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要約

反復関連非ATG依存的翻訳産物は、いくつかの繰り返し拡張ベースの疾患の新たな病原性特徴である。記載されたプロトコルの目的は、モデル系C.elegansにおける行動および細胞アッセイを用いてこれらのペプチドによって引き起こされる毒性を評価することである。

要約

C.エレガンスは、筋萎縮性側索硬化症(ALS)やハンチントン病などの繰り返し膨張突然変異によって引き起こされる、年齢関連神経変性疾患をモデル化するために一般的に使用されます。近年、反復膨張含有RNAは、反復関連非AUG依存性(RAN)翻訳と呼ばれる新規型のタンパク質翻訳の基質であることが示された。正規翻訳とは異なり、RAN変換は開始コドンを必要とせず、繰り返しがしきい値の長さを超えた場合にのみ発生します。読み取りフレームを決定する開始コドンがないため、RAN変換は、反復膨張シーケンスを含むセンスおよびアンチセンスRNAテンプレートの両方からすべての読み取りフレームで発生します。したがって、RAN翻訳は、疾患関連の有毒ペプチドの数を1から6に拡大する。これまで、RAN翻訳は、8つの異なる反復拡張ベースの神経変性疾患および神経筋疾患で文書化されてきた。いずれの場合も、どのRAN製品が毒性であるか、ならびに毒性のメカニズムを解読することは、これらのペプチドが疾患病態生理学にどのように寄与するかを理解するための重要なステップです。本論文では、モデル系C.エレガンスにおけるRANペプチドの毒性を測定する戦略を紹介する。まず、開発中のC.エレガンスの成長と運動性に関するRANペプチド毒性を測定する手順を説明する。第2に、RANペプチドが運動性に及ぼす、発達後の年齢依存性の影響を測定するためのアッセイを詳述する。最後に、ニューロンの形態に対するRANペプチドの効果を評価するための神経毒性アッセイについて述べます。これらのアッセイは、RANペプチド毒性の広範な評価を提供し、疾患のメカニズムまたは治療法を同定するために大規模な遺伝的または低分子スクリーンを実行するのに有用であり得る。

概要

DNA反復配列の不適切な拡大は筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭型認知症(FTD)、ハンチントン病(HD)1などのいくつかの神経変性疾患の遺伝的基盤である。これらの疾患には確立された細胞モデルと動物モデルがあるが、これらの条件の根底にあるメカニズムは十分に定義されていない。例えば、HDは、ハンチンチンタンパク質Htt2に対するコード配列におけるCAG反復配列の拡張によって引き起こされる。CAGはアミノ酸グルタミンをコードするので、CAGの繰り返し拡張は、ポリグルタミン、またはポリQ内の配列を挿入する結果、Tt.拡張されたポリQタンパク質の中で、毒性33、44に関連する長さと年齢依存性タンパク質凝集体を形成する。驚くべきことに、2つの最近の研究は、polyQ配列の長さがHD疾患発症の主な要因ではないことを示唆し、ポリQ独立因子も疾患55、66に寄与する可能性があることを示唆している。

可能なポリQ非依存のメカニズムの1つは、Repeat Aon-AUG依存(RAN)翻訳7と呼ぶ新たに発見されたタイプのタンパク質翻訳を含む。その名前が示すように、RAN変換は、拡張された繰り返しシーケンスが存在し、正規開始コドンを必要としない場合にのみ発生します。したがって、RAN変換は、3つの異なるポリペプチドを産生する繰り返しの3つの読み取りフレームすべてに起こる。また、多くの遺伝子が、拡大された反復配列の逆補体を含むアンチセンス転写産物を産生するので、アンチセンス転写物の3つの読み取りフレームにおいてもRAN変換が起こる。RANの翻訳は、1つのペプチドから6つのペプチドに拡大された反復含有DNA配列から産生されるタンパク質の数を拡大する。現在までに、RAN翻訳は少なくとも8つの異なる反復拡張障害8において観察されている。RANペプチドは、死後の患者サンプルにおいて観察され、患者が拡大された繰り返し99、1010を運ぶ場合にのみ観察される。これらのペプチドは患者細胞に明らかに存在するが、疾患病態生理学への寄与は不明である。

