使用流细胞测定量化人类诺如病毒样颗粒与准细菌结合

摘要

该协议的目标是量化真核病原体人类诺如病毒与细菌的结合。在进行初始病毒-细菌附件测定后，流细胞测定用于检测种群内的病毒结合细菌。

摘要

共生细菌已广为人知，可影响真核病毒的感染。病原体和宿主微生物群之间的直接结合是改变许多这些病毒的感染的原因。因此，描述病毒-细菌结合的性质是阐明细菌改变病毒感染机制所需的基本步骤。对于人类诺如病毒，共性细菌可增强B细胞感染。病毒直接与这些细菌结合，表明这种直接相互作用涉及感染增强机制。多种技术可用于量化细菌和病毒之间的相互作用，包括放射性标记病毒的闪烁计数和聚合酶链反应 （PCR）。这两种方法都需要使用活病毒，可能需要在实验室中生成。目前，人类诺如病毒的成熟体外培养系统都不足以产生高度浓缩的病毒种群。代替活病毒，病毒样颗粒（VLP）被用来描述诺如病毒和细菌之间的相互作用。本文介绍一种流细胞测定方法，使用病毒特异性抗体来量化VLP与克阴性和克阳性细菌结合。只包含细菌和等感控制，可以优化测定，以减少背景抗体结合，并准确量化VLP附件对所测试的细菌。高VLP:细菌比导致VLP与细菌群的较大百分比结合。但是，当 VLP 数量减少时，细菌结合的百分比也会降低。最终，这种方法可用于未来的实验，阐明规范诺如病毒的特定条件和结构成分:细菌相互作用。

引言

人诺病毒（HuNOV）是全世界胃肠道疾病的主要原因^{，每年造成}6.85亿例感染和超过20万例死亡。与其他肠道病毒一样，共性细菌的存在已证明能增强该病原体及其代理病毒——鼠诺如病毒^22、33的感染。也有相互矛盾的报告，细菌可以抑制感染人类诺如病毒^{44，5，6。5,6}对于几种病毒，病毒和细菌之间的直接相互作用似乎是影响病毒感染的机制的基础^{22，7，8，9，10，7,8,9,10}并且通过电子显微镜证明，人类诺如病毒直接结合到细菌的表面^{11，12。,12}因此，描述这些相互作用对于确定细菌影响病毒感染的机制至关重要。这种特性从量化病毒结合开始，这些细菌物种是宿主微生物群^{77、12、1312,13}的组成部分。这些附件测定不仅揭示了与细菌结合的病毒数量，还有助于确定这种相互作用对病毒健康与生存的影响。

为了量化病毒附着，传统上使用的方法包括基于PCR的检测，量化病毒基因组¹²或产生放射性标记病毒，并使用闪烁计数来量化病毒颗粒^{77，8，9，13。8,9,13}使用这些方法通常需要获得高数量病毒储存和体外培养技术，从而产生它们。虽然人类诺如病毒的几个培养系统现在存在^{2,2，14，15，,15}没有一个支持所需的强大的复制，以产生这些高度集中的种群，限制或消除使用PCR和闪烁计数来量化人类诺如病毒/细菌相互作用。

为了规避这个问题，病毒状粒子（VlPs）可以作为活病毒的代用品来研究人类诺如病毒和细菌之间的相互作用^{16，17。16,}VLP 是非传染性颗粒，与它们衍生的病毒非常相似。在人类诺如病毒的情况下，这些颗粒是由VP1（以及VP2）蛋白质的表达产生的，这种蛋白质自我组装，创造出缺乏遗传物质（即诺如病毒的RNA）的完整病毒帽。这些VlPs具有很好的特征，在结构和抗原上与野生病毒相似，它们来源于18、19、20、21、22、23。^{18,19,20,21,22,23}因此，VLP是研究人类诺如病毒和共性细菌表面相互作用的理想代用品。鉴于VLP缺乏遗传物质，基于PCR的测定不能用于量化病毒结合。先前曾描述过一种基于抗体的流细胞测定方法，能够以半定量的方式检测与细菌结合的低水平^VLP。该方法经过优化，使人类诺如病毒VLP与克阴性和克阳性共性细菌¹⁶结合进行精确定量。

