Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokolün amacı ökaryotik patojen insan norovirüsünün bakterilere bağlanmasını ölçmektir. İlk virüs-bakteri eki testi yaptıktan sonra, akış sitometrisi popülasyon içinde viral bağlı bakterileri tespit etmek için kullanılır.

Özet

Kommensal bakteriler ökaryotik virüslerin enfeksiyonunu etkilemek için iyi kurulmuştur. Patojen ve konak mikrobiyom arasında doğrudan bağlanma bu virüslerin çoğu için enfeksiyon değiştirme sorumludur. Bu nedenle, virüs-bakteri bağlanmasının doğası nın karakterize ilerlediği, bakterilerin viral enfeksiyonu değiştirdiği mekanizmanın (lar) aydınlatılabilmek için gerekli temel bir adımdır. Insan norovirüs için, kommensal bakteriler B hücre enfeksiyonu geliştirmek. Virüs doğrudan bu bakterilere bağlanır, bu doğrudan etkileşim enfeksiyon geliştirme mekanizması nda yer aldığını gösteren. Radyoetiketli virüslerin sinilasyon sayımı ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dahil olmak üzere bakteri ve virüsler arasındaki etkileşimleri ölçmek için çeşitli teknikler kullanılabilir. Her iki yöntem de laboratuvarda oluşturulması gerekebilir canlı virüs, kullanımını gerektirir. Şu anda, insan norovirüs için mevcut kurulan in vitro kültür sistemlerinin hiçbiri son derece konsantre viral stokların üretimi için izin vermek için yeterince sağlam. Canlı virüs yerine, virüs benzeri parçacıklar (VLPs) norovirüs ve bakteri arasındaki etkileşimleri karakterize etmek için kullanılmıştır. Burada bir akış sitometri yöntemi gram-negatif ve gram-pozitif bakterilere VLP bağlayıcı ölçmek için virüs özgü antikorlar kullanır ile açıklanmıştır. Sadece bakterilerin ve izotip kontrollerinin dahil edilmesi, arka plan antikor bağlanmasını ve TEST EDILEN bakterilere VLP ekinin doğru nicelemeyi azaltmak için tahminin optimizasyonuna izin ver. Yüksek VLP:bakteri oranları VLP'lerin bakteri popülasyonunun büyük yüzdelerine bağlanmasına neden olur. Ancak, VLP miktarları azaldığında, bakterilerin yüzde bağlı da azalır. Sonuç olarak, bu yöntem norovirüs düzenleyen belirli koşulları ve yapısal bileşenleri açıklığa kavuşturan gelecekteki deneylerde kullanılabilir: bakteri etkileşimleri.

Giriş

İnsan norovirüsler (HuNoVs) gastrointestinal hastalığın dünya çapında önde gelen nedeni, 685 milyon enfeksiyonlar ve 200.000 üzerinde ölümher yıl1sorumlu. Diğer enterik virüsler gibi, kommensal bakterilerin varlığı bu patojen enfeksiyonu geliştirmek için gösterilmiştir yanı sıra onun vekil virüs, murine norovirus2,3. Ayrıca bakterilerin insan norovirüs4,5,5,6tarafından enfeksiyonu inhibe edebilir çelişkili raporlar vardır. Çeşitli virüsler için, virüs ve bakteriler arasındaki doğrudan etkileşim viral enfeksiyon etkileyen mekanizmaların altında yatan görünür2,7,8,9,10, ve insan norovirüsler bakterilerin yüzeylerine doğrudan bağlamak elektron mikroskopisi ile gösterilmiştir11,12. Bu nedenle, bu etkileşimleri karakterize hangi bakteri viral enfeksiyon etkisi mekanizmaları belirlemek için kritik hale gelmiştir. Bu karakterizasyon klasik konak mikrobiyombileşenleriolan bakteri türlerinin bir dizi viral bağlayıcı niceleme ile başladı7 ,12,13. Bu eki tahliller sadece bakteri bağlı virüs miktarını ortaya çıkarmak değil, aynı zamanda viral fitness ve hayatta kalma bu etkileşimin etkisini belirlemede yardımcı.