RANペプチドに関連する潜在的な毒性をより良く定義するために、いくつかのグループは、酵母、ハエ、マウス、および組織培養細胞,11、12、13、14、15、16,12,13,14などの様々なモデルシステムで各ペプチド15を16発現している。これらのモデルは、発現に繰り返し配列を利用するのではなく、反復配列が除去されるがアミノ酸配列が保存されるコドン変動アプローチを採用している。翻訳開始は正規ATGを介して起こり、ペプチドは通常、N末端またはC末端の蛍光タンパク質に融合し、いずれもRANペプチド毒性を妨げているようには見えなくなる。したがって、各コンストラクトは単一のRANペプチドを過剰発現する。多細胞生物の異なるRAN製品を、RANペプチド毒性を測定する簡単なアッセイでモデリングすることは、各疾患を引き起こす反復膨張とは異なるRAN製品が細胞機能障害や神経変性にどのように寄与するかを理解するために極めて重要です。

他のモデルシステムと同様に、C.elegansは、RANペプチド毒性などの新しい疾患メカニズムの研究を可能にする柔軟で効率的な実験プラットフォームを提供します。ワームは、RANペプチド毒性の他のモデルでは現在利用できないいくつかのユニークな実験的属性を提供します。第一に、C.エレガンスは生まれてから死ぬまで光学的に透明である。これにより、RANペプチド発現と局在化の簡単な可視化、ならびに生きた動物における神経変性のインビボ分析が可能になります。第2に、RANペプチド発現モデルを生成するためのトランスジェニック方法は、安価で高速である。C.エレガンスの短い3日間のライフサイクルを考えると、細胞型特異的な方法で任意のRANペプチドを発現する安定したトランスジェニックラインは、1週間以内に生成することができる。第三に、単純な表現型の出力は、化学変異誘発またはRNAiスクリーニングなどの遺伝子スクリーニング方法と組み合わせて、RANペプチド毒性に不可欠な遺伝子を迅速に同定することができる。最後に、C.エレガンスの短い寿命(〜20日)は、ほとんどの繰り返し拡張疾患の最大の危険因子である老化がRANペプチド毒性にどのように影響するかを決定することを可能にする。一緒に、実験属性のこの組み合わせは、他のモデルシステムでは比類のない、RANペプチド毒性の研究のための強力なプラットフォームを提供しています。

ここでは、C.エレガンスの実験的利点を利用して、RANペプチドの毒性を測定し、この毒性の遺伝的修飾因子を同定するいくつかのアッセイについて説明する。コドン変化したATG開始RANペプチドはGFPでタグ付けされ、myo-3プロモーターの下の筋肉細胞またはUNC-47プロモーターの下のGABAergic運動ニューロンのいずれかで個別に発現する。筋肉細胞の発現に関しては、毒性のRANペプチドが緑色蛍光タンパク質(GFP)、またはRNAiの摂食ベクターで標的とすることができる他の蛍光タンパク質(FP)タグでタグ付けされることが重要です。これは、毒性RANペプチド発現が通常増殖を妨げ、そのような株を生存不可能にするためである。gfp(RNAi)の使用は、条件付きでRANペプチド発現を不活性化し、ひずみの維持、遺伝的十字架などを可能にします。アッセイの場合、これらの動物は、RANペプチドの発現と結果の表現型を可能にするgfp(RNAi)から除去される。コドン多様なRANペプチド発現構築物を設計するための分子戦略に加えて、発生毒性(幼虫運動性および成長アッセイ)、発生後の年齢関連毒性(麻痺アッセイ)、およびニューロン形態異常(コミュニケールアッセイ)を測定するためのアッセイについて述べています。

