测量在C.elegan的RAN肽毒性

摘要

重复相关非ATG相关转化产品是几种重复扩张性疾病的病原特征。所述协议的目的是使用模型系统C.elegans的行为和细胞测定来评估这些肽引起的毒性。

摘要

C. elegans通常用于模拟由重复扩张突变引起的与年龄相关的神经退行性疾病，如肌萎缩性侧索硬化症 （ALS） 和亨廷顿舞蹈症。最近，含有重复膨胀的RNA被证明是一种新型蛋白质翻译的基质，称为重复相关非AUG依赖性（RAN）翻译。与规范翻译不同，RAN 翻译不需要启动协和，并且仅在重复超过阈值长度时发生。由于没有开始协理来确定读取帧，RAN 翻译出现在包含重复扩展序列的感知和反感觉 RNA 模板的所有读取帧中。因此，RAN 翻译将可能的疾病相关有毒肽的数量从 1 扩展到 6。到目前为止，RAN翻译已经记录在八种不同的重复扩张为基础的神经退行性疾病和神经肌肉疾病。在每种情况下，破译哪些RAN产品是有毒的，以及它们的毒性机制，是了解这些肽如何促进疾病病理生理学的关键步骤。本文提出了在模型系统C.elegans中测量RAN肽毒性的策略。首先，我们描述了测量RAN肽毒性的程序，对发育的C.elegans的生长和活力。其次，我们详细介绍了一种用于测量RAN肽在运动性上发育后、年龄依赖作用的测定方法。最后，我们描述了一种神经毒性测定，用于评估RAN肽对神经元形态的影响。这些测定提供了RAN肽毒性的广泛评估，可用于执行大规模遗传或小分子屏幕，以确定疾病机制或疗法。

引言

DNA重复序列的不当扩展是几种神经退行性疾病的遗传基础，如肌萎缩性侧索硬化症（ALS）、前额痴呆症（FTD）和亨廷顿舞蹈症^（HD）1。虽然这些疾病已建立细胞和动物模型，但这些条件背后的机制没有明确界定。例如，HD 是由亨廷顿蛋白 Htt²的编码序列中 CAG 重复序列的扩展引起的。由于CAG编码氨基酸谷氨酰胺，CAG重复膨胀导致在Htt内插入多谷氨酰胺或聚Q序列。 膨胀的聚Q蛋白形成长度和年龄相关蛋白聚合体，与毒性^33，44相关。令人惊讶的是，最近的两项研究表明，聚Q序列的长度不是导致HD疾病发病的主要原因，这表明与多Q无关的因素也可能导致这种疾病^55，6。6

一种可能的聚Q无关机制涉及一种新发现的蛋白质翻译类型，称为Repeat A分离N对AUG依赖（RAN）翻译^7。顾名思义，RAN 翻译仅在存在扩展重复序列且不需要规范启动子序时发生。因此，RAN转换发生在重复的所有三个读取帧中，以产生三个不同的多肽。此外，由于许多基因还产生一个反感觉转录，其中包含扩展重复序列的反向补充，RAN翻译也发生在反意义笔录的所有三个阅读帧中。RAN 翻译共同将从扩大的含重复性 DNA 序列中产生的蛋白质数量从一个肽扩展到六种肽。迄今为止，RAN翻译已经观察到至少8个不同的重复膨胀障碍^8。RAN肽在验尸病人样本中观察到，并且仅在患者进行扩大的重复^99，1010的情况下。虽然这些肽在患者细胞中明显存在，但它们对疾病病理生理学的贡献尚不清楚。