Viral eki ölçmek için, geleneksel olarak kullanılan yöntemler viral genomlar ölçmek PCR tabanlı tahliller içerir12 veya radyoetiketli virüs üretimi ve viral parçacıklar ölçmek için sintillation sayma kullanımı7,8,9,13. Bu yöntemlerin kullanımı genellikle yüksek titer virüs stokları ve bunları oluşturmak için in vitro ekim teknikleri erişim gerektirir. İnsan norovirüs için çeşitli kültür sistemleri şimdi var iken2,14,15, hiçbiri kısıtlar veya pcr ve sintillation kullanımını ortadan kaldırır bu son derece konsantre stokları oluşturmak için gerekli sağlam çoğaltma desteği insan norovirüs / bakteriyel etkileşimleri ölçmek için sayma.

Bu sorunu aşmak için, virüs benzeri parçacıklar (VLPs) insan norovirüs ve bakteri arasındaki etkileşimleri araştırmak için virüs yaşamak için bir vekil olarak kullanılabilir16,17. VLP'ler, türetildiği virüse yakından benzeyen enfeksiyöz olmayan parçacıklardır. İnsan norovirüs durumunda, bu parçacıklar VP1 (ve bazen VP2) protein, kendi kendine genetik malzeme (yani, Noroviruses için RNA) eksik bozulmamış viral kapsidler oluşturmak için monte ifadesi oluşturulur. Bu VLP'ler iyi karakterize edilmiştir, yapısal ve antijektolojik olarak onlar türetilmiştir hangi vahşi tip virüsler benzer18,19,20,21,22,23. Bu nedenle, VLPs insan norovirüs ve kommensal bakteriler arasındaki yüzey etkileşimleri araştırmak için ideal bir vekil olarak hizmet vermektedir. VLP'lerin genetik materyalden yoksun olduğu göz önüne alındığında, PCR tabanlı testler viral bağlanmayı ölçmek için kullanılamaz. Antikor bazlı akış sitometri yöntemi daha önce tanımlanmış ve yarı-nicel bir şekilde bakterilere bağlama VLP bağlama düşük seviyelerde tespit edebiliyoruz16. Bu yöntem, hem gram-negatif hem de gram-pozitif kommensal bakterilere bağlanan insan norovirüs VLP'nin doğru nicelemesi için optimize edilerek optimize edildi16.

Protokol

NOT: Protokolde belirtilen bakteriyel büyüme koşulları Enterobacter cloacae ve Lactobacillus gasseriiçin standart kültür koşullarıdır. Virüsün diğer bakteri türleri ile bakteri eki testi gerçekleştirmek için, seçilen bakteriler bakteri için uygun standart koşullar altında kültürlü olmalıdır.

1. Bakteriyel Büyüme Ortamının Hazırlanması

  1. Enterobacter cloacae büyüme ortamı
    1. 10 g tripton, 5 g maya ekstresi ve 10 g sodyum klorür (NaCl) 1 L'lik de-iyonize (DI) suda eriterek sıvı ortamı hazırlayın (bkz. Malzemeler Tablosu). Tüm ortamları iyice karıştırın ve 30 dakika boyunca otoklavlayarak sterilize edin.
    2. 10 g tripton, 5 g maya özü, 10 g NaCl ve 1L DI suda 15 g agar eriterek katı ortam hazırlayın. Tüm ortamları iyice karıştırın ve 30 dakika boyunca otoklavlayarak sterilize edin.
  2. Lactobacillus gasseri büyüme ortamı
    1. De Man, Rogosa ve Sharpe 55 g eriterek sıvı orta hazırlayın (MRS; Malzeme Tablosubakınız) 1 L DI su tozu. Hazırlıktan sonraki bir ay içinde orta kullanın. Sterilize etmek için, kaynama ya da 15 dk otoklavlama kadar 15 dk için ısı orta.
    2. 55 g MRS tozu ve 1 L DI suda 15 g agar eriterek katı orta hazırlayın. Sterilize etmek için, kaynama ya da 15 dk otoklavlama kadar 15 dk için ısı orta.