プロトコル

1. コドン変化型RANペプチド発現構築物の生成

  1. 基本的な反復的なDNA/RNA構造を排除するが、上にあるアミノ酸配列を保持するために、同義コドンを利用して個々のRANペプチドコード配列を設計する。
  2. カスタムコドンシーケンスを、研究に必要な繰り返し長さで商業的に注文します(通常は5~100の繰り返し)。5' の終わりに HindIII 制限サイトと 3' の終わりに BamHI 制限サイトを含める pPD95.79 などのC. エレガンス発現ベクターへのクローニングを容易にします。
    注:より大きな構成体の合成が困難であることが判明した場合、より小さなビルディングブロックシーケンスを合成し、方向結紮戦略17を使用してより大きな繰り返しに組み込むことができます。
  3. 標準的なT4ライゲーション法を用いてペプチド配列をC.エレガンス発現ベクターにサブクローニングする。
  4. ランペプチド配列の前でPCRによって生成された細胞型特異的プロモーター配列をサブクローニングし、組織特異的なRANペプチド-GFP発現を駆動する。
  5. 野生型C.エレガンスの生殖腺にRANペプチドコンストラクトをマイクロインジェクトし、標準方法18を用いて染色体外配列を含むトランスジェニック株を生成する。共注射マーカーの場合、筋肉特異的RFPレポーター(myo-3p::RFP(pCFJ104)))を利用したが、他のマーカーも利用できる。pCFJ104
  6. 標準的なC.エレガンス統合スクリーニング方法19を用いて、安定な遺伝子をゲノムに統合する。
  7. RANペプチドが有毒でトランスジェニック動物が生き残らない場合、動物にgfp(RNAi)を供給し、注射前および注射後に細菌を発現させ、有毒タンパク質の発現を静かにする。
    注:gfp(RNAi)から動物を除去すると、下記のアッセイを用いた表現型解析のためのRANペプチド発現が可能になります。

2. RNAiベース遺伝子ノックダウン後のRANペプチドの発生毒性の測定:ビデオ速度解析プロトコル

  1. 標準線虫増殖培地(NGM)RNAi 24 ウェルプレートに 1 mM イソプロピル β-D-1 チオガラクトピラノシド(IPTG)と25 μg/mL カルベニシリンを注ぎます。
  2. HT115細菌中のRNAiフィードクローンを引き抜き、ルリアスープ(LB)+カルベニシリン(25μg/mL)寒天プレートに試験し、37°Cで24時間増殖します。 empty vector(RNAi) gfp(RNAi)
  3. 各クローンに対して、LB +カルベニシリン液体培地の1mLに単一コロニーを選び、1分あたり250回転(RPM)で振りながら37°Cで18時間細菌を増殖させます。
  4. NGM RNAI 24ウェルの4つの個々のウェルを、次の一晩細菌培養の20 μLで発見する:カラム1ウェル= gfp(RNAi)列 2 ウェル = (EV)RNAi;カラム3~6ウェル=試験対象遺伝子に対するRNAi。RNAi細菌が室温(RT)で一晩dsRNA産生を誘導することを可能にする。
  5. 一日目から卵を分離し、標準的な次亜塩素酸法と種子〜30 C.エレガンス卵をNGM RNAi24ウェルプレートの各ウェルに用いて、統合されたRANペプチドトランスジーンを発現させる。
  6. 24ウェルを20°Cで7日間インキュベートします。
    注:このインキュベーション時間は、PR50またはGR50などの有毒C9orf72 RANジペプチドを発現する株のためのものです。他の株は、細菌の供給源の枯渇とその後の飢餓を防ぐために短いインキュベーション時間を必要とするかもしれません。
  7. Leica AFビデオ取得ソフトウェア(バージョン2.6.0.7266)を搭載したWindows対応PCに接続されたDFC345FXモノクロカメラを装着したライカMZ16FAステレオ解剖顕微鏡を使用して、伝送光ビデオを取得します。
    1. ウェル間の一貫したビデオ取得設定を使用して、RNAi条件ごとに2つの別々の井戸から2つのビデオを取得します。各ビデオに対して、18.6X倍率(AFソフトウェアで1.49ズーム設定)を使用して、800 x 600ピクセルの解像度で10秒、毎秒13.16フレーム(時間ボクセル寸法= 0.076秒)を取得します。イメージの露出時間を 4 ミリ秒に設定します。各ビデオには、ひずみ、RNAi 条件、およびウェル番号をすぐにラベル付けします。
  8. ビデオの順序をランダム化し、ビデオの名前を数字に変更することにより、各ビデオファイルに関連付けられている遺伝子型に実験者を盲目にします。このグループのビデオを新しいファイルとして保存します。解析が完了した後、実験者のブラインドを解除します。
  9. 各ビデオから20種類の動物の「移動距離」と各動物の長さを測定し、RNAiの状態ごとに合計約40匹のワームを調べる。
    1. ソフトウェアで、注釈ツールボタンを選択し、次にテキスト描画ツールを選択します。ビデオの最初のフレームで測定されているワームの中央にある点をクリックし、数字としてマークします。ワームの移動経路を視覚的に追跡しながらビデオを最後まで進めます。最後のフレームで、測定対象のワームの中心にある点をクリックし、次の対応する番号をマークします。次に、描画スケールバー ツールを使用して、最初の数値から 2 番目の数値までの線を描画して、"移動距離" を記録します。
    2. 「移動距離」は、2 つの中心点間の距離です。この距離は、測定ラインの隣に表示されます。この測定値をスプレッドシートに記録します。解析ウィンドウで個々の測定を保存しながら、ビデオ内の19の他のワームに対してこの測定を繰り返します。
  10. 動きがなく、データを麻痺に偏らないように、最も強い動きを示す動物からの測定を行います。測定が完了したら、すべての測定ラインを示す最終的なビデオフレームのスナップショットを作成し、データを元の動物に戻すことができます。
  11. 4 列のスプレッドシートを使用してデータを分析します。列1はワーム「識別子」であり、列2は走行距離/時間(速度)である。
    1. 各ビデオの時間は、実験の下でビデオを右クリックし、ビデオのプロパティに行くことによって見つけることができます。
  12. [定量]を選択し、ソフトウェアの[統計情報]を選択して、各動物の長さを見つけることによって速度測定を正規化します。ビデオディスプレイ上の注釈ツールのアイコンをクリックすると、「ポリラインを描画」ツールを使用できるようになります。このツールは、頭の先端から尾の先端までのビデオからC.エレガンスを自由に追跡するために使用することができます。行の長さは統計の下に記録されます。
    1. データを元の動物にさかのぼることができるように、C.エレガンスのサイジングに使用されるすべてのポリラインを示す最後のビデオフレームのスナップショットを撮ります。
  13. スプレッドシートに 2 つの列を追加して、データを分析します。3列目は「動物の長さ」、4列目は「正規化された速度」(速度/動物の長さ)です。一方向 ANOVA を使用して正規化された速度データを分析し、非定常テストと空ベクトル(RNAi) を使用します。