为了更好地确定与RAN肽相关的潜在毒性，几个小组在各种模型系统中表示每种肽，如酵母、苍蝇、小鼠和组织培养细胞11、12、13、14、15、16。^{11,12,13,14,15,16}这些模型没有利用重复序列进行表达，而是采用一种共变法，即消除重复序列，但保留氨基酸序列。翻译启动通过规范的ATG发生，肽通常融合到N-或C-terminus的荧光蛋白，这两种蛋白质似乎都不会干扰RAN肽的毒性。因此，每个构造都过度表示单个 RAN 肽。通过简单的测定对多细胞生物体中不同的RAN产品进行建模，以测量RAN肽毒性，对于了解不同RAN产品从每个致病的重复扩张如何导致细胞功能障碍和神经退化至关重要。

与其他模型系统一样，C. elegans提供了一个灵活而高效的实验平台，能够研究新的疾病机制，如 RAN 肽毒性。蠕虫提供了几种独特的实验属性，目前在其他RAN肽毒性模型中不可用。首先，从出生到死亡，C.elegans在光学上是透明的。这允许对RAN肽表达和定位进行简单的可视化，以及活体动物神经退化的体内分析。其次，生成RAN肽表达模型的转基因方法价格低廉，速度快。鉴于C.elegans的短三天生命周期，在一周内可以产生稳定转基因线，以细胞型特定的方式表达任何给定的RAN肽。第三，简单的表皮输出可以与基因筛选方法相结合，如化学诱变或RNAi筛选，以快速识别RAN肽毒性所必需的基因。最后，C. elegans的短寿命（+20天）使研究者能够确定衰老，这是大多数重复扩张性疾病的最大危险因素，如何影响RAN肽毒性。这种实验属性的组合在任何其他模型系统中都是无可比拟的，为RAN肽毒性的研究提供了一个强大的平台。

在这里，我们描述了几个测定，利用C.elegans的实验优势来测量RAN肽的毒性，并确定这种毒性的基因修饰剂。Codon-uns-ATG启动的RAN肽被标记与GFP，并在肌-3启动器下的肌肉细胞或非c-47启动子作用器下的GABAergic运动神经元中单独表达。对于肌肉细胞的表达，重要的是有毒的RAN肽被标记绿色荧光蛋白（GFP），或其他荧光蛋白（FP）标签，可以针对RNAi喂养载体。这是因为有毒的RAN肽表达通常阻止生长，使这种菌株不可行。使用gfp（RNAi）有条件地不激活RAN肽表达，并允许菌株维持，遗传交叉等。对于检测，这些动物从gfp（RNAi）中去除，这允许表达RAN肽和由此产生的表型。除了设计Codon-变型RAN肽表达构造的分子策略外，我们还描述了用于测量发育毒性（幼虫运动和生长测定）、发育后年龄相关毒性（麻痹测定）和神经元形态缺陷（共性测定）的测定。

研究方案

1. 生成共性多变的 RAN 肽表达构造

1. 利用同义词子共体设计单个 RAN 肽编码序列，以消除基本的重复 DNA/RNA 结构，但保留覆盖氨基酸序列。
2. 按研究所需的重复长度（通常为 5-100 个重复）以商业方式订购自定义协当序列。在 5' 末端包括 HindIII 限制站点和 3' 末端的 BamHI 限制站点，以方便克隆到C. elegans表达式载体，如 pPD95.79。
   注:如果大型构造的合成证明困难，则可以合成较小的构建基块序列，然后使用方向连接策略¹⁷构建成较大的重复。
3. 使用标准 T4 连接方法将肽序列子克隆到C. elegans表达式向量中。
4. 子克隆由PCR在RAN肽序列前生成的细胞类型特异性促进子体序列，以驱动组织特异性RAN肽-GFP表达。
5. 将RAN肽构造微注入野生C型elegans的果子，使用标准方法¹⁸生成含有染色体外阵列的转基因菌株。对于共注射标记，使用了肌肉特异性RFP报告器（myo-3p:RFP （pCFJ104），尽管其他标记也可以使用。
6. 使用标准的C.elegans集成筛选方法将稳定的转基因集成到基因组^中19。
7. 如果RAN肽是有毒的，转基因动物不能生存，饲料动物gfp（RNAi）在注射前和注射后表达细菌，以抑制有毒蛋白质的表达。
   注:从gfp（RNAi）去除动物，使用下面描述的测定，使RAN肽表达可用于型比分析。