研究方案

注:协议中概述的细菌生长条件是肠杆菌氯酸和乳酸杆菌的培养条件。为了与其他细菌物种进行病毒:细菌附着测定，所选细菌应在适合细菌的标准条件下培养。

1. 制备细菌生长介质

1. 肠杆菌生长介质
   1. 通过在1升脱电化（DI）水中溶解10克试油、5克酵母提取物和10克氯化钠（NaCl）来制备液体介质（见材料表）。将所有介质彻底混合，通过高压灭菌 30 分钟进行消毒。
   2. 通过在1L DI水中溶解10克试石酮、5克酵母提取物、10克NaCl和15克agar来制备固体介质。将所有介质彻底混合，通过高压灭菌 30 分钟进行消毒。
2. 乳酸杆菌生长介质
   1. 通过在DI水中溶解55克德曼、罗戈萨和夏普（MRS;参见材料表）粉末来制备液体介质。在准备后一个月内使用介质。要消毒，加热介质15分钟，直到沸腾，然后高压15分钟。
   2. 通过在 1 L DI 水中溶解 55 克 MRS 粉和 15 g agar，制备固体介质。要消毒，加热介质15分钟，直到沸腾，然后高压15分钟。

2. 建立与光学密度（OD）和细菌浓度相关的标准曲线

1. 从加盘（E.氯酮）或直接从冷冻甘油库存（L.gasseri）中分离出5 mL的适当液体介质，与单一的隔离菌体。
2. 在适当的大气条件下，在适当的大气条件下，一夜之间生长细菌（肠杆菌氯酸:37°C，在200rpm时有氧摇动;L. gasseri: 37 °C 水浴，密封容器内无晃动）。
3. 将2 x 1.3 mL过夜培养的分位转移到两个独立的1.5 mL离心管和离心细菌中，在10，000 x g下，5分钟。
4. 去除上清液，用1 mL无菌1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗样品。重复此洗涤步骤，总共洗涤 2 次。
5. 在 10，000 x g下再次离心样品 5 分钟，去除上清液，重新悬浮在 1.3 mL 无菌 1x PBS 中。
6. 从0.5 mL的洗涤培养开始，连续稀释1x PBS中的细菌，从^10-1到^10-4。
7. 使用分光光度计，测量洗涤、未稀释的培养物的光学密度和在 600 nm （OD₆₀₀） 处的四个稀释器中的每个。
8. 在步骤 2.6 中的每个稀释中，在 1x PBS 中执行 10 倍的串行稀释。将每个系列最后3个稀释剂的100 μL展开板到适当的固体介质上，以确定每个样品每毫升（CFU/mL）的菌落形成单位数。盘每次稀释三联。
9. 允许板在室温下干燥5分钟。反转板并在适当的大气条件下孵育（E. 氯卡:在37°C有氧，孵化板过夜;L. gasseri:在37°C下厌氧，在装有抗性气袋的密封容器中孵育48小时板（见材料表）。
   注:每 2.5 L 罐使用 1 个厌氧空气小袋，或每 7.0 L 罐使用 3 袋（参见材料表）。
10. 使用板计数确定 5 个样品中的每个样品的 CFU/mL（即未稀释、10-1、10-2、10-3、10^{-4）。-1-2-3}生成比较 OD₆₀₀与 CFU/mL 的标准曲线。这条线的方程将用于VLP细菌附件测定，以确定基于_OD600的CFU/mL。

3. VLP细菌附件测定

注意:人类诺如病毒VLP是生物安全级别（BSL）-2危害，所有涉及VLP的工作都应在生物安全柜中执行。在附件测定之前，应使用适合生物体的安全条件进行细菌培养的准备。