3. RANペプチドの発生毒性の測定:成長アッセイ

  1. gfp(RNAi)、(EV)RNAi、(EV)RNAi,または(遺伝子特異的)6cmRNAiプレートのいずれかで、50μLの次亜塩素酸溶液(漂白剤10mL、10 N NaOHの2.5mL、dH2Oの37.5 mL)に〜30匹のグラビド動物を選びます。 RNAi
  2. 24時間後、次亜塩素酸溶液のスポットから這い出した6個のトランスジェニック前生を、次亜塩素酸溶液処理を施したプレート上のRNAi条件と同一の新しい6cm RNAiプレートに移動する。これらの子孫(F1)を20°Cに入れて成長し、再現します。
  3. 24~48時間後、動物が成長しているRNAi条件に一致する6cm RNAiに10匹のトランスジェニックL4動物を選びます。20°Cインキュベーターで24時間産卵をパルスする動物を許可します。
  4. 24時間後、成虫の動物を取り除き、捨てる。機械的なハンドヘルドカウンターを使用して、24時間の間に産卵とL1幼虫の数を数えます。これは総ブロードサイズです。
  5. 次の72時間にわたって、L4または古い段階に達する動物の数を数えます。各動物がカウントされると、プレートから取り出します。
  6. 「成長率」を、総ブロードサイズからL4以上の段階に達する動物の割合として定量化します。
  7. 2 x 2 フィッシャーの正確な検定と空ベクトル(RNAi)を実行して、成長率が統計的に有意かどうかを判断します。比較対象のカテゴリは、「成長」(72時間でL4以上の段階に達した動物の数)と「成長なし」(総ブロードサイズから72時間でL4以上の段階に達する動物の数を差し引いた量)です。