2. 测量基于RNAi的基因敲除后RAN肽的发育毒性:视频速度分析协议

1. 倒注标准线虫生长介质 （NGM） RNAi 24 孔板，具有 1 mM 同丙基 β-D-1-硫酰甲酰甲酰（IPTG）和 25 μg/mL 卡白素。
2. 将HT115细菌中的RNAi喂养克隆物检测到Luria肉汤（LB）+卡白霉素（25 μg/mL）加盘上，并在37°C下生长细菌24小时。 empty vector(RNAi) gfp(RNAi)
3. 对于每个克隆，将单个菌体选入 1 mL LB + 卡白霉素液体介质中，在 37°C 下过夜 18 小时，同时以每分钟 250 次旋转 （RPM） 摇动。
4. 发现NGM RNAI 24井的四口井，20 μL的过夜细菌培养:柱1井= gfp（RNAi）;第2列井 = （EV）RNAi;列 3⁄6 井 = RNAi 反对要测试的基因。允许RNAi细菌在室温 （RT） 下诱导 dsRNA 生产过夜。
5. 使用标准次氯酸盐法将表达集成 RAN 肽转基因的成年C. elegans与第一天中的卵子分离，并将 #30 C. elegans鸡蛋分离到 NGM RNAi 24 井板的每个孔中。
6. 在20°C下孵育24口井7天。
   注:此孵育时间为表达有毒 C9orf72 RAN 二肽的菌株，如 PR50 或 GR50。其他菌株可能需要更短的孵育时间，以防止细菌食物来源的耗尽和随后的饥饿。
7. 使用配备 DFC345FX 单色摄像机的 Leica MZ16FA 立体解剖显微镜获取传输光视频，该摄像机连接到运行 Leica AF 视频采集软件（版本 2.6.0.7266）的 Windows 兼容 PC 上。
   1. 使用井之间的一致视频采集设置，为每个 RNAi 条件从两个单独的井中获取两个视频。对于每个视频，使用 18.6 倍的放大倍率（自动对焦软件中的 1.49 变焦设置），以 800 x 600 像素分辨率获取 10 秒，每秒获得 13.16 帧（时间体素尺寸 = 0.076 秒）。将图像曝光时间设置为 4 毫秒。使用应变、RNAi 状况和井号立即标记每个视频。
8. 通过随机化视频的顺序并将视频的名称更改为数字，使实验者对与每个视频文件关联的基因型视而不见。将此组视频另存为新文件。分析完成后，对实验者进行不盲。
9. 测量每个视频中20种不同动物的"行驶距离"和每种动物的长度，检查每个RNAi状态共40只蠕虫。
   1. 在软件中，选择注释工具按钮，然后选择绘制文本工具。单击在视频的第一帧中测量的蠕虫中心中的点，并将其标记为数字。在目视跟踪蠕虫的运动路径时，将视频推进到末尾。在最后一帧中，单击要测量的蠕虫中心中的点并标记下一个相应的数字。然后，使用绘制比例尺工具，从第一个数字绘制一条线到第二个数字来记录"行驶距离"。
   2. "行驶的距离"是两个心心点之间的距离。此距离显示在测量线附近。在电子表格中记录此度量值。在视频中对 19 个其他蠕虫重复此测量，同时在分析窗口中保留每个单独的测量值。
10. 从表现出最强劲运动的动物身上进行测量，以避免选择没有运动的动物，并将数据偏向瘫痪。测量完成后，拍摄最后视频帧的快照，说明所有测量线，以便数据可以追溯到它源自的动物。
11. 使用四列电子表格分析数据。第一列是蠕虫"标识符"，第二列是行驶距离/时间（速度）。
    1. 通过右键单击实验下的视频并访问视频的属性，可以找到每个视频的时间。
12. 通过选择"量化"，然后选择软件上的统计信息，通过查找每种动物的长度来标准化速度测量。单击视频显示上的注释工具图标应允许使用"绘制折线"工具。然后，此工具可用于从视频从头部尖端到尾部的尖端自由跟踪C. elegans。行的长度将记录在统计信息下。
    1. 拍摄最终视频帧的快照，说明用于调整C. elegans大小的所有折线，以便数据可以追溯到它们源自的动物。
13. 通过向电子表格中添加另外两列来分析数据。第三列是"动物长度"，第四列是"标准化速度"（速度/动物长度）。使用单向 ANOVA 与空矢量 （RNAi）进行后检测，分析标准化速度数据。