1. 试剂制备
   1. 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）
      1. 通过在 1 L DI 水中溶解整个数据包，准备 1 L 的 10x PBS。
      2. 高压灭菌解决方案 30 分钟。
      3. 通过在 DI 水中稀释上述溶液 1:10，准备 1 倍解决方案。
      4. 过滤器通过0.22 μm过滤器对溶液进行消毒，并在室温下储存。
   2. 5% BSA
      1. 将5克牛血清白蛋白（BSA）粉加入100 mL的PBS，产生5%（w/v）溶液。
      2. 使用金属搅拌棒通过涡旋或在搅拌板上混合溶液，直到团块溶解。
      3. 使用 0.22 μm 过滤器进行滤芯消毒。
      4. 将溶液储存在 4 °C。
   3. 流动细胞测量染色缓冲液 （FCSB）
      1. 过滤器通过0.22μm过滤器购买了FCSB（参见材料表）。
      2. 将剩余的溶液储存在 4 °C 下。
   4. 5% 阻塞缓冲区 （BB）
      注:每次准备新鲜。
      1. 将 0.5 克 BSA 添加到 10 mL 无菌 FCSB。
      2. 涡旋将样品完全混合，并留在冰上，直到使用。
2. 抗体结合
   1. 根据制造商的说明，使用 R-PE 抗体标签套件将人诺如病毒 GII 抗体（参见材料表）与 r-phycoeryrrin （PE） 结合使用（参见材料表）。
   2. 将结合抗体储存在黑暗中，温度为4°C，供将来在VLP-细菌附件测定分析中使用。
      注:在VLP-细菌附件测定中使用之前，应对主要抗体进行定化，以确定流细胞测定所需的适当浓度。每次进行镇定反应时，以及附件测定中使用的每种细菌，都应进行抗体滴定。
3. 抗体滴定
   1. 稀释偶联抗人类诺如病毒GII抗体100倍，开始稀释1:100，结束稀释1:600（共6稀释）。
   2. 执行病毒附件测定，如下所述，以下例外情况:在步骤 3.5.7 中，将细菌颗粒重新悬浮在 350 μL 的 5% BB 中。
   3. 将样品分为 7 个 50 μL 等位。
   4. 将每个抗体稀释剂的50μL添加到一个管中。
   5. 将 50 μL 的 5% BB 添加到第七管作为未染色的控制。
   6. 对所有样品执行流细胞测定，如下所述。
   7. 将稀释后的抗体样品与未染色的对照组和相互进行比较。应选择不导致阳性信号减少或损失的最低抗体浓度，供后续测定使用。
4. 细菌的制备
   1. 在适当的大气条件下，将细菌在适当的液体介质的40 mL中生长，直到细菌处于静止阶段。
      1. 在37°C的Luria Broth中一夜之间，在Luria Broth中生长E.氯环培养物，在200rpm时摇动，达到固定阶段。
      2. 在 MRS 肉汤中生长L. gasseri培养物，在黑色螺钉帽管中，无需在水浴中摇动，达到 37°C，达到静止阶段。
   2. 将固定相培养液转移到50 mL锥形管和离心机样品上，以2，288 x g的速度进行10分钟颗粒细菌。
   3. 取出上清液，重新悬浮在 13 mL 无菌 1x PBS 中。重复此洗涤步骤，总共进行两次洗涤。
   4. 再次离心样品，取出上清液，并在 20 mL 的 1x PBS 中重新悬浮样品。
      注:如果细胞颗粒较小，则重新悬浮体积可减小。
   5. 测量区域性的 OD_600。
   6. 使用先前准备的标准曲线，确定洗涤培养剂每 mL 的 CFU。
   7. 根据需要使用 1x PBS 稀释细菌，将培养浓度调整到 1 x 10⁸ CFU/mL。
   8. 将 1 x 10⁸ CFU/mL 细菌培养物的 1 mL 转移到所需数量的 1.5 mL 离心管。
   9. 将管在 10，000 x g下离心 5 分钟。
   10. 将细菌颗粒重新悬浮在 1 mL 无菌 5% BSA 中。
   11. 在37°C下用恒定旋转孵育管1小时。
5. 病毒附件
   1. 在BSL-2生物安全柜内工作，在每个含有悬浮物的管中加入10μg的HuNoV VLP（见材料表），并通过移液彻底混合。
      注:VLP 浓度与每次 VLP 制备不同。因此，添加到细菌的体积在制备批次之间会有所不同，应相应地进行调整，以便在实验中将10μg添加到每个管中。对于仅控制细菌（例如，没有 VLP 的样本），添加等于添加到实验样本的 VLP 体积的 PBS 体积。
   2. 在37°C下孵育管1小时，并持续旋转。
      注:在孵育过程中使用设置为40 rpm的管左轮手枪（参见材料表）。
   3. 孵育后，将样品在10，000 x g下离心5分钟。
   4. 在 1 mL PBS 中丢弃上清液并重新悬浮细菌颗粒。
   5. 重复洗涤步骤 3.5.3 和 3.5.4。
   6. 将样品在 10，000 x g下离心 5 分钟。
   7. 在 150 μL 5% BB 中丢弃上清液并重新悬浮细菌颗粒。
6. 抗体染色
   1. 准备新鲜的 5% BB。
      注:所有使用荧光标记抗体的工作都应在黑暗中进行，抗体、BB和FCSB应保存在冰上。
   2. 稀释人类诺如病毒GII抗体1:125E氯环酶样品和1:150为L.gasseri样品在5%BB，准备50μL稀释抗体每个样品。
   3. 稀释等体型抗体的方式与5%BB中每种细菌稀释人体诺如病毒GII抗体的方式相同，制备每个样品50μL的稀释等值型对照。
   4. 通过将每个附件测定样品从步骤 3.3.7 分成三个 50 μL 等位，将其转移到干净的 1.5 mL 离心机管中。
   5. 在第一组样品中，加入50μLBB。此集将是未染色 （Uns） 控件。
   6. 在第二组中，加入50μL的GII抗体稀释。这导致最终抗体浓度为1:250E氯卡和1:300的L.gasseri。此示例集将是染色 （AB） 样品。
   7. 在第三组中，加入稀释的等值型抗体50μL。此集将是等值型控件 （IC）。通过移液很好地混合。在冰上和黑暗中孵化样品30分钟。
   8. 将所有样品在 10，000 x g下离心 5 分钟。
   9. 丢弃上清液，并在FCSB的100μL中重新悬浮样品。
   10. 将所有样品在 10，000 x g下离心 5 分钟。丢弃上清液，并在 100 μL 的 FCSB 中重新悬浮样品。
   11. 将所有样品在 10，000 x g下离心 5 分钟。
   12. 丢弃上清液，并在150μL的FCSB中重新悬浮样品。
   13. 将每个样品转移到含有 400 μL FCSB 缓冲液的 FCSB 管，总体积为 550 μL。
   14. 将样品保持在 4°C，直到通过流式细胞测定分析。
       注:流动细胞测定在抗体染色的4小时内进行。