2. Optik Yoğunluk (OD) ve Bakteri Konsantrasyonu Ile İlgili Standart Bir Eğri Oluşturulması

  1. Bir agar plaka(E. cloacae)veya doğrudan dondurulmuş gliserol stok(L. gasseri)tek, izole koloni ile uygun sıvı orta 5 mL aşılamak.
  2. Uygun atmosferik koşullar altında, bir gecede bakteri büyümek (Enterobacter cloacae: 37 °C aerobik sallayarak 200 rpm; L. gasseri: Hava geçirmez bir kapta titremeden 37 °C su banyosu).
  3. 2 x 1.3 mL gecelik kültürü iki ayrı 1.5 mL santrifüj tüpüne ve santrifüj bakterisine 10.000 x g 5 dakika aktarın.
  4. Supernatant'ı çıkarın ve 1 mL steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Toplam 2 yıkama için bu yıkama adımını tekrarlayın.
  5. 5 dakika boyunca 10.000 x g'de numuneleri tekrar santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve 1,3 mL steril 1x PBS'de yeniden askıya alın.
  6. Yıkanmış kültürün 0,5 mL ile başlayarak, 10-1 ila 10 -4arasında 1x PBS bakteri seyreltmek.
  7. Bir spektrofotometre kullanarak, yıkanmış, seyreltilmemiş kültürün optik yoğunluğunu ve 600 nm 'deki dört seyreltmenin her birini ölçün (OD600).
  8. Adım 2.6 her seyreltme için 1x PBS 10 kat seri seyreltme gerçekleştirin. Her numunenin mililitre başına koloni oluşturan birim sayısını (CFU/mL) belirlemek için her seri için son 3 seyreltmenin 100°L'sini uygun katı ortama yayın. Plaka her seyreltme triplicate içinde.
  9. Plakaların oda sıcaklığında 5 dk. Uygun atmosferik koşullarda(E. cloacae: aerobik 37 °C, bir gecede inkübül plakaları) ters ve kuluçka yada kurumasını bekleyin; L. gasseri: 37 °C'de anaerobik, hava geçirmez bir kapta 48 saat boyunca anerobik hava poşetleri ile inkübasa plakaları (Bkz. Malzeme Tablosu).).
    NOT: 2,5 L kavanoz başına 1 anaerobik hava poşeti veya 7,0 L kavanoz başına 3 poşet kullanın (bkz. Malzemeler Tablosu).
  10. 5 numunenin her biri için CFU/mL'yi belirlemek için plaka sayılarını kullanın (yani, seyreltilmemiş, 10-1,10-2, 10-3, 10-4). OD600 ile CFU/mL karşılaştırması için standart bir eğri oluşturun. Bu çizginin denklemi VlP-bakteri eki tahlillerinde OD600'edayalı CFU/mL'yi belirlemek için kullanılacaktır.

3. VLP-bakteri Ek Teşp

DİkKAT: İnsan norovirüs VLP'leri biyogüvenlik seviyesidir (BSL)-2 tehlikesi vardır ve VLP'leri içeren tüm çalışmalar bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Ek tetkiklerinden önce bakteri kültürlerinin hazırlanması organizmaya uygun güvenlik koşulları kullanılarak yapılmalıdır.

