从福尔马林固定石蜡包埋的人动脉粥样硬化病变中优化高质量 DNA 提取

摘要

在这里，我们提出了一种从人颈动脉的福尔马林固定石蜡包埋病变中提取半自动 DNA 的方案。组织裂解在没有有毒二甲苯的情况下进行，然后进行自动化 DNA 提取方案，包括第二个裂解步骤、DNA 与顺磁性颗粒结合以进行基于纤维素的结合、洗涤步骤和 DNA 洗脱。

摘要

福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织是分子分析和临床基因组研究的宝贵来源。这些组织通常细胞不足或难以处理。因此，需要仔细分离核酸。近年来，已经为许多疾病（主要是癌症）的组织建立了各种 DNA 分离方法。不幸的是，由于核酸链和蛋白质之间的交联以及序列的随机断裂，从 FFPE 组织中提取的基因组 DNA 会高度降解。因此，这些样品的 DNA 质量显著降低，成为进一步分子下游分析的挑战。困难组织的其他问题是，例如，钙化的人类动脉粥样硬化病变和脂肪组织中缺乏细胞，皮肤活检小，因此所需核酸的可用性低，就像在旧组织或固定组织中一样。

在我们的实验室中，我们建立了一种使用半自动分离系统从福尔马林固定的动脉粥样硬化病变中提取 DNA 的方法。我们将该方法与其他市售提取方案进行了比较，并专注于进一步的下游分析。通过光谱法和荧光法测量 DNA 的纯度和浓度。评估了碎片化程度和整体质量。

使用用于自动提取系统的改良血液 DNA 方案，而不是市售 FFPE 方案，获得最高的 DNA 数量和质量。通过这种循序渐进的方案，FFPE 样品的 DNA 产量平均高出四倍，并且提取过程中未通过的样本更少，这在处理小血管活检时至关重要。PCR 可检测 200–800 bp 的扩增子大小。这项研究表明，尽管从我们的 FFPE 组织中获得的 DNA 高度片段化，但它仍然可以用于成功扩增和测序较短的产物。总之，在我们手中，自动化技术似乎是 DNA 提取的最佳系统，尤其是对于小 FFPE 组织标本。

引言

福尔马林固定后石蜡包埋 （FFPE） 是在生物样本库中长期保存病理标本的标准程序¹。这些样本为组织学研究和分子分析，尤其是遗传学研究² 提供了有价值的来源。FFPE 组织的其他优点是更好的长期储存、更低的成本和更容易的储存条件。我们的目的是提供一种可靠且易于使用的方案，用于从少量 FFPE 切片中分离可重现的核酸，因为高质量的 DNA 提取是各种分子技术中的第一个关键步骤，而 FFPE 组织是最可用的样品来源。

新的科学方法，如下一代测序 （NGS） 和“组学”研究方法，需要高质量的核酸 ^3,4,5。从 FFPE 组织样本中提取 DNA 仍然是一项具有挑战性的工作。来自 FFPE 样品的 DNA 在质量和数量上可能会有很大差异，具体取决于其年龄和固定条件。福尔马林是最常用的化合物，可导致 DNA-蛋白质交联 ^6,7,8 并导致核苷酸序列出现非特异性随机断裂⁹。这可能会显著影响下游基因组分析，因为交联会禁用聚合酶链反应 （PCR） 扩增 ^6,10。由于固定过程中的污染物，从 FFPE 样品中分离的 DNA 纯度通常有限。近年来，建立了各种 DNA 分离方法，主要来自癌症组织标本 2,11,12,13。

一般来说，从 FFPE 组织中提取核酸的方案可以分为三大类。第一组最常用的方法包括市售的硅胶基色谱柱系统¹⁴。第二组涉及使用苯酚和氯仿的手动有机相萃取方法，最初由 Joseph Sambrook 和 David W. Russell^描述15。作为第三组，自动化系统在过去几年中建立起来，例如液体处理系统以及基于顺磁性粒子的系统¹⁶。这三个系统中的每一种都有不同的优点和缺点，例如危险化学品（即二甲苯、苯酚、氯仿）、成本高¹⁷、人力¹⁸ 和时间消耗¹⁹。特别是，对于困难的组织标本以及高通量分析，标准化、可重复性、相对较低的时间消耗、人力和成本是寻找合适的核酸分离方法的最相关特征²⁰。众所周知，自动提取方法显示出更好的可重复性结果，并且对小活检更敏感。此外，需要的组织或血液量更少，并且由于大量石蜡而导致系统堵塞的风险降低。尽管与手动方法相比，用于自动核酸提取的机器和所需的试剂盒更昂贵，但由于提取过程问题较少，它们仍然令人信服。文献检索提供了许多出版物，这些出版物说明了从不同组织和生物体（如植物、动物和人类以及培养物中的细胞）中提取手动、基于柱和自动的 DNA 和 RNA 提取方法之间的直接比较 20,21,22。文献中也有证据表明，从 10 年生的快速冷冻组织中分离的 DNA 和 RNA 可用于下游分析，例如 PCR、定量 PCR、NGS、甲基化分析和克隆 9,23,24,25,26。

例如，老化的人体血管组织以及小组织活检，尤其是关于 FFPE 样本的问题，是高度钙化的动脉粥样硬化病变中缺乏细胞，从而导致核酸浓度低¹。尽管已经建立了几种从 FFPE 组织中提取 DNA 的方法并得到广泛应用，但手动样品制备方法需要较长的手动作时间²⁷ ，并且脱蜡需要二甲苯或苯酚等有毒试剂²。如前所述，脱蜡过程是一个关键的耗时步骤（例如，大约 30 分钟），会显著影响提取的 DNA 的质量和数量（例如，对 DNA 的毒性作用，例如脱蜡溶液的片段化和降解以及高温）²⁸。最近开发的新 DNA 提取方案侧重于使用其他无毒脱蜡溶液、修复策略和自动微珠技术。特别是，自动和半自动方法已被证明在 DNA 提取中是成功的，具有高效回收、无交叉污染和易于执行的特点²⁹。我们已经建立了克服这些限制的协议。因此，我们的技术可以在最高的定量和定性标准下减少加工和手动作时间。

特别是对于可重现的高通量分析，如基因分型、表观基因组研究和 RNA 测序，使用基于柱的纯化系统处理 FFPE 样本通常既困难又耗时（例如，脱蜡步骤长、柱堵塞和手动作时间长）。由于大量石蜡而导致二氧化硅膜堵塞是主要问题。其他可能使高质量核酸分离恶化的情况是少量组织，例如皮肤的显微活检、小小鼠组织、非常脂肪或钙化的组织（如斑块）、骨化组织和老化样品。特别是在诊断和法医学方面，自动化和半自动化系统（如液体处理或基于顺磁性颗粒的提取方法）在过去几年中变得越来越重要^30,31，这主要是由于相对较少的手动作时间和标准化的可能性。大多数已经发布的方案都非常适合具有大量或中等细胞的光滑组织，例如肿瘤活检或植物组织 13,22,32。关于基于半自动颗粒的方法的文献，用于从相对难以处理的组织（如固定的单细胞、钙化血管、富含胶原蛋白的组织和细胞数量少的脂肪组织）中分离 DNA，但描述很少³³。

在本研究中，描述了一种从血管石蜡包埋切片中分离 DNA 的优化半自动方法，并将其与两种基于柱的手动方案进行了比较。DNA 数量、纯度和片段化程度用于验证。以市售的血液 DNA 方案为起点，随后结合 FFPE 和组织方案的步骤，针对 FFPE 以及来自人类和动物组织的新鲜冷冻组织样本的使用进行了优化半自动系统的手动步骤。该方案的自动化步骤预装在仪器上，具体取决于使用的试剂盒（此处为血液 DNA 试剂盒）。使用所描述的基于半自动卡盒的系统，可以使用相同的方案、机器、试剂盒和耗材从血液、新鲜冷冻组织、福尔马林固定组织甚至单细胞中分离 DNA，而不是按照公司的建议为仪器使用不同的方案和试剂盒。实验步骤中只有细微的差异，例如一种缓冲液和不同应用的一些孵育时间，这使得该实验步骤对于从各种组织中提取 DNA 非常有用。我们的方案主要针对钙化、细胞贫乏和纤维化的人体血管组织进行了优化，但当然也可以针对上述各种困难组织使用和进一步优化。

总而言之，对于心血管领域研究动脉粥样硬化（例如主动脉、颈动脉、冠状动脉）的研究人员，我们提供了一种易于使用的点对点方案，用于从血管 FFPE 样本中半自动提取 DNA。

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研究方案

当地医院伦理委员会（2799/10， Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München， Munich， Germany）批准了在我们的生物样本库中收集人颈动脉粥样硬化标本的许可。获得所有患者的书面知情同意书。实验是根据赫尔辛基宣言的原则进行的。

1. 组织制备

1. 使用切片机从 FFPE 样品中制备 5-8 个 10 μm 的组织切片，并将其转移到 1.5 mL 试管中。没有必要减少块中过量的石蜡。
   注：较薄的单个切片而不是一个大切片会加速缓冲液反应。由于 O₂ 暴露，丢弃第一部分。对于较大的样品，也可以使用更少的部分。
2. 将这些试管在台式离心机中离心，在室温下设置为 5,000 x g 1 分钟，以收集试管底部的每个样品。
   注意：离心时间过长会导致样品凝结并使裂解复杂化。

2. 脂质溶解和脱蜡

注：此步骤是脱蜡和脂质消化所必需的。使用的缓冲液比市售脱蜡溶液毒性小。

1. 向每个试管中加入 300 μL 市售孵育缓冲液和 6 μL 1-硫代甘油。
   注：请勿使用超过 300 μL，因为这是自动化系统小柱的最大体积。
2. 涡旋 10 秒，并将样品在 80 °C 和 500 rpm 下在加热块中孵育 10 分钟以溶解石蜡。
   注意：组织最后应完全溶解。如有必要，在孵育过程中涡旋数次。

3. 样品和蛋白质消解

注：用蛋白酶 K 进行天然消化对于获得不含蛋白质的干净 DNA 提取物至关重要。它还可以减少存在的任何污染蛋白质。此外，核酸酶也被破坏以保存 DNA³⁴。完全样品消解也需要这个过夜步骤。

1. 让样品冷却至 60 °C，然后加入 30 μL 提供的蛋白酶 K 溶液。
2. 再次涡旋并将混合物在 65 °C 和 500 rpm 下在加热块中孵育过夜（4-20 小时）。在孵育过程中不时涡旋样品以完全消化样品。
   注意：过夜孵育可获得更好的结果。建议每 30-60 分钟混合一次。最后，管内不应有任何视觉组织块。

4. 细胞裂解

1. 加入 400 μL 血液试剂盒中提供的裂解缓冲液，并很快涡旋。
2. 将样品在 65 °C 下以 500 rpm 再次孵育 30 分钟。
3. 让样品冷却至室温。石蜡会在顶部硬化。
   注意：不要再次涡旋，以保持石蜡与样品分离。否则，石蜡会与组织混合，从而破坏样品。样品将在步骤 6.1 中收集。

5. 预分配墨盒的准备

1. 打开本机以及相关的平板电脑。
2. 启动软件应用程序，然后单击 Door 按钮打开仪器。
3. 从仪器上取下支架，将预装的柱插入探针架。确保墨盒在就位时发出两次咔嗒声，然后取下密封膜。
4. 将柱塞添加到小柱的最后 （8） 个孔中。它用作仪器中的移液器吸头。
5. 用试剂盒提供的 65 μL 洗脱缓冲液填充提供的 0.5 mL 洗脱管。保持试管打开状态，并将其插入管架前部、卡式瓶之后的专用位置。
   注：洗脱的最小体积为 60 μL。系统将损失 5–10 μL 增加的洗脱体积。