4. 発達後のRANペプチド麻痺アッセイ

  1. 6 cm gfp (RNAi) プレートに 4 ~6 トランスジェニック L4 を配置し、20 °C でワームを成長させることにより、gfp(RNAi) の筋肉に RAN ペプチドGFPを発現する統合されたC. エレガンス トランスジェニック株を維持します。
  2. 実験がRNAiを利用してRANペプチド毒性に対する遺伝的影響をテストしている場合、10人のトランスジェニック・グラビッド成人を未飢えプレートから2つの6cm空ベクトル(RNAi)のそれぞれ(麻痺の陽性対照、遺伝的影響に対する陰性対照)、gfp(RNAi)(麻痺の陰性対照、遺伝的効果に対する陽性対照)、遺伝子特異的(RNAi)(i.06.0.10.10.1.0.10.1.cm.1.1.1.cm.)に移動させる。
  3. 変異体がRANペプチド毒性に対する遺伝的効果を分析するために使用されている場合、2つの6 cm空ベクトル(RNAi)またはgfp(RNAi)プレートのそれぞれに同じRANトランスジーンを発現する10gravid WTまたは変異動物を配置する。20°Cで48時間成長します。
  4. 6 cm RNAiプレートから10個のトランスジェニックL4を10セット選び、各セットを3cmのRNAiプレート(すなわち、遺伝子型ごとに100匹)に置きます。アッセイに選択されたL4が表面的に正常な運動性を持っていることを確認してください。水分を保持するためにジッパー収納バッグ内にプレートを置きます。
  5. 袋に入れたプレートをL4と一緒に25°Cインキュベーターに入れ、
  6. 24時間後に25°Cインキュベーターから24時間後に1株ずつ取り出し、RTで出ている時間を最小限に抑える。
  7. 解剖顕微鏡のプレートをタップして、動きを確認します。動物が体長以上に移動する場合は、移動体として動物を数え、新しい3cm RNAiプレートに移します。頭や尾の残りのワームをタップするプラチナピックを使用してください。動物が体の長さ以上に動く場合は、移動体として動物を数え、新しい3 cm RNAiプレートに移します。
    注: 転送時にプレートあたり 10 個を超えないようにしてください。アッセイは次の高齢動物のみに依存するため、新しいRNAiプレートに子孫を移動しないように注意してください。
  8. すべての動かないワームをグループ化して、体長以上の動きを簡単に検出できるようにします。動物に少なくとも1分を与え、1つ以上の体長を動かす。それでも動かない場合は、麻痺、袋詰め(つまり、幼虫が母親の中で孵化)、または死んでいる。
  9. 袋詰めを示す動物を検閲し、プレートの側面に乾燥させ、押出された腸を示し、巣穴、失われた、または検出時にアッセイで死ぬ。麻痺したワームは数え、古いRNAiプレートに残され、廃棄される。
  10. ステップ 4.6 ~ 4.9 で説明されているように、毎日 5 ~ 7 日間、動物の麻痺をスコア付けします。
  11. 寿命の分析に使用されるログランクテストと同じで麻痺データを分析します。この統計分析では、動くワームは「生きている」とスコア付けされ、麻痺したワームは「死んだ」とスコア付けされ、死んだ、袋詰めされた、腸が押し出され、乾燥させられた、穴があく、または他の方法で失われたワームは「検閲」として採点されます。
    注: この分析では、「アライブ率」の数値は「移動率」動物を示します。逆は「麻痺率」を表します。ログランク統計分析を実行するには、オンライン分析ツール OASIS (https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/) を使用します。