  1. Reaktif hazırlama
    1. 1x fosfat tamponlu salin (PBS)
      1. 1 L DI suda bir paketin tamamını eriterek 1 L 10x PBS hazırlayın.
      2. 30 dk için otoklav çözeltisi.
      3. Yukarıdaki çözeltiyi 1:10'u DI suyunda seyrelterek 1x çözeltihazırlayın.
      4. Filtre, çözeltiyi 0,22 μm'lik bir filtreden geçirerek sterilize edin ve oda sıcaklığında saklayın.
    2. %5 BSA
      1. %5 (w/v) çözeltisi oluşturmak için 100 mL PBS'ye 5 g büyükbaş serum albumin (BSA) tozu ekleyin.
      2. Çözeltiyi girdap yaparak veya bir karıştırma plakası üzerinde metal bir karıştırma çubuğu kullanarak kümeler eriyene kadar karıştırın.
      3. Filtre 0,22 μm filtre kullanarak sterilize.
      4. Çözeltiyi 4 °C'de saklayın.
    3. Akış sitometri leke tampon (FCSB)
      1. Filtre 0,22 μm filtre ile fcsb satın aldı (Bkz. Malzeme Tablosu).
      2. Kalan çözeltiyi 4 °C'de saklayın.
    4. %5 Engelleme Tamponu (BB)
      NOT: Her seferinde taze hazırlayın.
      1. 10 mL steril FCSB'ye 0,5 g BSA ekleyin.
      2. Girdap tamamen örnek karıştırmak ve kullanıma kadar buz üzerinde bırakın.
  2. Antikor çekimi
    1. Konjuge insan norovirüs GII antikor (Malzeme Tablosubakınız) r-phycoerythrin ile (PE) üreticinin talimatlarına göre bir R-PE antikor etiketleme kiti kullanarak (Malzeme Tablosubakınız).
    2. VLP-bakteri eki tahlil analizinde ileride kullanılmak üzere konjuge antikorları karanlıkta 4 °C'de saklayın.
      NOT: Primer antikor, akış sitometrisi analizi için gerekli konsantrasyonu belirlemek için VLP-bakteri ek tahlillerinde kullanılmadan önce titre edilmelidir. Konjugasyon reaksiyonu her yapıldığında ve ek tahmında kullanılan her bakteri için antikor titrasyonu yapılmalıdır.
  3. Antikor titrasyonu
    1. Konjuge anti-insan norovirüs GII antikor 100 kat seyreltmek, 1:100 bir başlangıç seyreltme ve 1:600 bir bitiş seyreltme (toplam altı seyreltme).
    2. Aşağıdaki istisna dışında açıklandığı gibi bir virüs eki testi yapın: adım 3.5.7% 5 BB 350 μL bakteriyel pelet resuspend.
    3. Örneği yedi 50 μL aliquots'a bölün.
    4. Bir tüpe her antikor seyreltme 50 μL ekleyin.
    5. Lekesiz bir kontrol olarak yedinci tüpe %5 BB 50 μL ekleyin.
    6. Aşağıda açıklandığı gibi tüm örneklerüzerinde akış sitometrisi gerçekleştirin.
    7. Seyreltilmiş antikor örneklerini lekesiz kontrollerle ve birbirleriyle karşılaştırın. Daha sonraki tahlillerde kullanılmak üzere pozitif sinyalin azalmasına veya kaybına yol açan en düşük antikor konsantrasyonu seçilmelidir.
  4. Bakterilerin hazırlanması
    1. Bakteriler sabit fazda olana kadar uygun atmosferik koşullar altında uygun sıvı ortamda 40 mL bakteri büyümek.
      1. 37 °C'de Luria Broth'ta bir gecede Aerobik E. cloacae kültürleri büyümek, sabit fazulaşmak için 200 rpm sallayarak.
      2. Sabit faza ulaşmak için 37 °C'ye kadar 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda sallayarak siyah vidalı kapak tüplerinde MRS suyu yla L. gasseri kültürleri yetiştirin.
    2. Bakterileri peletlemek için 10 dk için 2.288 x g'de 50 mL konik tüpleri ve santrifüj örneklerini temizlemek için sabit faz kültürleri aktarın.
    3. 13 mL steril 1x PBS'de süpernatantı çıkarın ve yeniden askıya alın. Toplam iki yıkama için bu yıkama adımını tekrarlayın.
    4. Numuneleri tekrar santrifüj edin, süpernatant'ı çıkarın ve 1x PBS'nin 20 mL'inde yeniden askıya alın.
      NOT: Hücre peleti küçükse, geri süspansiyon hacmi azaltılabilir.