3. 测量RAN肽的发育毒性:生长测定

1. 在gfp （RNAi）、（EV）RNAi(EV)RNAi,或（基因特异性）6 cm RNAi板上，将 +30 肉汁动物放入 50 μL 的次氯酸盐溶液（10 mL 漂白剂、2.5 mL 10 N NaOH、37.5 mL dH₂O）点中。
2. 24小时后，将从次氯酸盐溶液点爬出的6个转基因后代移到一个新的6厘米RNAi板，与接受次氯酸盐溶液处理的板上的RNAi条件相同。将这些后代 （F1） 置于 20°C 下，以生长和繁殖。
3. 在24~48小时后，将10只转基因L4动物选到6厘米的RNAi上，与动物生长的RNAi条件相匹配。让动物在20°C的培养箱中脉冲产卵24小时。
4. 24小时后，取出成年动物并丢弃它们。使用机械手持计数器计算 24 小时期间放置的鸡蛋和 L1 幼虫的数量。这是总育雏大小。
5. 在接下来的 72 小时中，计算达到 L4 或更长阶段的动物数量。计算每只动物时，将其从盘子中取出。
6. 将"百分比增长"量化为达到L4或更老阶段的动物的百分比，超过总育雏大小。
7. 执行 2 x 2 Fisher 与空矢量 （RNAi）的精确测试，以确定百分比增长是否具有统计显著性。比较的类别是"生长"（在72小时达到L4或更老阶段的动物）和"无生长"（总育雏大小减去72小时达到L4或更老阶段的动物数量）。

4. 发育后RAN肽麻痹测定

1. 通过将4⁄6个转基因L4放在6厘米gfp（RNAi）的盘子里，在20°C下生长蠕虫，保持合成C.elegans转基因菌株在gfp（RNAi）上的肌肉中表达RAN肽-GFP。 gfp
2. 如果实验利用RNAi来测试RAN肽毒性的遗传效应，将10个转基因重力成人从未饥饿的板移动到两个6厘米空载体（RNAi）（瘫痪阳性控制，遗传效应负控制），gfp（RNAi）（瘫痪的负对照，遗传效应的阳性控制），基因特异性（RNAi）（即，每6厘米板10个重力成人）。
3. 如果突变体用于分析RAN肽毒性的遗传效应，则将10只重力WT或突变动物在两个6厘米空载体（RNAi）或gfp（RNAi）板上分别表示相同的RAN转基因。在20°C下生长蠕虫48小时。
4. 从 6 厘米 RNAi 板中挑选 10 套 10 套 10 个转基因 L4，并将每组放在 3 厘米 RNAi 板上（即，每个基因型为 100 只动物）。确保为测定选择的 L4 都有表面上的正常运动。将板放在拉链存储袋中，以保持水分。
5. 将带 L4 的袋装板放入 25°C 培养箱中。
6. 24小时后从25°C培养箱中取出一个菌株，以尽量减少它们在RT的出水时间。
7. 点击解剖显微镜上的板，检查运动情况。如果动物移动超过身体长度，将动物计数为移动动物，并将其转移到新的 3 厘米 RNAi 板。使用铂金选料敲击头部或尾部的剩余蠕虫。如果动物移动超过身体长度，将动物计数为移动动物，并将其转移到新的 3 厘米 RNAi 板。
   注:传输时，每板不要超过 10 个蠕虫。小心避免将后代移至新的RNAi板，因为测定只取决于跟踪年迈的动物。
8. 将所有未移动的蠕虫组合在一起，以便可以轻松检测到超过身体长度的移动。给动物至少一分钟移动多个身体长度。如果它仍然不动，它瘫痪，袋袋（即，幼虫孵化在母亲体内），或死亡。
9. 检查动物，表现出袋装，在盘子的两侧脱发，表现出挤出的肠子，洞穴，迷路，或死于检测时，检测。瘫痪的蠕虫被计数，留在旧的RNAi板，并丢弃。
10. 如步骤 4.6_4.9 所述，每天为动物打麻痹，连续 5-7 天得分。
11. 使用与用于分析寿命的日志级测试相同的日志级测试分析瘫痪数据。在此统计分析中，移动蠕虫被评分为"活"，瘫痪蠕虫被打为"死亡"，死、袋、肠挤压、干燥、挖洞或其他丢失的蠕虫被打为"检查"。
    注:在此分析中，"活动百分比"数字表示"移动百分比"动物。反向表示"瘫痪百分比"。使用在线分析工具 OASIS （https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/） 执行日志排名统计分析。