5. ニューロン病理の測定:コミシュアアッセイ

  1. UNC-47プロモーターを用いてGABAergicニューロンに関心のあるRANペプチドを発現するトランスジェニックC.エレガンスを生成する。また、GABAニューロンの細胞形態を明らかにするために、unc-47p::GFPまたはunc-47p::RFPを発現する。
  2. 50匹のトランスジェニックL4動物を選び、25°Cの6cm OP50プレートに24時間置きます。
  3. 50匹のトランスジェニック動物を25°Cの新しい6cm OP50プレートに24時間移します。
  4. 広視野顕微鏡下で動物を画像化するためのアガロースパッドを作ります。
    1. 2つの顕微鏡スライドの上に2枚のテープを置きます。テープなしでクリーニングしたスライドを、テープで貼った 2 つのスライドの中央に置きます。
    2. 3%溶融アガロースの100 μL(使い捨てプラスチック製のパスツールピペットから1滴)を、使い捨て可能な無菌移動ピペットで中央スライドに分配します。
    3. すぐに溶融アガロースの滴を横切って2番目のきれいなスライドを置き、テーピングされたスライドの上に置き、スライド間に薄くて均一なアガロースの層を作り出します。
    4. アガロースが冷却して固まった後、それらを分離することなく、それらの間にアガロースの層を持つ2つのスライドを慎重に取り除き、その下に湿った紙を入れたビニール袋に入れます。10 個のワームにつき 1 つのスライドを作成し、3 つの追加スライドと共に検査します。
  5. トランスジェニックC.エレガンスを25°Cインキュベーターから取り出し、10個のトランスジェニックC.エレガンスを100μLの100 μLの10mMレバミソーレにガラスうつ病スライドで取り出します。10分間、または動物が麻痺するまでインキュベートします。
  6. ビニール袋からスライドペアを取り出し、慎重に分離します。ジノタイプでアガロースでスライドにラベルを付け、アガロースの真ん中に10 mMレバミゾールの2μLを追加します。アガロースパッドのレバミゾールに10匹の動物を移動します。動物を#1厚いカバースリップで覆います。
  7. 外陰部が向きが付いている画像動物は、動物の右側にある。外陰部が頭の左側にある場合、運動ニューロンのコミュニケーションは動物の下にあり、はっきりと見えなくなり、正確な定量化が困難になります。これらの動物から定量を省略する。この向きでは、運動ニューロンのコミュニケーションはカバースリップに最も近く、反転した広視野蛍光顕微鏡ではっきりと見える。63X 1.4X NA油浸漬レンズとライカL5 GFPフィルタセット(Ex480/40nm)を備えた反転広視野蛍光顕微鏡でGFPを発現するニューロンコミュニケーションを視覚化する。Em527/30nm)。ニューロンコミュニケータがGFPの代わりにRFPを発現する場合は、ライカTX2 RFPフィルタセット(Ex560/ 40nm;Em645/75nm)。
    1. 63x 1.4x NA油浸漬レンズとGFPフィルターセット(Ex480/40 nm)を備えた反転広視野蛍光顕微鏡でGFPを発現するニューロンコミュニケーションを視覚化する。Em527/30 nm)。ニューロンコミュニケートがGFPの代わりにRFPを発現する場合は、赤色蛍光タンパク質(RFP)フィルタセット(Ex560/40 nm)を利用する。エム 645/75 nm)。
  8. ワームにカバースリップを配置してから45分以内に画像を作成し、固定化による毒性を最小限に抑えます。
  9. ワームごとに、可視コミュニケートの数を数えます。野生型動物には16の目に見えるコミュニケートがあります。また、コミュニケーションに大きなビーズ(すなわち、ブレブ)を持つコミュニケートの数と壊れているコミュシャスの数を数えます。コミュニケールが壊れているのを確認するには、焦点面を調整して、後側コードから腹側コードまでのコミュニケールに従ってください。
    注:unc-47p::GFP蛍光がギャップを示すコミュニケートは壊れていると考えられています。壊れたコミュシュアは通常、休憩の両側にブレブを持ち、コミュニケートが壊れていることを示すのを助ける。20ワームのブリードとブレークの量を数えます。
  10. 各動物の観察されたコミュニケートの総数にわたってブレブまたはブレークでコミュニケートの割合を計算します。動物1匹あたりのコミュニケーションの絶対数(野生のタイプ、ブリード、壊れたイベントを含む)も測定できます。
  11. 各カテゴリについて、平均値 ±SDを計算し、2つの集団間の比較のための学生のt検定または3つ以上の集団間の比較のための一方向のANOVAを使用して統計的に分析します。

結果

ここで説明するアッセイを用いて、G4C2反復増殖を有するALS患者に見られるRANジペプチドの毒性に対する異なる遺伝子阻害2の影響を評価した。成長アッセイを用いて発生毒性を測定し、筋肉発現PR50-GFP毒性のゲノムワイドRNAiスクリーンサプレッサーで同定されたいくつかの遺伝的ノックアウト変異体の効果を分析した。PR50-GFPの発現だけでは完全に浸透性の成長阻止をもたら?...

ディスカッション

ここでは、筋肉またはC.エレガンスのニューロンでモデル化されたRANペプチド毒性をアッセイするために使用できる方法を報告します。神経変性タンパク質はヒト患者に発症する表現型の年齢を有する一方で、モデル系で過剰発現すると発達毒性を示すこともある。過剰発現には解釈上の限界は大きいが、毒性表現型を逆転させる遺伝子や薬物の同定を目的とした遺伝的または薬理学?...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

NIH R21NS107797

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
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参考文献

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