    5. Kültürün OD600'ü ölçün.
    6. Daha önce hazırlanmış standart eğriyi kullanarak, yıkanan kültürün mL başına CFU'yu belirleyin.
    7. Kültür konsantrasyonu 1 x 108 CFU/mL'ye ayarlamak için bakterileri gerektiği gibi 1x PBS ile seyreltin.
    8. 1 x 108 CFU/mL bakteri kültürünün 1 mL'sini gerekli sayıda 1,5 mL santrifüj tüpe aktarın.
    9. Tüpleri 10.000 x g'de 5 dk santrifüj edin.
    10. Steril 1 mL%5 BSA'da bakteriyel peleti yeniden askıya alın.
    11. Tüpleri 37 °C'de sabit bir dönüşle 1 saat kuluçkaya yatırın.
  5. Virüs eki
    1. Bir BSL-2 biyogüvenlik kabini içinde çalışırken, PBS'de yeniden asılı bakteri içeren her tüpe 10 μg HuNoV VLPs (Bkz. Malzeme Tablosu)ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın.
      NOT: VLP konsantrasyonu her VLP hazırlığıile farklılık gösterir. Bu nedenle, bakterilere eklenen hacim hazırlama gruplar arasında değişir ve deneydeki her tüpe 10°G eklenecek şekilde buna göre ayarlanmalıdır. Bakteriler in yalnızca kontrolleri için (örneğin, VLP içermeyen numuneler), deneysel numunelere eklenen VLP hacmine eşit bir PBS hacmi ekleyin.
    2. 37 °C'de 1 saat boyunca sürekli dönüşlü tüplerin kuluçkaya yatırın.
      NOT: Kuluçka sırasında 40 rpm'ye ayarlanmış bir tüp tabancası (bkz. Malzemeler Tablosu)kullanılır.
    3. Kuluçkadan sonra numuneleri 10.000 x g'de 5 dk santrifüj edin.
    4. Supernatant atın ve PBS 1 mL bakteriyel pelet resuspend.
    5. Yıkama adımlarını 3.5.3 ve 3.5.4 olarak tekrarlayın.
    6. 5 dakika için 10.000 x g de santrifüj örnekleri.
    7. Supernatant atın ve% 5 BB 150 μL bakteriyel pelet resuspend.
  6. Antikor boyama
    1. Taze %5 BB hazırlayın.
      NOT: Floresan etiketli antikor kullanılarak yapılan tüm çalışmalar karanlıkta yapılmalı ve antikor, BB ve FCSB buzüzerinde tutulmalıdır.
    2. Seyreltilmiş insan norovirüs GII antikor 1:125 E. cloacae örnekleri için ve 1:150 L. gasseri örnekleri için 5% BB, numune başına seyreltilmiş antikor 50 μL hazırlanması.
    3. İzotip antikoru, insan norovirüs GII antikorunun her bakteri için %5 BB oranında seyreltilmiş olması gibi seyreltin ve numune başına 50 μL seyreltilmiş isotip kontrolü hazırlanın.
    4. Her ek test numunesini 3,3.7 adımdan temiz 1,5 mL santrifüj tüplere aktararak üç 50°L'lik aliquots'a bölün.
    5. İlk örnek kümesine 50°L BB ekleyin. Bu küme lekesiz (Uns) denetimleri olacaktır.
    6. İkinci sete, GII antikor seyreltme 50 μL ekleyin. Bu e. cloacae için 1:250 ve L. gasseriiçin 1:300 son antikor konsantrasyonu ile sonuçlanır. Bu örnek kümesi lekeli (AB) numuneler olacaktır.
    7. Üçüncü sete seyreltilmiş isotip antikordan 50 μL ekleyin. Bu küme, İzotip denetimleri (IC) olacaktır. Pipetleme ile iyice karıştırın. 30 dakika boyunca buz ve karanlıkta örnekleri kuluçka.
    8. 5 dk için 10.000 x g tüm örnekleri santrifüj.
    9. Supernatant'ı atın ve 100 μL FCSB'de numuneleri yeniden askıya alın.
    10. Tüm numuneleri 10.000 x g'de 5 dk. Süpernatant'ı atın ve 100 μL FCSB'de numuneleri yeniden askıya alın.
    11. 5 dk için 10.000 x g tüm örnekleri santrifüj.
    12. Supernatant'ı atın ve 150 μL FCSB'de numuneleri yeniden askıya alın.
    13. Her numuneyi toplam 550 μL hacim için 400 μL FCSB tampon içeren bir FCSB tüpüne aktarın.
    14. Numuneleri akış sitometrisi tarafından analiz edilene kadar 4 °C'de tutun.
      NOT: Akış sitometrisi antikor boyama 4 saat içinde yapılır.