5. 测量神经元病理学:共性测定

1. 使用unc-47促进剂生成转基因C. elegan表达对 GABAergic 神经元感兴趣的 RAN 肽。也表达unc-47p::GFP或unc-47p::RFP，以揭示GABA神经元的细胞形态。
2. 挑选50只转基因L4动物，将它们放在6厘米OP50板的25°C下，24小时。
3. 将50只转基因动物转移到25°C的6厘米OP50新板上，24小时。
4. 制作阿甘丝垫，用于在宽场显微镜下对动物进行成像。
   1. 将两块胶带放在两张显微镜幻灯片上。将一张没有胶带的清洁幻灯片放在两张带丝幻灯片的中间。
   2. 使用一次性无菌转移移液器将 3% 熔融琼脂酒的 3% 熔融软糖分配至中间滑轨上，100 μL（从一次性塑料巴斯德移液器中滴1滴）。
   3. 立即将第二张干净的幻灯片放在熔融的琼脂上，使其停留在贴片幻灯片上，并在幻灯片之间创建一层薄薄的均匀的琼脂。
   4. 在琼脂冷却和凝固后，小心地将两张幻灯片与两张叠的琼脂层放在它们之间，而不将它们分开，并将其放在一个塑料袋中，下面有一张湿纸。每 10 个蠕虫制作一张幻灯片，并检查三张额外的幻灯片。
5. 从25°C培养箱中取出转基因C.elegan，在玻璃凹陷滑移中将10个转基因C.elegans放入100μL的10mMlevamisole中。孵育10分钟或直到动物瘫痪。
6. 从塑料袋中取出一对幻灯片，并小心地将它们分开。用基因型标记滑道，并在琼脂中间添加 2 μL 的 10 mM levamisole。将10只动物移到琼玫瑰垫上的莱瓦米索尔。用#1厚度的盖玻片盖住动物。
7. 形象动物，其中的外阴是定向，使其在动物的右侧。如果外阴在头部的左侧，运动神经元的共性将位于动物下方，不能看得很清楚，因此很难进行准确的定量。忽略这些动物的定量。在此方向中，运动神经元的共性最接近盖玻片，在倒置的宽场荧光显微镜上清晰可见。使用 63X 1.4X NA 油浸透镜和 Leica L5 GFP 过滤器组（Ex480/40nm;Em527/30nm）。如果神经元共成表示RFP而不是GFP，则使用 Leica TX2 RFP 滤波器集（Ex560/40nm;Em645/75nm）。
   1. 使用 63x 1.4x NA 油浸透镜和 GFP 滤镜组（Ex480/40 nm;Em527/30 nm）。如果神经元共成表示RFP而不是GFP，则使用红色荧光蛋白（RFP）过滤器集（Ex560/40 nm;Em 645/75 nm）。
8. 在将盖玻片放在蠕虫身上的 45 分钟内成像蠕虫，以尽量减少固定造成的毒性。
9. 对于每个蠕虫，计算可见共感的数量。野生动物中有16种可见的共性动物。还要计算在逗号中具有大珠子（即 blebs）的共同体数以及损坏的共性数。要确认共性是否损坏，请通过调整焦平面，从背带到心线进行通信。
   注:在其中，未c-47p::GFP荧光显示间隙的共同体被认为是断裂的。破碎的共件通常有一个破损的两侧，帮助显示共融被打破。计算 20 个蠕虫的毛额和断裂量。
10. 计算用bbs或断裂的共和分数，而不是每个动物观察到的共性总数。也可以测量每只动物（包括野生类型、污点和破碎事件）的共性的绝对数量。
11. 对于每个类别，计算平均值 = SD，并使用学生 t 测试进行统计分析以在两个组之间进行比较，或者使用单向 ANOVA 来比较 3 个或更多组。

结果

我们使用此处描述的测定来评估不同基因抑制对在具有 G₄C₂重复扩张的 ALS 患者中发现的 RAN 二肽毒性的影响。利用生长测定测量发育毒性，我们分析了在全基因组RNAi屏幕抑制器中识别的几种基因敲除突变体对肌肉表达PR50-GFP毒性的影响。虽然仅表达PR50-GFP就导致完全渗透性生长抑制，但几个基因的功能突变的丧失抑制了PR发育毒性的12-94%（图1A）。

讨论

在这里，我们报告的方法，可用于测定RAN肽毒性建模在肌肉或神经元的C.elegans。虽然神经退行性蛋白质在人类患者中具有年龄发病表型，但在模型系统中过度表达时，它们也会表现出发育毒性。过度表达有显著的解释性限制，但它也为基因或药理学屏幕提供了一个强有力的起点，旨在识别能够逆转有毒表型的基因或药物。这一点尤其重要，因为大多数精确的动物疾病模型要么没有表型，要?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm x 10mm Petri Dish, Sterile	CELLTREAT Scientific Products	50-202-036	Nematode growth plates and RNAi
AGAR GRANULATED 2KILOGRAM	BD DIAGNOSTIC SYSTEMS	DF0145070	Nematode growth plates and RNAi
AGAROSE ULTRAPURE	LIFE TECHNOLOGIES	16500500	Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
CARBENICILLIN 5G	THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS	BP26485	Nematode growth plates and RNAi
COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK	THERMO SCI ERIE	12542B	Imaging for commissure assay
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS	EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS	E5242952008	Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK	THERMO SCI ERIE	125485C	Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	THERMO SCI ERIE	12-550-15	Imaging for commissure assay
Gibco Bacto Peptone	Gibco	DF0118-17-0	Nematode growth plates and RNAi
HALOCARBON OIL 700	SIGMA-ALDRICH INC	H8898-50ML	Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
IPTG BIOTECH 10G	THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS	BP162010	Nematode growth plates and RNAi
Leica Advanced Fluorescence imaging software	Leica Microsystems	LAS-AF	Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay
Leica Immersion type N (Oil)	W NUHSBAUM INC	NC9547002	Imaging for commissure assay
LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR	THERMO SCI ACROS ORGANICS	AC187870100	Imaging for commissure assay
MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS	EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS	E5242956003	Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS	CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC	FB0875713A	Nematode growth plates and RNAi
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS	CORNING LIFE SCIENCES DL	87721	Nematode growth plates and RNAi