为成像做准备。
   1. 将成像室与鱼和 E3 放在共聚焦显微镜上。
   2. 选择具有高数值孔径和长工作距离的目标，例如 20 倍水浸式目标 （1.0 NA）。
   3. 查找具有适当密度和明亮标记感兴趣的单元格类型的区域。
      注:在长时间的成像过程中，显微镜上的温度控制级/仪器也可用于调节温度和湿度。这可以减少蒸发。
2. 设置 Brainbow 成像的采集参数。
   1. 按顺序对每个 FP 通道进行映像。如果使用商业软件（例如 Zen 软件），则通过准备三个"轨道"来完成此操作。使用 Argon 激光在 458 nm 时激发 CFP，在 514 nm 处激发 YFP。使用 DPSS 561 nm 激光激发 dTomato。将排放收集在 463~509 nm 之间，用于 CFP，519~555 nm 用于 YFP，566~691 nm 用于 dTomato。
   2. 对于屏幕显示，将 CFP 编码为蓝色，YFP 为黄色，dTomato 为红色。
      注:这些设置将因共聚焦显微镜上可用的激光线和其他功能而异。为了提高成像速度，CFP 和 dTomato 通道可以同时进行成像，而不会明显出血。如果还成像了单独的 FP（如远红色的 FP），则可以按顺序或与 YFP 同步进行成像。
   3. 设置一般成像参数，以拍摄分辨率至少为 1024 x 1024 和平均两次的 16 位图像。根据感兴趣的区域和单元格类型调整缩放（即，对于具有 20 倍目标的后脑成像，变焦范围为 1.0-2.5）。最大化视野，允许鱼随着时间的推移生长。
   4. 一次查看一个轨道（并关闭其他激光器以防止光漂白），单独优化每个 FP 的采集设置（例如激光功率、针孔尺寸、光倍增管增益等）。
   5. 选择要图像的 Z 堆栈范围。
      注:对于长时间的成像会话 （>2 h），考虑到鱼将继续生长在整个成像过程中，因此 XY 场和 Z 堆栈范围应考虑到这一点，并留出额外的空间。如果成像后脑，在成像期间，在磁场中包括空间，供组织进行结构移动。空间也需要包括在Z维度的增长中。无论鱼是定位为下垂视图还是背视图，在图像中大约在感兴趣区域上方约 10⁄20 μm。
3. 设置延时成像参数。
   1. 选择时间间隔。间隔长度范围在 10-30 分钟之间，用于跟踪发展中后脑中的线粒体和凋亡事件。间隔长度将因感兴趣的事件的速度和捕获单个 Z 堆栈的总时间而异。
   2. 选择成像会话的长度。延时成像过程通常一夜之间发生，可以持续至少 16 小时。
4. 运行实验。
   注:鱼可以在成像后立即安乐死，或使用注射器从琼脂体中仔细解剖，然后返回到E3进行恢复。然后，在稍后的时间点可以再次成像回收的鱼，但细胞位置和深度将在此期间因整体生长而改变。

6. 延时文件管理

1. 将图像文件导入分析软件。
   1. 如果使用 Zen 软件，则在完成映像采集后，以 .czi 格式保存文件。请确保以与斐济⁴²和/或其他软件兼容的格式保存原始数据。
   2. 使用生物格式导入器导入斐济软件。
      注:延时文件将很大，可能需要大量的时间和内存才能打开进行分析。因此，在如何保存和打开它们方面具有战略意义是很有帮助的。保存一个质量较低的版本非常有用，该版本可以更轻松地打开，以便通过眼睛搜索感兴趣的事件。
2. 如果使用斐济，请创建更小、更易于管理的延时文件子集。按时间（例如，在第一时间点查看完整的 Z 堆栈）或按深度（例如，在每个时间点查看前 50 个 Z 节）生成子集|堆栈|工具|制作子堆栈。

7. 彩虹图像的定量克隆颜色分析

1. 测量斐济感兴趣单元格的平均红色、绿色和蓝色 （RGB） 强度值。
   注:这些说明特定于斐济的图像分析。然而，研究人员可能更喜欢在替代软件程序中获得平均RGB强度值。
   1. 确保文件已正确裁剪，以便在图像边缘周围没有黑色空间。黑色空间将人为地降低分析所需的最小强度测量值。如果需要裁剪文件，请选择"矩形选择按钮"，并在视图区域周围绘制感兴趣的区域 （ROI），不包括所有黑色空间。单击图片|裁剪。
   2. 将测量工具设置为进行均值、最小值和最大灰值测量。单击"分析" |设置测量值。确保选中"最小值"和"最大灰值"和"平均灰色值"复选框。
   3. 查看斐济的原始数据文件或子集的 Z 堆栈，查找用于克隆颜色分析感兴趣的单元格。在后脑中，假定的克隆可以通过它们的共享色调和径向来直观地识别。不要选择与另一种颜色的相邻单元格密切接触且难以解析的单元格。可能很难量化它们的色调。
   4. 使用Z 滚动条查找感兴趣单元格的中心 Z 平面。右键单击椭圆选择按钮并选择椭圆选择按钮。其他选择工具将适用于不同的单元格类型。在细胞体的中央 +2/3 周围绘制椭圆 ROI。
   5. 使用C 滚动条，选择红色 （dTomato） 通道。选择"分析"测量.对绿色 （YFP） 和蓝色 （CFP） 通道使用相同的 ROI 和焦点平面重复，并保存所有平均强度值。
   6. 单击图像上的任意位置以删除感兴趣单元格中的椭圆 ROI。
   7. 要测量背景级别以进行规范化，请使用C 滚动条并选择红色 （dTomato） 通道。选择"分析"测量.对绿色 （YFP） 和蓝色 （CFP） 通道使用相同的焦平面重复，并保存所有最小强度值。
2. 计算感兴趣的单元格的相对 RGB 通道权重。
   注:计算来自这些强度值的相对 RGB 通道权重可以在各种软件程序中执行，例如 Microsoft Excel 或 R⁴³。
   1. 通过从该通道和焦点平面中从整个场中减去最小强度，使每个通道的细胞 ROI 的平均强度测量标准化。
   2. 求和每个通道的规范化平均 RGB 强度值，以查找单元格的总规范化 RGB 强度。
   3. 通过将该通道的规范化平均强度值除以总规范化 RGB 强度来计算每个通道的相对通道权重。
3. 使用 R^43,、44的三元包将相对 RGB 通道权重显示为三元图。三元图可用于可视化 3D RGB 空间中类似颜色的聚类。
4. 计算颜色分布系数以量化单元格颜色之间的差异。
   1. 使用以下公式计算 3D RGB 空间中两种颜色之间的欧氏距离:
      
      其中 R、G 和 B 是按 7.2 计算的相对 RGB 通道权重。
   2. 为了便于理解，通过将颜色之间的最大可能距离除以 ±2 来使颜色距离规范化，以获得介于 0 和 1 之间的颜色分页系数，其中 0 表示完全相同的颜色，1 表示完全不同的颜色（例如，纯红色和纯蓝色）。

结果

本节演示了使用本文描述的体内多色延时成像方法可以获得的结果示例。我们显示，在发育中的斑马鱼后脑¹⁴的增殖心室区，B彩虹颜色编码的细胞克隆（图1）。

通常，当B彩虹标记的细胞排列在特定的径向光纤上时，它们共享相同的颜色（图1D），可以量化为相对RGB通道权重（图1E）。这表?...

讨论

该协议描述了一种方法，可视化在发育中的斑马鱼后脑中，前祖细胞和神经元的克隆，并跟随它们在体内使用B彩虹和延时共聚焦显微镜^11。与体外或活体研究相比，该协议的主要优点是能够长期直接观察脊椎动物大脑的自然环境中的增殖区。这项技术建立在以前使用逆转录病毒载体标记单个克隆的研究的基础上。相反，使用hsp:Zebrabow 同时构造了许多克隆的颜色代码，允许...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5mL transfer pipet	Globe Scientific, Inc.	134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Alfa Aesar	L06690	Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50ml conical tubes	Corning	352070	For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing line	SecureLine	NMT250	For making embryo manipulators
7.5mL transfer pipet	Globe Scientific, Inc.	135010
CaCl2	Sigma	C3881	For E3
Cotton swabs	Puritan	867-WC NO GLUE	For making embryo manipulators
Cre recombinase	New England Biolabs	M0298M
Digital dry bath	Genemate	490016-616	Used to store LMA at 40°C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubes	World Precision Instruments	TW100F-4
Incubator	Forma Scientific	3158	To maintain embryos at 28°C
Injection plate molds	Adaptive Science Tools	TU-1
Isotemp water bath	Fisher Scientific	2320	For heat shocking embryos
KCl	AMRESCO	0395	For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscope	Zeiss	LSM710
LE agarose	Genemate	E3120	To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA)	AMRESCO	J234
Mating tanks	Aquaneering, Inc.	ZHCT100
Methylene blue	Sigma	M9140	For E3
MgSO4	Sigma	9397	For E3
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
MS-222 Tricaine-S	Western Chemical, Inc.		Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaCl	J.T. Baker	4058-01	For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm)	Genesee Scientific	32-107G	To house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol red	Sigma	P0290
Soft stitch ring markers	Clover Needlecraft, Inc.	354	For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control)	Loctite	1363589	For making embryo manipulators
Syringe needles	Beckton Dickinson	BD329412	For dechorionating embryos