4. Akış Sitometri

NOT: Aşağıda açıklanan gerilim ayarları, Malzeme Tablosu'nda listelenen akış sitometresine ve yazılıma dayanmaktadır ve büyük olasılıkla farklı akış sitometrelerine göre değişiklik gösterir. Ayarlar her bakteri için optimize edilmelidir. Tüm grafikler için eksenlerin biexponential fazda olduğundan emin olun.

  1. Çalışma alanını ayarlama
    NOT: Çalışma alanını oluşturmak için kullanılan çizimleriçin kurulum, gating ve veri analizinde kullanılanlardan farklıdır. Çalışma alanını ayarlamanın amacı hücre popülasyonunu görselleştirmek, akış analizini etkileyebilecek bakteri hücrelerinin aşırı kümelenmesini sağlamak ve veriler toplanırken lekeli ve lekesiz hücreleri ayırt etmektir.
    1. Bakterilerin bir araya kümelenmediğinden emin olmak için bir dizi yoğunluk alanı ayarlayın.
      1. Toplam popülasyonu görselleştirmek için bir ileri dağılım alanı (FSC-A) ve yan dağılım alanı (SSC-A) oluşturun.
      2. Hem ileri (FSC-W) hem de yan dağılım genişliğini (SSC-W) ile iletme (FSC-H) ve yan dağılım yüksekliği (SSC-H) ile karşılaştıran iki grafik oluşturarak tek hücre ve hücre kümelerini değerlendirmek için çizimler ayarlayın.
      3. Yalnızca PE pozitif popülasyonu (PE-A vs. SSC-A) gösteren bir çizim oluşturun.
    2. Temel gerilimi E. cloacae için 500'e, L. gasseriiçin 340'a ayarlayın. Bunlar daha sonra düzeltilecektir.
    3. Sayılan toplam olayları 10.000 olaya ayarlayın.
  2. Örnekleri çalıştırma
    1. SSC-A, FSC-A veya PE-A'ya karşı çizilmiş sayıyı gösteren üç ayrı histogram çizimi oluşturun.
    2. Akış sitometresine lekesiz bir örnek yerleştirin ve SSC-A için histogramdaki maksimum tepenin 102 ila 103'te, FSC-A histogramındaki maksimum tepenin ise x ekseninde 104 ila 105 arasında olmasını sağlayarak örnek olaylarını elde edin. Değilse, zirveler belirtilen aralıklara düşmez, FSC ve SSC gerilimlerini buna göre ayarlayın.
    3. Akış sitometresine lekeli bir örnek (AB) yerleştirin ve x ekseninde maksimum tepe noktası olan 103'ü geçmek için PE gerilimini ayarlayın.
    4. Bu ölçümlere dayanarak, pozitif PE kapısını ayarlayın ve geçidi PE-A ile SSC-A yoğunluk grafiğine ayarlayın.
    5. Tüm örnekleri belirlenen ayarların altında düşük veya orta hızda çalıştırın.

Sonuçlar

Kommensal bakterilere bağlanan insan norovirüs VLP'yi ölçmek için kullanılan gating stratejileri Şekil 1'degösterilmiştir. Temsili yoğunluk nokta, hücresel enkaz ve hücre kümelerini ortadan kaldırmak için numunelerin nasıl geçitlendiğine genel bir bakış sağlar, böylece VLP eki tekli popülasyonlarda belirlenir(Şekil 1A). Temsili histogramlar, sadece norovirüs VLP'si olmayan bakterilerde d?...

Tartışmalar

Enterik virüslerin bakterilere bağlanmasını ölçebilme yeteneği, bu bakterilerin viral enfeksiyonu değiştirme mekanizmalarını açıklamak için kritik bir ilk adımdır. Burada açıklanan yöntemler hem E. cloacae (gram-negatif bakteri) hem de L. gasseri (gram-pozitif bakteri) ile insan norovirüs VLP etkileşimlerini ölçmek için optimize edilmiştir, ancak herhangi bir memeli virüsü ve ilgi bakterisi ile kullanılmak üzere uyarlanabilir. VLPs ek tahlill...

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yok.

Teşekkürler

Sutonuka Bhar ve Chanel Mosby-Haundrup'a yazılı el yazmasının eleştirel incelemesi için teşekkür etmek istiyoruz, ayrıca Alfonso Carrillo'ya bakteriyel standart eğriler üretme konusunda yardımcı olmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün (R21AI140012) bir hibesi ve Florida Üniversitesi, Gıda ve Tarım Bilimleri Enstitüsü'nden bir tohum hibesi ile finanse edilmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer CapCorning352235After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis.
AgarSigmaA7002Used for media preparation
AnaeroPackThermo ScientificR681001Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa flow cytometer
Bovine Serum AlbuminFisher BioreagentsBP1605Used for flow cytometry
Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB)BD Biosciences554657Used for flow cytometry
Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscienceThermo Fisher Scientific12473281Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer.
MRS PowderBD Biosciences288130Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri.
Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D)Thermo Fisher ScientificMA5-18241Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher.
Norovirus GII.4 VLPCreative BiostructureCBS-V700human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays.
PBS 10XFisher BioreagentsBP665Dilute to 1X prior to use.
SiteClick R-PE Antibody Labeling KitThermo Fisher ScientificS10467Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody.
Sodium ChlorideFisher ScientificS271Used for media preparation
TryptoneOxoidLP0042Used for media preparation
Tube RevolverThermoFisher Scientific88881001Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm).
Yeast ExtractBD Biosciences212750Used for media preparation

Referanslar

  1. Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
  2. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  3. Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
  4. Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
  5. Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
  6. Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
  7. Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
  8. Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
  9. Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
  10. Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
  11. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  12. Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
  13. Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
  14. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  15. Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
  16. Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
  17. Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
  18. Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
  19. Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
  20. Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
  21. Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
  22. Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), 287-290 (1999).
  23. Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
  24. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
  25. Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 158nsan norovir senterik vir s bakteriyel etkile imlerkommensal bakterilerinsan norovir s nicelle tirmeinsan norovir s tespitivir s bakteri eki

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır