Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

In vivo görüntüleme sinir sistemi gelişiminin altında yatan hücresel mekanizmaları araştırmak için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Burada, gelişmekte olan zebra balığı sinir sistemi içinde çok renkli Brainbow etiketli çok sayıda hücreyi gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için zaman atlamalı konfokal mikroskopiyi kullanma tekniğini açıklıyoruz.

Özet

Omurgalı sinir sisteminin gelişimi karmaşık hücresel davranışlar ve etkileşimlerin hassas bir koordinasyon gerektirir. Vivo görüntüleme tekniklerinde yüksek çözünürlüklü kullanımı, canlı organizmada bu süreçlere açık bir pencere açabilir. Örneğin, hücreleri ve bunların dölleri sinir sistemi formları olarak gerçek zamanlı olarak takip edilebilir bölme. Son yıllarda, çok renkli tekniklerde teknik gelişmeler araştırılabilir soru türlerini genişletti. Çok renkli Brainbow yaklaşımı sadece hücreler gibi ayırt etmek için değil, aynı zamanda her bir ata hücresi türetmek ilgili hücrelerin birden fazla farklı klonları renk kodu için kullanılabilir. Bu, geliştirme sırasında birçok farklı klonların ve davranışlarının aynı anda çok katlı bir soy analizine olanak tanır. Burada, gelişmekte olan zebra balığı sinir sistemi içinde çok renkli Brainbow etiketli çok sayıda hücreyi gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için zaman atlamalı konfokal mikroskopiyi kullanma tekniğini açıklıyoruz. Bu, özellikle geleneksel promotör odaklı renkleri kullanarak farklı bir şekilde etiketlemesi zor olan hücreler arasındaki hücresel etkileşimleri takip etmek için yararlıdır. Yaklaşımımız aynı anda birden fazla farklı klon lar arasındaki soy ilişkilerini izlemek için kullanılabilir. Bu teknik kullanılarak oluşturulan büyük veri kümeleri, genetik veya farmakolojik manipülasyonlar arasında nicel olarak karşılaştırılabilen zengin bilgiler sağlar. Sonuçta oluşturulan sonuçlar sinir sisteminin nasıl geliştiği hakkında sistematik sorulara cevap yardımcı olabilir.

Giriş

Gelişimin ilk aşamalarında, özel leştirilmiş progenitor hücrelerinin havuzları proliferatif bölgelerde tekrar tekrar bölünür ve farklı kız hücreleri dizileri üretir. Bu gelişim döneminde doğan hücreler daha sonra farklılaşır ve yeni doğan organları oluşturmak için seyahat ederler. Sinir sisteminde radyal glia gibi atalar ventriküler bölgelerde olgunlaşmamış nöronlara yol açar. Nöronlar ventriküllerden uzaklaşır ve olgunlaşırken, genişleyen doku sonunda beynin son derece karmaşık yapılarını oluşturur1,2,3,4,5,6. Atalarının bölünmesi ve farklılaşma ve nöronların göç arasındaki koordinasyon nihai boyut, şekil belirleyecek ve böylece beynin fonksiyonu, doğrudan davranış etkileyen7,8,9,10. Bu süreçler üzerinde sıkı kontrol açıkça normal beyin gelişimi için çok önemli olmakla birlikte, bu dinamikleri düzenleyen küresel mekanizmalar iyi anlaşılamamıştır. Burada bir hücresel çözünürlükte sinir sistemi gelişimini incelemek için bir araç tarif, araştırmacılar Brainbow ile gelişmekte olan zebrabalığı beyninde progenitor hücreleri ve nöronlar in vivo görselleştirmek ve zaman atlamalı konfokal mikroskopi ile zaman içinde davranışlarını izlemek için izin11. Yaklaşım aynı zamanda gelişmekte olan embriyonun diğer bölümlerini görselleştirmek için adapte edilebilir.

Gelişmekte olan zebra balığı beynindeki hücreleri gözlemlemek ve ayırt etmek için Brainbow hücre etiketlemetekniğini 11'euyarladık. Brainbow, bir hücre popülasyonunu etiketlemek için üç farklı floresan proteinin (FP) rastgele belirlenmiş, birleştirici ekspresyonu kullanır. Brainbow ekspresyonu için varsayılan ifade kırmızı FP dTomato iken, enzim Cre rekombinaz ile rekombinasyon mCerulean (siyan floresan protein, CFP) veya sarı floresan protein (YFP)12,13ifadesi ile sonuçlanır . Bir hücrede ifade edilen her FP'nin birleşik miktarı, hücreye benzersiz bir renk verir ve komşu hücrelerden net görsel ayrım sağlar. Ayrıca, bir ata hücresi bölündüğünde, her kız hücre renk kodlu klonlar üreten ve araştırmacılar hücre soy 11 ,,14izlemek için izin, kendi ana hücreden renk devralacak.11 Başlangıçta farelerde nöronal devreleri analiz etmek için kullanılırken12, Brainbow beri model organizmaların geniş bir yelpazede ifade edilmiştir, zebrabalığı da dahil olmak üzere15.

Tekniğimiz, yaşayan zebra balıklarında zaman içinde birden fazla renk kodlu klonları doğrudan görüntülemek için önceki çok renkli etiketleme ve görüntüleme yöntemlerine dayanmaktadır. Embriyo lar gibi optik şeffaflık nedeniyle, zebra balıkları görüntüleme deneyleri için uygundur16, ve önceki çalışmalarda sinir sistemi11, 15,,17,18,19,20,21,22,23,15,25, çeşitli dokuları incelemek için zebrabalığı Brainbow kullandık24 26,27. Canlı organizmanın doğrudan görüntü yeteneği, onların hızlı eski rahim gelişimi ile birlikte, zebra balığı omurgalı gelişimi değerli bir model yapmak. Memeli beyninin aksine, zebra balığı hindbrain tüm proliferatif bölge endojen çevre6bozulmadan görüntüleme için hazırdır. Bu deneylerin in vitro veya sabit doku preparatları yerine canlı organizmada yapılmasını sağlar. Sabit görüntüleme deneylerinin aksine, in vivo çalışmalar uzunlamasına bir tasarıma olanak sağlayarak desenler için analiz edilebilen saatler süren veriler üreterek nispeten nadir olayları gözlemleme olasılığını artırır. İlgi çekici olayların hızına ve uzunluğuna bağlı olarak, araştırmacılar kısa (1-2 saat) veya uzun (~16 saate kadar) hızlandırılmış görüntüleme deneyleri yapmayı seçebilirler. Zebrabalığı ısı şok organizatörü 70 (hsp70, hsp) kullanılarak, Brainbow ekspresyonu zamansal olarak kontrol edilebilir28,29. Ayrıca, bu organizatör tarafından indüklenen mozaik ifade de etiketleme ve birçok klonlar11izleme için uygundur.

Canlı beyindeki birden fazla klonu görsel olarak tanımlayabilme yeteneği bu yöntemin bir avantajıdır. Sinir sisteminin gelişiminde klonların rolünü araştıran önemli önceki çalışmalar, tek bir ata hücresi ve onun atasını tek bir FP veya diğer kolayca görselleştirilmiş protein kullanarak etiketlemek için retroviral vektörler kullanılmıştır. Bu tür etiketleme araştırmacılar zaman içinde tek bir klon gözlemlemek için izin verir, in vitro veya in vivo2,30,,31,32,33,34,35,36,37,38. Brainbow'un farklı renkleri, bir klondaki hücrelerin davranışını izleme yöntemlerinin aksine, araştırmacıların klonlar arasındaki dinamikleri gözlemlemelerine olanak tanır. Ayrıca, beyindeki birçok klonları etiketlemek için Brainbow kullanılarak, klonal davranışla ilgili ek veriler tek bir klonu11etiketleyen tekniklere göre toplanır. Daha da önemlisi, burada açıklanan yaklaşımlar farklı genetik veya farmakolojik manipülasyonlar18uğramıştır balıklar arasında gelişimsel karşılaştırmalar oluşturmak için genişletilebilir. Genel olarak, bu avantajlar, omurgalı sinir sisteminin gelişimini araştıran araştırmacılar için ideal olan Brainbow ifade eden zebra balığının vivo konfokal görüntülemesinde zaman atlamalı hale getirilmektedir, özellikle de klonların rolüyle ilgilenenler.

Protokol

Hayvan denekleri ile ilgili prosedürler Lewis & Clark Koleji'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Zebrabalığı Embriyolarının Mikroenjeksiyonu

  1. Mikroenjeksiyonlar39,40gerçekleştirmeden önce öğleden sonra seks ayrılmış çiftleme tankları vahşi tip, yetişkin zebra balığı kurmak.
  2. Mikroenjeksiyonların olduğu sabah DNA çözeltisini hazırlayın. Seyreltik hsp:Zebrabow11 plazmid DNA 0.1 mM KCl ~10 ng/μL konsantrasyonu, birlikte 2.5% fenol kırmızı ve 3.75U Cre rekombingaz enzim.
  3. 45 dk içinde tek hücreli zebrabalığı embriyolarına DNA çözeltisi mikroenjeksiyonları yapmak39,41. Bu çözeltinin yaklaşık 4,2 nL'sini her embriyoya enjekte edin, bu da ~42 pg plazmid DNA'sına eşdeğerdir.
    NOT: Tg(ubi:Zebrabow)15 ve Tg(neurod:Zebrabow)18gibi transgenik, Brainbow ifade eden zebra balığı hattı çiftleşirse mikroenjeksiyon adımı atlanabilir. Araştırmacıların kopya numarasını ve etiketleme yoğunluğunu titre etmesine olanak sağladığı için mikroenjeksiyonların yapılması avantajlı olabilir. Ayrıca, belirli bir gen ürününü etiketleyen veya işleyen ikinci bir DNA yapısı istenirse Brainbow' un yanına enjekte edilebilir (örn. Brainbow18'i tamamlayan uzak kırmızı floresan protein).
  4. E3 orta39 petri kaplarda enjekte embriyolar korumak 28 °C kuvöz 24 saat.

2. Brainbow İfadesi İndüklemek için Isı Şoku

NOT: Plazmid DNA enjekte veya transgen ifade ifade hsp70 organizatörü kullanarak ifade kullanmıyorsa, ısı şoku adımı atlanabilir ve sağlıklı embriyolar hemen fenilthiourea transfer edilmelidir (PTU) 24 saat sonrası döllenme (hpf).

  1. 24 hpf'de, enjekte edilen embriyo grubundan ölü ve deforme olmuş embriyoları itlaf edin. Daha sonra, sağlıklı embriyoları 20'ye kadar embriyo/tüp içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
  2. Tüpleri 10 mL E3 ile doldurun. Her tüpün üzerine bir kapak yerleştirin, ancak sıkıca kapatmayın.
  3. 50 mL tüpleriçeren tüp rafını 37 °C'lik bir su banyosuna dik olarak yerleştirin. Banyodaki su seviyesinin tüplerdeki E3 seviyesinden daha yüksek olduğundan emin olun ve 80 ila 90 dk bekletin.
  4. Su banyosundan embriyolarla birlikte tüp rafını çıkarın ve 28 °C'lik kuluçka makinesine dik olarak dönün. E3'ün soğuması için 1 saate kadar bekleyin ve embriyoların yavaş yavaş ısıya yeniden alışmalarına izin verin. Daha sonra embriyoların E3'teki 0.2 mM PTU'luk Petri yemeklerine aktarılması, embriyoların pigmentasyonunu önlemek için kuvözde ısındı.
    DİkKAT: PTU, özenle ele alınması ve uygun şekilde bertaraf edilmesi gereken toksik bir kimyasaldır. Eldiven giymesi önerilmektedir.

3. Brainbow İfadesi Için Embriyo Ların Taranması

  1. Isı şokundan sonra 2 ila 4 saat, cfp veya YFP ekspresyonu için standart floresan diseksiyonu mikroskobu altında embriyoları inceleyin, bu da başarılı Brainbow rekombinasyonunu gösterir (dTomato'nın varsayılan ekspresyonundan).
    NOT: Birden fazla floresan filtre seçeneği varsa, CFP için tarama iyi yeniden birleştirilmiş balık tanımlamak için en verimli yoldur. CFP ve YFP filtreleri mevcut değilse, YFP spektral profillerindeki çakışma nedeniyle yeşil floresan protein (GFP) filtreleri altında da dim olarak görselleştirilebilir.
  2. Boyunca sağlam FP ifadesine sahip embriyoları seçin ve PTU ile ayrı bir tabağa aktarın. Görüntü embriyolar 1 gün sonrası döllenme (dpf; 28 hpf veya daha sonra) veya PTU ve görüntü 2 veya 3 dpf embriyoları korumak.

4. In Vivo Görüntüleme için Montaj Embriyolar

  1. Deney gününden önce, görüntüleme odasını ve embriyo manipülasyon aracını hazırlayın.
    1. 60 mm Petri kabının ortasına plastik bir halkayı dikkatlice yapıştırarak görüntüleme odasını hazırlayın.
    2. İsteğe bağlı olarak, montaj sırasında çanak ve yönlendirmek embriyolar içinde embriyotaşımak için özel yapılmış bir embriyo manipülatör hazırlamak. Bir ~ 4 uzunluğunda kesilmiş bir ahşap pamuk lu bez sopa sonuna naylon olta (~ ~ 1 / 2 içinde, ~ 6 lb) küçük bir uzunlukta supergluing tarafından manipülatör inşa.
  2. Gerekirse (yani, 2 dpf veya daha erken görüntüleme), embriyolar bir diseksiyon mikroskobu altında şırınga lar kullanılarak dechorionate monte önce.
  3. Zebra balığı embriyolarını anestezik.
    1. 60 mm'lik Petri kabını E3 ile yarıya doldurun ve ~0,2 mM'lik son konsantrasyona 4 mg/mL MS-222 Tricaine-S'den 5-6 damla ekleyin. Karıştırmak için girdap.
      DİkKAT: Tricaine özenle ele alınmalıdır ve uygun şekilde bertaraf edilmelidir.
    2. Embriyoların PTU'dan tricaine solüsyonuna aktarılması, mümkün olduğunca az PTU transferi olmasını sağlar. Balık refleksleri 1-2 dakika sonra sona ermelidir iken, zaman atlamalı görüntüleme deneyleri için ayrıntılı anestezi sağlamak için 10 dakika kadar trikotin embriyolar bırakın.
    3. Embriyoların düzgün bir şekilde anestezi yediğini doğrulayın. Embriyo manipülatör ile yavaşça embriyo kuyrukları dokunarak ürkme refleks değerlendirmek. Bir refleks hareketi gözlenirse, mümkün olduğunca embriyolar ve karıştırmak için girdap kadar çanak için tricaine ek bir damla ekleyin. Bir diseksiyon kapsamı altında embriyo kalp hızı gözlemleyin. Anormal yavaş ise, tricaine konsantrasyonu azaltmak için çanak E3 ek damla ekleyin.
  4. Agarose'da anestezili embriyolar dağılın.
    1. Balıkları görüntüleme odası içindeki plastik halkanın merkezine aktarın ve ince uçlu transfer pipetini kullanarak mümkün olduğunca fazla E3'ü çıkarın.
    2. Temiz bir transfer pipeti kullanarak, 42 °C'de saklanan E3'te %1,0 az erimiş agarose (LMA) ile balıkların üzerini kapatın ve tüm plastik halkayı ince bir agarose tabakası ile doldurun. Embriyoları yavaşça pipet ucuna çekmek ve hava kabarcıkları çıkarmadan agarose içine geri çekmek için bir transfer pipet kullanın.
    3. Agarose sertleşmeden önce, hızlı bir şekilde uygun balık yönlendirmek için bir embriyo manipülatör kullanın. Dik bir mikroskopla görüntülenme varsa, embriyoları mümkün olduğunca agarose üst yüzeyine yakın konumlandırın. Embriyoları görüntüleme odasının altına paralel olarak kuyruk düz olarak yerleştirin.
      NOT: Arka beyin görüntüleme için, embriyolar bir dorsal veya sagital görünümde konumlandırılmış olabilir. Agarose hala sıvı iken embriyoların başları lavabo değil emin olmak için dikkatli olunmalıdır. Diğer oryantasyonlar görüntüleme için diğer gelişmekte olan dokuları hedeflemek için uygun olabilir. Ters mikroskoplar için, montaj farklı, genellikle bir cam dipli Petri kabın altına yakın balık konumlandırma yapılabilir.
  5. Agarose sertleşmek için bekleyin, sonra E3 ile görüntüleme odası doldurun. Görüntüleme boyunca buharlaşmayı hesaba katmak için mümkün olduğunca çok E3 ekleyin.

5. Zebrabalığı Hindbrain Geliştirme Zaman Atlamalı Konfokal Görüntüleme

  1. Görüntüleme için hazırlık için konfokal mikroskobun üzerine görüntüleme odasıyerleştirin.
    1. Konfokal mikroskobun üzerine balık ve E3 ile görüntüleme odası yerleştirin.
    2. Yüksek sayısal diyafram açıklığına ve 20x su daldırma hedefi (1,0 NA) gibi uzun çalışma mesafesine sahip bir hedef seçin.
    3. İlgi çeken hücre türü(ler)in uygun şekilde yoğun ve parlak etiketleen bir bölge bulun.
      NOT: Uzun görüntüleme seansları sırasında sıcaklık ve nemi düzenlemek için mikroskop üzerindeki sıcaklık kontrollü bir aşama/cihaz da kullanılabilir. Bu buharlaşmayı azaltabilir.
  2. Brainbow görüntüleme için edinme parametrelerini ayarlayın.
    1. Her FP kanalInı sırayla görüntüleyin. Ticari bir yazılım (örneğin, Zen yazılımı) kullanıyorsanız, bu üç "parça" hazırlanarak yapılır. 458 nm ve YFP 514 nm CFP heyecanlandırmak için bir Argon lazer kullanın. DTomato heyecanlandırmak için bir DPSS 561 nm lazer kullanın. CFP için 463-509 nm, YFP için 519-555 nm ve dTomato için 566-691 nm arasında emisyon toplayın.
    2. Ekrandaki ekran için CFP'yi mavi, YFP'yi sarı ve dTomato kırmızı olarak kodlayın.
      NOT: Bu ayarlar, konfokal mikroskopta hangi lazer hatlarının ve diğer özelliklerin mevcut olduğuna bağlı olarak değişir. Görüntüleme hızını artırmak için, CFP ve dTomato kanalları kayda değer bir kanama olmadan aynı anda görüntülenebilir. Uzak kırmızı FP gibi ayrı bir FP de görüntüleniyorsa, bu durum YFP ile sırayla veya aynı anda görüntülenebilir.
    3. Genel görüntüleme parametrelerini en az 1024 x 1024 çözünürlüğe sahip ve ortalama iki kez 16 bit görüntü alacak şekilde ayarlayın. Yakınlaştırmayı, ilginin bölgeye ve hücre türüne bağlı olarak ayarlayın (örneğin, 20 x hedefiyle arka beyin görüntüleme için zum 1.0-2.5 arasında değişir). Zaman içinde balık büyüme sağlamak için görüş alanını en üst düzeye çıkarın.
    4. Bir parçayı aynı anda görüntülemek (ve fotobeyaztmayı önlemek için diğer lazerleri kapatmak), her FP için satın alma ayarlarını ayrı ayrı optimize edin (örn. lazer gücü, iğne deliği boyutu, fotoçarpan tüp kazancı, vb.).
    5. Görüntüye Z-yığın aralığını seçin.
      NOT: Uzun görüntüleme seansları için (>2 saat), balığın görüntüleme boyunca büyümeye devam edeceği göz önünde bulundurulur, böylece hem XY alanı hem de Z-yığın aralığı bunun için ekstra oda ile hesap vermelidir. Eğer arka beyin görüntüleme, görüntüleme döneminde doku rostrally hareket etmek için alanda boşluk içerir. Z boyutundaki büyüme için alanın da dahil edilmesi gerekir. Balığın sagittal veya dorsal görünüm için konumlandırılmış olup olmadığını, ilgi alanının yaklaşık 10-20 m üzerinde görüntüye ekleyin.
  3. Hızlandırılmış görüntüleme için parametreler ayarlayın.
    1. Bir zaman aralığı seçin. Aralık uzunluğu 10-30 dakika arasında değişen gelişmekte olan arka beyinde mitotik ve apoptotik olayları izlemek için. Aralık uzunluğu, ilgi olaylarının hızına ve tek bir Z yığınını yakalamak için gereken toplam süreye bağlı olarak değişir.
    2. Görüntüleme oturumunun uzunluğunu seçin. Hızlandırılmış görüntüleme seansları genellikle bir gecede gerçekleşir ve en az 16 saat sürebilir.
  4. Deneyi çalıştırın.
    NOT:     Balık, görüntülemeden hemen sonra ötenazi yedirilebilir veya şırıngalar kullanılarak agarose'dan dikkatlice kesilebilir ve iyileşmek için E3'e geri döndürülebilir. Daha sonra kurtarılan balıklar daha sonraki bir zaman noktasında tekrar görüntülenebilir, ancak hücre konumu ve derinliği genel büyüme nedeniyle bu dönemde değişecektir.

6. Hızlandırılmış Dosya Yönetimi

  1. Görüntü dosyasını çözümleme yazılımına aktarın.
    1. Zen yazılımını kullanıyorsanız, görüntü edinimi tamamlandıktan sonra dosyayı .czi biçiminde kaydedin. Ham verileri Fiji42 ve/veya diğer yazılımlarla uyumlu bir biçimde kaydettiğinden emin olun.
    2. BioFormats Importer kullanarak Fiji yazılımına aktarın.
      NOT: Hızlandırılmış dosyalar büyük olacaktır ve çözümleme için açılması için önemli miktarda zaman ve bellek gerektirebilir. Bu nedenle, nasıl kaydedilir ve açılır stratejik olmak yararlıdır. Bu göz tarafından ilgi olayları aramak için daha kolay açılabilir daha düşük kaliteli bir sürümünü kaydetmek için yararlı olabilir.
  2. Fiji kullanıyorsanız, zaman atlamalı dosyaların daha küçük, daha yönetilebilir alt kümelerini oluşturun. Resim' i tıklatarak zamana göre (örneğin, tam Z yığınını ilk anda görüntüleme) veya derinliğe göre (örn. her zaman noktasında ilk 50 Z bölümünü görüntüleme) alt kümeler oluşturun | Yığınlar| Araçlar| Alt Yığın olun.

7. Brainbow Görüntülerinin Nicel Klonal Renk Analizi

  1. Fiji'deki ilgi hücreleri için ortalama kırmızı, yeşil ve mavi (RGB) yoğunluk değerlerini ölçün.
    NOT:     Bu talimatlar Fiji görüntü analizi için özeldir. Ancak, araştırmacılar alternatif bir yazılım programında ortalama RGB yoğunluk değerleri elde etmeyi tercih edebilirler.
    1. Görüntünün kenarlarında siyah boşluk olmaması için dosyanın doğru kırpılmış olduğundan emin olun. Siyah uzay, analiz için gereken minimum yoğunluk ölçümlerini yapay olarak düşürür. Dosyanın kırpılması gerekiyorsa, Dikdörtgen Seçim Düğmesi'ni seçin ve tüm siyah boşluk hariç olmak üzere görüş alanının etrafına ilgi alanı (YG) çizin. Resim| Kırpma.
    2. Ölçüm aracını ortalama, minimum ve maksimum gri değer ölçümleri alacak şekilde ayarlayın. Analiz Et' i tıklatın | Ölçümleri ayarlayın. Min & Max Gray Value ve Ortalama Gri Değeri için onay kutularının her ikisinin de seçildiğinden emin olun.
    3. Fiji'deki ham veri dosyalarını veya subsetted Z-yığınlarını görüntülemede, klonal renk çözümlemesi için ilgi çekici hücreleri bulun. Arka beyinde, putatif klonlar görsel olarak ortak tonlarının yanı sıra radyal yönelimleri ile de tanımlanabilir. Başka bir rengin komşu hücreleriyle yakın temas halinde olan ve bu nedenle çözülmesi zor olan hücreleri seçmeyin. Onların tonunu ölçmek zor olabilir.
    4. Z-scrollbarkullanarak ilgi hücresinin merkezi Z-düzlemini bulun. Oval Seçim Düğmesine sağ tıklayın ve Eliptik Seçim Düğmesiniseçin. Diğer seçim araçları farklı hücre türleri için uygun olacaktır. Hücre gövdesinin merkezi ~2/3'ünün etrafına eliptik bir yatırım getirisi çizin.
    5. C kaydırma çubuğunukullanarak kırmızı (dTomato) kanalını seçin. Analyze| Ölçün. Yeşil (YFP) ve mavi (CFP) kanalları için aynı yatırım getirisi ve odak düzlemi ile tekrarlayın ve tüm ortalama yoğunluk değerlerini kaydedin.
    6. İlgi hücresindeki eliptik Yatırım Getirisi'ni kaldırmak için görüntünün herhangi bir yerine tıklayın.
    7. Normalleştirme için arka plan düzeylerini ölçmek için C-scrollbar'ı kullanın ve kırmızı (dTomato) kanalını seçin. Analyze| Ölçün. Yeşil (YFP) ve mavi (CFP) kanalları için aynı odak düzlemi ile tekrarlayın ve tüm minimum yoğunluk değerlerini kaydedin.
  2. İlgi hücreleri için göreli RGB kanal ağırlıklarını hesaplayın.
    NOT:     Bu yoğunluk değerlerinden göreli RGB kanal ağırlıklarının hesaplanması Microsoft Excel veya R43gibi çeşitli yazılım programlarında gerçekleştirilebilir.
    1. O kanal ve odak düzlemindeki tüm alandan en az yoğunluğu çıkararak her kanal için hücre Yatırım Getirisi'nin ortalama yoğunluk ölçümlerini normalleştirin.
    2. Hücrenin toplam normalleştirilmiş RGB yoğunluğunu bulmak için her kanaldan normalleştirilmiş ortalama RGB yoğunluk değerlerini toplamı.
    3. Her kanalın göreli kanal ağırlığını, o kanalın normalleştirilmiş ortalama yoğunluğudeğerini toplam normalleştirilmiş RGB yoğunluğuna bölerek hesaplayın.
  3. R43,44için Üçüncül paketi kullanarak üçüncü çizer çizimler olarak göreceli RGB kanal ağırlıkları görüntüleyin. Üçüncül çizimler, benzer renklerin 3B RGB alanında kümelemesini görselleştirmek için yararlıdır.
  4. Hücre renkleri arasındaki farkı ölçmek için renk yayma katsayısını hesaplayın.
    1. Aşağıdaki denklemi kullanarak 3B RGB alanında iki renk arasındaki Öklid uzaklığı hesaplayın:
      figure-protocol-16102
      R, G ve B'nin 7,2 olarak hesaplanan göreli RGB kanal ağırlıkları olduğu yer.
    2. Anlama kolaylığı için, 0 ile 1 arasında bir renk yayma katsayısı elde etmek için renkler arasındaki maksimum mesafe olan √2'ye bölerek renk mesafesini normalleştirin, 0 tam olarak aynı rengi gösterir ve 1 tamamen farklı renkleri gösterir (örn. saf kırmızı ve saf mavi).