6. 自动 DNA 提取

1. 从步骤 4.3 开始，小心地刺穿 1.5 mL 试管顶部的石蜡，以触及试管底部的干净样品，不要再次将其与石蜡混合。
2. 将制备样品的整个混合物 （730 μL） 转移到小柱的第一个孔中。
3. 将架子插入自动 DNA 提取机中。确保机架先锁定在机器的后部，然后再锁定在前部。
4. 单击软件中橙色 的 Start 开始 按钮开始运行。将打开一个包含不同预安装协议的窗口。在仪器上选择 Blood DNA protocol（血液 DNA 实验方案 ）。单击软件中的 Yes（是），确认已添加柱塞、洗脱管和样品。仪器门将自动关闭，运行开始（指示灯将变为绿色）。运行大约需要 38 分钟。无需进一步校准。
   注：观察直至系统拾取样品架中所有样品的柱塞。如果没有发生这种情况，系统将自动停止，并且必须重新启动机器协议。
5. 确保系统在小柱的第一个孔中执行自动裂解步骤，然后在 3 至 7 孔中执行洗涤步骤。无需进一步的编程步骤。完整的程序由公司预装。
6. 完成后，确保系统通过添加的柱塞洗脱准备好的洗脱管中的 DNA。磁性颗粒留在柱塞中。末端的柱塞回到卡式瓶的最后一个孔中。

7. 完成运行

1. 运行完成后（机器显示绿色闪烁的指示灯），点击打开仪器的按钮（门牌）打开仪器，然后从系统中取下机架。
2. 丢弃磁带。
3. 将空架子重新插入仪器，然后通过右上角的门按钮关闭门。关闭软件应用程序并关闭机器以及平板电脑。
4. 洗脱液可在 -20 °C 下长期储存，或在 4 °C 下短期储存，或直接用于下游分析或浓度测量。

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结果

为了建立该方案，使用了来自颈动脉动脉粥样硬化患者的 5 个 FFPE 组织块。使用优化的半自动方案（试剂盒 C）以及两种市售的基于色谱柱的手动方案（试剂盒 A 和试剂盒 B，参见 材料表）分离 DNA。根据制造商的方案使用试剂盒 A 和 B 进行 DNA 提取。两种市售试剂盒（试剂盒 A 和试剂盒 B）的方案中所做的唯一更改：由于切片周围有大量石蜡，开始时的脱蜡进...

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讨论

FFPE 组织的 DNA 提取方法在分离 DNA 的质量和数量上各不相同，这不可避免地会影响进一步下游分析的性能。因此，自动化对于改进工作流程和标准化以及质量管理变得势在必行。因此，在本研究中，评估了一种从 FFPE 样品中提取 DNA 的半自动方法，证明其结果优于其他测试的手动柱式方案。

为了优化所描述的半自动方法，我们的目标是为每种组织和?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tubes for sample incubation	Eppendorf, Hamburg, Germany	30120086
1-Thioglycerol	Promega, Walldorf, Germany	A208
Agilent tape station software 3.2	Agilent, Waldbronn, Germany
dsDNA HS Kit	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q32851
FFPE DNA Purification Kits (Kit A)	Norgene Biotek, Heidelberg, Germany	47400
FFPE tissue samples n=5	Munich Vascular Biobank,Munich, Germany
GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B)	Qiagen, Hilden, Germany	180134
Heating blocks, set to 80°C and 65°C	VWR,Darmstadt,Germany	460-0250
High Sensitivity D5000 reagents	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5593
High Sensitivity D5000 ScreenTape	Agilent, Waldbronn, Germany	5067-5592
Incubation Buffer	Promega, Walldorf, Germany	D920
Maxwell Blood Kit RSC including: Lysis Buffer, Elution Buffer, Proteinase K	Promega, Walldorf, Germany	AS1400
Maxwell RSC 48 Instrument	Promega, Walldorf, Germany	AS8500
Microcentrifuge	Eppendorf, Hamburg, Germany
NanoDrop 2000c Spectrometer	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	ND-2000C
Optical caps	Agilent, Waldbronn, Germany	401425
Optical tube strips	Agilent, Waldbronn, Germany	401428
Pipettors and pipette tips	Eppendorf, Hamburg, Germany
Prism 6 for statistics, version 6.01	GraphPad Inc., San Diego, California
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific, Schwerte, Germany	Q33216
TapeStation 4200	Agilent, Waldbronn, Germany
Tecan Infinite M200 Pro	Tecan, Männedorf, Swizerland	IN-MNANO