4. 流动细胞测量

注:下面描述的电压设置基于材料表中列出的流量细胞计和软件，并且可能会因不同的流量细胞计而异。应针对每种细菌优化设置。确保所有图形的轴处于双指数相位。

1. 设置工作区
   注: 用于建立工作区的绘图的设置与门控和数据分析中使用的图形的设置不同。设置工作区的目的是可视化细胞群，确保细菌细胞不会过度聚集，从而影响下游分析，并在收集数据时区分染色细胞和未染色细胞。
   1. 为了确保细菌不聚集在一起，设置一系列密度图。
      1. 生成正向散射区域 （FSC-A） 与侧散射区域 （SSC-A） 之间的数据化总总体。
      2. 通过创建两个图形，分别比较正向 （FSC-W） 和侧散射宽度 （SSC-W） 到正向 （FSC-H） 和侧散射高度 （SSC-H） 和侧散射高度 （SSC-H），设置图以评估单个单元格与细胞团块。
      3. 创建仅显示 PE 正填充（PE-A 与 SSC-A）的绘图。
   2. 将E.氯卡的基线电压设置为 500，将 L. gasseri的基线电压设置为 540。这些将在以后进一步调整。
   3. 将计数的事件总数设置为 10，000 个事件。
2. 运行示例
   1. 创建三个单独的直方图图，显示针对 SSC-A、FSC-A 或 PE-A 绘制的计数。
   2. 在流式细胞仪上放置未染色的样本并获取样本事件，确保 SSC-A 直方图上的最大峰值在 10²到 10³之间，并且 FSC-A 直方图上的最大峰值在 x 轴上为 10⁴到 10⁵之间。如果没有，峰值不在指定范围内，请相应地调整 FSC 和 SSC 电压。
   3. 在流量细胞仪上放置一个染色样品 （AB），并调整电压 PE，使最大峰值超过 x 轴上的 10^3。
   4. 根据这些测量值，设置正 PE 门，并在 PE-A 与 SSC-A 密度图上设置门。
   5. 以低速或中速在确定的设置下运行所有样本。

结果

图1显示了用于量化人类诺如病毒VLP与交联细菌结合的浇注策略。代表性密度点概述了如何封闭样品以消除细胞碎屑和细胞团块，从而在单体上确定了VLP附件（图1A）。代表直方图显示，细菌中抗诺如病毒抗体信号水平较低，只有缺乏诺如病毒VLP的样品和带有等值对照抗体的VLP细菌样品的低背景信号（

讨论

量化肠道病毒与细菌结合的能力是阐明这些细菌改变病毒感染机制的关键第一步。本文所述的方法经过优化，以测量人类诺如病毒VLP与E.氯环酶（克阴性细菌）和L.gasseri（一克阳性细菌）的相互作用，但可以适应任何哺乳动物病毒和感兴趣的细菌。虽然VLP是活病毒的理想替代品，用于附件测定，这些粒子可以很容易地量化使用流细胞测定，P粒子也被用来检查?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap	Corning	352235	After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.
Agar	Sigma	A7002	Used for media preparation
AnaeroPack	Thermo Scientific	R681001	Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa flow cytometer
Bovine Serum Albumin	Fisher Bioreagents	BP1605	Used for flow cytometry
Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB)	BD Biosciences	554657	Used for flow cytometry
Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience	Thermo Fisher Scientific	12473281	Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.
MRS Powder	BD Biosciences	288130	Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.
Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D)	Thermo Fisher Scientific	MA5-18241	Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.
Norovirus GII.4 VLP	Creative Biostructure	CBS-V700	human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.
PBS 10X	Fisher Bioreagents	BP665	Dilute to 1X prior to use.
SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit	Thermo Fisher Scientific	S10467	Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271	Used for media preparation
Tryptone	Oxoid	LP0042	Used for media preparation
Tube Revolver	ThermoFisher Scientific	88881001	Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).
Yeast Extract	BD Biosciences	212750	Used for media preparation