Sonuçlar

Bu bölümde, burada açıklanan in vivo çok renkli hızlandırılmış görüntüleme yaklaşımı kullanılarak elde edilebilen sonuçlara örnekler gösterilmektedir. Gelişmekte olan zebra balığıhindbrain14 proliferatif ventriküler zonlarında hücrelerin Brainbow renk kodlu klonları göstermek(Şekil 1).

Tipik olarak, Brainbow etiketli hücreler belirli bir radyal lif boyunca düzenlendiğinde, göreceli RGB kanal ağırlıkları...

Tartışmalar

Bu protokol, gelişmekte olan zebra balığı arka beyninde progenitor hücreleri ve nöronların klonlarını görselleştirmek ve Brainbow ve zaman atlamalı konfokal mikroskopi11kullanarak in vivo onları takip etmek için bir yöntem açıklar. Bu protokolün in vitro veya ex vivo çalışmalara kıyasla en büyük avantajı, omurgalı beyninin proliferatif bölgesini zaman içinde doğal ortamında doğrudan gözlemleyebilme yeteneğidir. Bu teknik retroviral vektörler kullanarak tek bir klo...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Y. A. Pan, J. Livet ve Z. Tobias'a teknik ve entelektüel katkıları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (Ödül 1553764) ve M.J. Murdock Charitable Trust tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5mL transfer pipetGlobe Scientific, Inc.134020
1-phenyl-2-thiourea (PTU)Alfa AesarL06690Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation
50ml conical tubesCorning352070For heat shocking embryos
6 lb nylon fishing lineSecureLineNMT250For making embryo manipulators
7.5mL transfer pipetGlobe Scientific, Inc.135010
CaCl2SigmaC3881For E3
Cotton swabsPuritan867-WC NO GLUEFor making embryo manipulators
Cre recombinaseNew England BiolabsM0298M
Digital dry bathGenemate490016-616Used to store LMA at 40°C
Epifluorescence dissection scope
Glass capillary tubesWorld Precision InstrumentsTW100F-4
IncubatorForma Scientific3158To maintain embryos at 28°C
Injection plate moldsAdaptive Science ToolsTU-1
Isotemp water bathFisher Scientific2320For heat shocking embryos
KClAMRESCO0395For E3 and for DNA solution for injections
Laser-scanning confocal microscopeZeissLSM710
LE agaroseGenemateE3120To create agarose injection plates
Low-melt agarose (LMA)AMRESCOJ234
Mating tanksAquaneering, Inc.ZHCT100
Methylene blueSigmaM9140For E3
MgSO4Sigma9397For E3
MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301
Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-97
MS-222 Tricaine-SWestern Chemical, Inc.Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos
NaClJ.T. Baker4058-01For E3
Petri dishes (90 mm, 60 mm)Genesee Scientific32-107GTo house embryos and create imaging chamber (60 mm)
Phenol redSigmaP0290
Soft stitch ring markersClover Needlecraft, Inc.354For creating imaging chamber with Petri dish
Super glue (Ultra gel control)Loctite1363589For making embryo manipulators
Syringe needlesBeckton DickinsonBD329412For dechorionating embryos

Referanslar

  1. Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
  2. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  5. Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
  6. Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8, 3 (2013).
  7. Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
  8. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  9. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
  10. Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
  11. Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
  12. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  13. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
  14. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  15. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  16. Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120 (2011).
  17. Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
  18. Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
  19. Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
  20. Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
  21. Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53 (2013).
  22. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  23. Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
  24. Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
  25. Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F., Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. , 41-49 (2017).
  26. Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
  27. Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
  28. Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
  29. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
  30. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  31. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
  32. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
  33. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
  34. Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
  35. Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
  36. Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
  37. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  38. Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
  39. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
  40. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
  41. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115 (2009).
  42. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  43. R Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
  44. Smith, M. R. . Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
  45. Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  46. Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635 (2012).
  47. Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239 (1972).
  48. Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
  49. Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
  50. Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
  51. Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imbiyolojisiSay 157mikroskopin rolojikgeli imBrainbowzebrabalsoy takibiin vivo g r nt lemebeyinarka beyinh cre b l nmesi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır